Dieses Protokoll wurde entwickelt, um eine robuste Methode zur Messung der gesamten mitochondrialen und peroxisomalen Fettsäure-Beta-Oxidation in primären Maus-Hepatozyten bereitzustellen. Die Verwendung intakter Zellen erhält die Integrität der Organellen und die vorhandenen Regulationsmechanismen. Darüber hinaus minimiert die Untersuchung frisch isolierter Hepatozyten Veränderungen in der Genexpression in Bezug auf die Ursprungsleber.
Die Operation kann eine Herausforderung sein. Du musst selbstbewusst, fleißig und konzentriert sein. Sobald die Kanülierung erfolgreich ist, versuchen Sie sich zu entspannen, aber achten Sie darauf und überwachen Sie die Qualität der Perfusion.
Um das Verfahren zu beginnen, besprühen Sie den Bauch und die Brust der betäubten Maus großzügig mit 70% Ethanol. Verwenden Sie dann die Pinzette, um die Haut und die Bauchdecke in der Nähe der Bauchbasis hochzuziehen und seitlich auf beiden Seiten der Mittellinie und bis zum Zwerchfell zu schneiden, um die Organe freizulegen. Legen Sie die untere Hohlvene oder IVC frei, indem Sie den Darm auf die rechte Seite bewegen und die Leberlappen vorsichtig nach oben drehen.
Führen Sie einen kleinen zylindrischen Gegenstand, z. B. eine Nadelkappe, unter den Rücken der Maus ein, um den IVC leicht zu neigen und die Kanülierung zu erleichtern. Nachdem Sie die Pumpe mit Puffer eins bei der niedrigsten Drehzahl gestartet haben, führen Sie die Nadel in den IVC ein. Schneiden Sie dann die Pfortader ab, um den Druck zu verringern und die Drainage von Blut und Perfusionspuffern zu ermöglichen.
Vor der Erhöhung der Durchflussrate auf sieben ml pro Minute. Durchbluten Sie die Leber mit warmem Puffer eins und stellen Sie sicher, dass die in das Röhrchen, das Puffer eins enthält, eingeführte Leitung kontinuierlich untergetaucht bleibt, um die Einführung von Luftblasen zu vermeiden. Während die Perfusion stattfindet, fügen Sie 130 Mikroliter Kollagenaselösung hinzu, um zwei zu puffern, und mischen Sie durch Pipettieren mit einer serologischen Pipette.
Wenn das Volumen in dem Röhrchen, das Puffer eins enthält, auf etwa fünf ml abnimmt, fügen Sie langsam fünf ml Puffer zwei hinzu, um einen durch Pipettieren an der Seite des Rohres zu puffern. Wiederholen Sie den Zusatz zweimal, bevor Sie den verbleibenden Puffer zwei in die Röhre geben. Stoppen Sie die Perfusion, wenn etwa 5 bis 10 ml Puffer zwei in der Röhre verbleiben.
Dann entfernen Sie die Leber und geben Sie sie in die 100-ml-Kulturschale, die 20 ml eiskalten Puffer zwei enthält. Unter der laminaren Durchflusshaube wird das Lebergewebe mit chirurgischer Schere und Pinzette vorsichtig auseinander gebrochen. Als nächstes fügen Sie etwa 20 ml eiskalten M199-Puffer zur Hepatozytensuspension hinzu und filtern Sie sie durch ein 100-Mikron-Zellsieb mit dem Kolben einer Spritze, um die Freisetzung zusätzlicher Hepatozyten aus den größeren Leberstücken sanft zu fördern.
Waschen Sie die 100-ml-Kulturschale und das Zellsieb mit M199-Puffer, um die Zellsuspension zu sammeln, bis das Auffangrohr voll ist. Dann zentrigieren Sie die Suspension bei 50 x g für zwei Minuten bei vier Grad Celsius. Saugen Sie den Überstand ab, bevor Sie das Hepatozytenpellet in 30 ml kaltem M199 durch Wirbeln wieder suspendieren.
Wiederholen Sie die Wäsche einmal. Tauen Sie die Palmitinsäure- und Rinderserumalbumin- oder BSA-Lösungen auf, bevor Sie die Substratmischung für mehrere Reaktionen vorbereiten. Aliquot 13,5 Mikroliter BSA-Lösung pro Reaktion in einem Mikrozentrifugenröhrchen.
Nachdem Sie das Röhrchen auf 41 Grad Celsius erwärmt haben, fügen Sie einen Mikroliter der 200 mM Palmitinsäurelösung pro Reaktion hinzu. Wirbeln Sie die Röhre vor und während der Inkubation bei 41 Grad Celsius für 20 bis 30 Minuten kräftig auf, um die Bildung des löslichen Palmitinsäure-BSA-Komplexes zu erleichtern. Während dieser Zeit werden 133 Mikroliter 1 M Perchlorsäure aliquot, die verwendet werden, um die Reaktionen in separaten 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen zu stoppen.
Vor Beginn der Reaktionen aliquotieren und inkubieren 485,5 Mikroliter M199-Puffer pro Reaktion in ein Röhrchen bei 37 Grad Celsius, um den hergestellten radioaktiven BSA-Palmitinsäure-Komplex zu verdünnen. Als nächstes geben Sie 750 Mikroliter M199 mit oder ohne Inhibitoren in den separaten 14-ml-Rundbodenröhrchen als Proben ab. Während der Hepatozytenwaschschritte, 10 bis 15 Minuten vor Beginn der Reaktionen, geben Sie die Röhrchen in ein Schüttelwasserbad, das auf 37 Grad Celsius bei 180 bis 200 Umdrehungen pro Minute eingestellt ist.
