Este método pode ser usado para avaliar os efeitos terapêuticos do NIR-PIT em tumores torácicos em um modelo tumoral clinicamente relevante. Os procedimentos NIR-PIT utilizando o modelo de câncer disseminado pleural são fáceis de entender e realizar. Para configurar um modelo de disseminação do mouse, use espuma de poliestireno para fazer uma rolha e desinfete-a com 70% de etanol.
Coloque a agulha na rolha com a ponta estendendo cinco milímetros para fora da rolha. Dobre a ponta de uma agulha de calibre 30 com fórceps limpos ou contra um objeto duro limpo com 70% de etanol, e encha uma seringa com uma vez 10 para as seis células tumorais alvo em 100 microlitres de PBS. Confirme a falta de resposta ao reflexo do pedal em um anestinado, de 19 a 21 gramas, de oito a 12 semanas de idade, feminino, homozigote, rato nude atímico.
Insira a agulha no peito através do espaço intercostal, movendo a agulha para cima e para baixo para evitar entrar em contato com as costelas. Quando a ponta tiver passado pelo espaço intercostal, posicione a seringa para que ela seja pressionada contra o mouse e injete todo o volume de células-alvo. Após a injeção, role o mouse duas a três vezes para espalhar as células por toda a cavidade torácica, e devolva o rato à sua gaiola com monitoramento até a recuperação completa.
24 horas após a injeção celular e todos os dias depois, injete os camundongos injetados por células tumorais anestesiadas com 200 microlitres de 15 miligramas por mililitro de D-luciferina. Após 10 minutos, coloque os ratos em um imager de bioluminescência e abra o Painel de Controle de Aquisição no software imager. Selecione Luminescent, Photograph e Overlay.
Defina o Tempo de Exposição para Auto, o Binning para Small, o F/Stop para um para Luminescent e para oito para Photograph, e o Field of View to C.Click Acquire para imagem da bioluminescência. Defina o formato de exibição para radians e selecione o círculo das ferramentas regionais de interesse no painel Paleta de ferramentas. Clique em Medir Regiões de Interesse para medir a intensidade bioluminescente da superfície e use Configurar medição para selecionar os valores relevantes para o experimento.
Exporte esta tabela de dados como um arquivo csv. Em seguida, use os valores totais de fluxo para a quantificação da intensidade bioluminescente no arquivo. Antes de realizar fototerapia quase infravermelha dos camundongos injetados pelo tumor, use um medidor de energia para medir a dose leve de um laser de comprimento de onda de 690 nanômetros e ajustar a saída para 100 miliwatts por centímetro quadrado.
24 horas antes do tratamento, injetou por via intravenosa 100 microgramas de fotoensitizer de anticorpos conjugados em 50 a 200 microlitres de PBS através da veia traseira do animal injetado pelo tumor. No dia do tratamento de fototerapia, coloque o camundongo anestinado injetável, carregado de tumor, na posição supina, e proteja os locais não alvo com papel alumínio. Quando todos os escudos forem colocados, use um laser de 100 joules por centímetro quadrado para irradiar a cavidade torácica com luz quase infravermelha por cerca de 30 segundos.
Quando a irradiação estiver completa e o rato acordar, devolva o animal para sua gaiola, e meça a bioluminescência diariamente como demonstrado. Nesta análise representativa, a conjugação de anticorpo anti-podoplanina com IR700 foi confirmada pela análise SDS-PAGE. Após a injeção de células tumorais, a imagem de bioluminescência e a tomografia de imagem de luminescência difusa devem ser realizadas para determinar quais camundongos expressam atividade de luciferase suficiente na cavidade torácica para estudos posteriores.
No quinto dia após a injeção, o anticorpo anti-podoplanina IR700-injected ratos demonstram alta fluorescência IR700 e atividade luciferase em tumores torácicos, indicando que anticorpos conjugados ir700 injetados por via intravenosa atingem locais de tumor pleural disseminados. Notavelmente, camundongos disseminados pleural tratados com fotoimuneterapia quase infravermelha demonstram uma atividade de luciferase reduzida, enquanto as unidades de luz relativa no grupo controle apresentam um aumento gradual da intensidade. Uma vez que a energia de irradiação NIR necessária depende da linha celular e anticorpos, certifique-se de verificar as condições com antecedência in vitro.
