Mit dieser Methode können die therapeutischen Wirkungen von NIR-PIT auf thorakale Tumoren in einem klinisch relevanten Tumormodell bewertet werden. Die NIR-PIT-Verfahren mit dem pleuraseminierten Krebsmodell sind leicht zu verstehen und durchzuführen. Um ein Mausverbreitungsmodell einzurichten, verwenden Sie Polystyrolschaum, um einen Stopfen herzustellen, und desinfizieren Sie ihn mit 70% Ethanol.
Befestigen Sie die Nadel am Stopfen, wobei die Spitze fünf Millimeter aus dem Stopfen herausragt. Biegen Sie die Spitze einer 30-Gauge-Nadel mit einer sauberen Zette oder gegen einen harten Gegenstand, der mit 70% Ethanol gereinigt wurde, und füllen Sie eine Spritze mit einmal 10 zu den sechs Zieltumorzellen in 100 Mikroliter PBS. Bestätigen Sie eine mangelnde Reaktion auf pedalreflex bei einer betäubten, 19 bis 21 Gramm alten, acht bis 12 Wochen alten, weiblichen, homozygoten, athymischen Nacktmaus.
Führen Sie die Nadel durch den Interkostalraum in die Brust ein und bewegen Sie die Nadel nach oben und unten, um eine Berührung der Rippen zu vermeiden. Wenn die Spitze den Interkostalraum passiert hat, positionieren Sie die Spritze so, dass sie gegen die Maus gedrückt wird, und injizieren Sie das gesamte Volumen der Zielzellen. Nach der Injektion rollen Sie die Maus zwei- bis dreimal, um die Zellen in der Gesamten Brusthöhle zu verteilen, und bringen Sie die Maus mit Überwachung bis zur vollständigen Genesung in ihren Käfig zurück.
24 Stunden nach der Zellinjektion und jeden Tag danach injizieren Sie den anästhesierten Tumorzell-injizierten Mäusen 200 Mikroliter von 15 Milligramm pro Milliliter D-Luciferin. Setzen Sie die Mäuse nach 10 Minuten in einen Biolumineszenz-Imager und öffnen Sie das Acquisition Control Panel in der Imager-Software. Wählen Sie Luminescent, Photograph und Overlay aus.
Stellen Sie die Belichtungszeit auf Auto, die Binning auf Small, die Leuchte auf eins für Luminescent und auf acht für Photograph und das Sichtfeld auf C.Click Acquire ein, um die Biolumineszenz abbilden. Legen Sie das Anzeigeformat auf Bogenmaß fest, und wählen Sie den Kreis aus den Werkzeugbereichswerkzeugen im Werkzeugpalettenbedienfeld aus. Klicken Sie auf Relevante Bereiche messen, um die Biolumineszenzintensität der Oberfläche zu messen, und wählen Sie mit "Messung konfigurieren" die für das Experiment relevanten Werte aus.
Exportieren Sie diese Datentabelle als CSV-Datei. Verwenden Sie dann die Gesamtflusswerte für die Quantifizierung der biolumineszierenden Intensität in der Datei. Bevor Sie eine Nahinfrarot-Phototherapie der tumorinjizierten Mäuse durchführen, verwenden Sie ein Leistungsmessgerät, um die Lichtdosis eines 690-Nanometer-Wellenlängenlasers zu messen und die Leistung auf 100 Milliwatt pro Quadratzentimeter einzustellen.
24 Stunden vor der Behandlung wurden intravenös 100 Mikrogramm Antikörper-Photosensibilisator-Konjugat in 50 bis 200 Mikroliter PBS über die Schwanzvene des tumorinjizierenden Tieres injiziert. Legen Sie am Tag der Phototherapie-Behandlung die anästhesierte konjugierte, tumorbeladene Maus in Rückenlage und schirmen Sie die Nicht-Zielstellen mit Aluminiumfolie ab. Wenn alle Schilde platziert sind, verwenden Sie einen 100-Joule-pro-Quadratzentimeter-Laser, um die Brusthöhle für etwa 30 Sekunden mit Nahinfrarotlicht zu bestrahlen.
Wenn die Bestrahlung abgeschlossen ist und die Maus aufgewacht ist, bringen Sie das Tier in seinen Käfig zurück und messen Sie die Biolumineszenz täglich, wie gezeigt. In dieser repräsentativen Analyse wurde die Konjugation des Anti-Podoplanin-Antikörpers mit IR700 durch SDS-PAGE-Analyse bestätigt. Nach der Injektion von Tumorzellen sollten Biolumineszenzbildgebung und diffuse Lumineszenzbildtomographie durchgeführt werden, um festzustellen, welche Mäuse ausreichende Luciferase-Aktivität in der Brusthöhle für weitere Studien exprimieren.
Am fünften Tag nach der Injektion zeigen Anti-Podoplanin-Antikörper IR700-injizierte Mäuse eine hohe IR700-Fluoreszenz- und Luciferase-Aktivität in thorakalen Tumoren, was darauf hindeutet, dass intravenös injizierte IR700-konjugierte Antikörper disseminierte Pleuratumorstellen erreichen. Insbesondere pleural disseminierte Mäuse, die mit einer Nahinfrarot-Photoimmuntherapie behandelt wurden, zeigen eine verminderte Luciferase-Aktivität, während die relativen Lichteinheiten in der Kontrollgruppe eine allmähliche Zunahme der Intensität aufweisen. Da die erforderliche NIR-Bestrahlungsenergie von der Zelllinie und den Antikörpern abhängt, sollten Sie die Bedingungen im Voraus in vitro überprüfen.