Wenn die Lebensfähigkeit der Hepatozyten mindestens 75% beträgt, ist die Herstellung der Substratmischung abgeschlossen, indem 0,8 Mikroliter Kohlenstoff-14-Palmitinsäure pro Reaktion auf das Mikrozentrifugenröhrchen mit der geklärten BSA-Palmitinsäurelösung übertragen werden. Vortex, bevor die Röhre bei 41 Grad Celsius in das Wasserbad zurückgebracht wird. Unmittelbar nach der endgültigen Hepatozytenresuspension, 750 Mikroliter der Hepatozytenssuspension mit einer Ein-ml-Pipette auf jedes der 14-ml-Rundbodenrohre im Schüttelwasserbad übertragen und die Röhrchen kurz mit niedriger Geschwindigkeit umdrehen, bevor sie in einen Inkubator überführt werden, wobei jede Zugabe um 30 Sekunden gestaffelt wird.
Übertragen Sie ein separates Aliquot von Hepatozyten auf ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, um es fünf Minuten lang bei 3000 x g zu drehen. Entfernen Sie den Überstand, bevor Sie das Pellet bei minus 80 Grad Celsius lagern, um die Gesamtmenge an Protein in der Probe zu messen, um die Ergebnisse zu normalisieren. Während sich die Hepatozyten bei 37 Grad Celsius unter Vorinkubation befinden, fügen Sie den radioaktiven BSA-Palmitinsäure-Komplex in das warme Medium hinzu, um bei 37 Grad Celsius zu bleiben, bis Sie bereit sind, die Reaktionen zu starten.
Um die Reaktionen zu starten, entfernen Sie die Hepatozyten aus dem Wasserbad und fügen Sie 500 Mikroliter der Substratmischung zu den Hepatozyten hinzu. Wirbeln Sie die Zellen fünf Sekunden lang mit niedriger Geschwindigkeit auf, bevor Sie zum Wasserbad zurückkehren, um 15 Minuten lang zu inkubieren. Starten Sie eine Reihe von Reaktionen und stoppen Sie sofort, um die Hintergrundradioaktivität zu bestimmen.
Übertragen und reservieren Sie die doppelten Aliquots von 200 bis 250 Mikrolitern der übrig gebliebenen Substratmischung in 6-ml-Szintillationsfläschchen, um die Zählung durchzuführen. Um die Reaktionen zu stoppen, entfernen Sie die Hepatozyten aus dem Wasserbad, um sie durch Vortexen mit moderater Geschwindigkeit zu resuspendieren, und übertragen Sie dann 400 Mikroliter der Hepatozytenssuspension auf die Mikrozentrifugenröhrchen, die Perchlorsäure enthalten. Verschließen und wirbeln Sie sofort die Röhrchen, bevor Sie die Sequenz für alle Proben wiederholen und um 30 Sekunden taumeln.
Nachdem Sie die 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen bei 13.000 x g für 10 Minuten gedreht haben, übertragen Sie 300 Mikroliter des Überstands auf eine 6-ml-Szintillationsdurchstechflasche und fügen Sie 4 ml der Szintillationsflüssigkeit hinzu, um die Radioaktivität in den Proben und die Substratmischung Aliquots in einem Szintillationszähler zu zählen. In der Studie ergab die Leberdurchblutung 30 bis 40 Millionen Zellen pro Leber, mit einer durchschnittlichen Lebensfähigkeit von 80%Es wurde auch beobachtet, dass eine Senkung der Glukosekonzentration in der Fastengruppe keinen negativen Einfluss auf die Ausbeute oder Lebensfähigkeit der Hepatozyten hatte. Die Hepatozytensuspension, die aus gefütterten und gefasteten männlichen Mäusen isoliert wurde, wurde auf die Betaoxidationskapazität von Fettsäuren in Gegenwart und Abwesenheit von Etomoxir, einem starken Inhibitor von CPT1 und mitochondrialer Fettsäureoxidation, untersucht.
Die Zählungen pro Minute oder CPM, die mit der Hintergrundradioaktivität verbunden sind, variieren mit der Charge von Palmitinsäure. Der CPM war jedoch immer noch deutlich niedriger als die mit der Substratmischung inkubierten Proben. Die aus den nüchternen Mäusen isolierten Hepatozyten zeigen einen robusten Anstieg der Raten sowohl der mitochondrialen als auch der peroxisomalen Fettsäure-Beta-Oxidation.
Die Daten wurden weiter untersucht, um die Rate zu bestimmen, mit der Palmitinsäure in den Hepatozyten, die aus den gefütterten und gefasteten Mäusen isoliert wurden, oxidiert wird. Verhindern Sie, dass Blasen in die Linie gelangen. Halten Sie die Nadel während der Perfusion konstant.
Seien Sie vorsichtig beim Umgang mit den Hepatozyten. Halten Sie sie in der Schwebe, wenn Sie sie abgeben. Die aus diesem Verfahren isolierten Hepatozyten können als Suspension verwendet werden, um andere Stoffwechselwege wie die Fettsäuresynthese zu untersuchen, oder sie können für Zellkulturexperimente plattiert werden.
