Dieses Protokoll erleichtert die Isolierung und reproduzierbare Langzeitkultur von Maushepatozyten in einer 3D-Kollagen-Sandwich-Umgebung, um die kanonische Strukturbildung und ihre Reaktion auf die Behandlung in vitro zu untersuchen. Sobald die Technik gemeistert wurde, ist es eine schnelle Methode, um große Mengen hochlebensfähiger und reiner Maushepatozytenpopulation für In-vitro-Studien zu erhalten. Demonstriert wird das Verfahren von Lenka Sarnova, einer Technikerin aus unserem Labor.
Am Tag vor der primären Hepatozytenisolierung 100 Mikroliter 10X DMEM, 485 Mikroliter destilliertes Wasser und 15 Mikroliter eines Molaren-Natriumhydroxids in 500 Mikrolitern zu Rattenschwanzkollagen hinzufügen. Überprüfen Sie den pH-Wert des neutralisierten Kollagens. Es sollte etwa 7,5 sein.
Mit einer vorgekühlten 200-Mikroliter-Pipettenspitze 100 Mikroliter der neutralisierten Kollagenlösung über jedes Kulturgeschirr mit 3,5 Zentimeter Durchmesser aus Kunststoff auf Eis verteilen und die Gerichte über Nacht unter Standardkulturbedingungen platzieren. Am nächsten Morgen rehydrieren Sie die Kollagenschichten mit einem Milliliter 37 Grad Celsius PBS pro Schale für mindestens drei Stunden bei 37 Grad Celsius. Um die Leber zu isolieren, nach der Bestätigung eines Mangels an Reaktion auf Zehenkneifung, legen Sie die anästhesierte Maus auf eine Seziermatte in der Rückenposition und band die unteren und oberen Extremitäten auf die Matte.
Den Bauch mit 70% Ethanol abwischen und einen V-förmigen Schnitt aus dem Schambereich zu jedem Vorderglied machen. Falten Sie die Haut über die Brust, um die Bauchhöhle zu entdecken und legen Sie die Matte unter ein sezierendes Mikroskop. Bewegen Sie den Dünndarm und den Dickdarm in die kaudale Richtung, um das IVC freizulegen, und laden Sie eine Zwei-Milliliter-Spritze mit 2,5 Milliliter 37-Grad-Celsius-Lösung C. Verbinden Sie die Spritze mit der Kanüle und verwenden Sie einen PBS-getränkten Wattestäbchen, um die Leber bis zum Zwerchfell zu drücken.
Legen Sie eine durchnässte Naht um die IVC direkt unter der Leber. Dann mit einer Insulinspritze mit einer 30-Meter-Nadel, die auf einen 45-Grad-Winkel gebogen ist, 10 Mikroliter 5.000 Einheiten pro Milliliter Heparin in die Portalvene injizieren. Um die Leber zu kanülieren, verwenden Sie mikrochirurgische Schere, um einen kleinen Schnitt in der IVC direkt neben der Leber zu machen und setzen Sie die Kanüle in den Schnitt.
Sichern Sie die Kanüle an Ort und Stelle mit Nähten und zwei chirurgischen Knoten und schneiden Sie die Portalvene, damit die Perfusionspuffer aus der Leber fließen können. Dann drücken Sie den Spritzenkolben langsam, um die Leber über einen Zeitraum von etwa 15 Sekunden mit zwei Millilitern der Lösung zu durchdringen. Wenn die gesamte Lösung geliefert wurde, füllen Sie eine Peristaltikpumpe mit frischer 37-Grad-Celsius-Lösung C vor und überprüfen Sie das Perfusionsgerät, um sicherzustellen, dass sich keine Luftblasen im System befinden.
Trennen Sie die Kanüle vorsichtig von der Spritze und schließen Sie die Schläuche der laufenden Peristaltikpumpe schnell, aber sorgfältig an die Kanüle an. Beginnen Sie die Perfusion sofort mit einem Durchfluss von 2,5 Millilitern pro Minute. Wechseln Sie nach zwei Minuten zu Lösung D und setzen Sie die Perfusion für weitere 10 Minuten fort.
Am Ende der Perfusion, ernten Sie die Leber sorgfältig in eine 50 Milliliter konische Röhre mit 20 Milliliter 37 Grad Celsius Lösung E.To isolieren die primären Hepatozyten, halten die Leber durch die Kanüle, reiben Sie das Gewebe um die Wand der Röhre, um die Hepatozyten in den Puffer zu klopfen. Wenn das gesamte Gewebe zerkleinert ist, übertragen Sie die Gewebeschlämme in ein 70 Mikrometer Poren-Nylon-Sieb, um die isolierten Zellen in ein neues 50-Milliliter-Rohr zu filtern. Sedimentieren Sie die Leberzellen durch Zentrifugation und setzen Sie das Pellet in 20 Milliliter n.B. 40%Percoll in DMEM wieder auf.
Trennen Sie die lebenden und abgestorbenen Zellen durch Zentrifugation und setzen Sie das Pellet in 20 Milliliter lösung E.Nach der zentrifugieren den Zellen wieder aus, setzen Sie das Pellet in 10 Milliliter frischer Lösung E zum Zählen wieder auf. Nach dem Zählen, passen Sie die primäre Hepatozytenzahl auf 3,75 mal 10 auf die fünf lebensfähigen Zellen pro Milliliter Hepatozytenkulturmedium. Um die isolierten primären Hepatozyten in 3D-Kollagen-Sandwiches zu kultitogen, verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Pipette, um zwei Milliliter Zellen gleichmäßig auf jede kollagenbeschichtete Schale mit 3,5 Zentimeter Durchmesser zu verteilen.
Platzieren Sie die Zellen drei Stunden lang im Zellkultur-Inkubator. Während der Inkubation 100 Mikroliter neutralisiertes Rattenschwanzkollagen pro Schale vorbereiten, wie gezeigt. Am Ende der Inkubation die mittleren und nicht angeschlossenen Zellen sorgfältig durch 100 Mikroliter neutralisiertes Kollagen pro Schale ersetzen und die Platten für eine Stunde an den Zellkultur-Inkubator zurückgeben.
Wenn das Kollagen verfestigt ist, fügen Sie vorsichtig zwei Milliliter frisches Hepatozytenkulturmedium zu jedem Gericht hinzu und bringen Sie die Kulturen für drei bis acht Tage in den Brutkasten zurück, um die Kulturen täglich unter dem Mikroskop zu überprüfen. Für die Immunkennzeichnung der primären Hepatozyten innerhalb der 3D-Kollagen-Sandwiches, waschen Sie jedes Sandwich sorgfältig mit 37 Grad Celsius PBS und fixieren Sie die Kulturen mit einem Milliliter 4%Paraformaldehyd in PBS pro Schale für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Am Ende der Fixierung, waschen Sie das Geschirr dreimal für 10 Minuten in zwei Milliliter PBS ergänzt mit 0,1%Tween 20 pro Wäsche.
Nach der letzten Wäsche die Zellen mit einem Milliliter 0,1 Molarenglycin und 0,2%Triton X-100 in PBS für eine Stunde bei Raumtemperatur permeabilisieren, gefolgt von drei Waschungen in PBS plus Tween 20, wie gerade gezeigt. Als nächstes verwenden Sie eine 10-Mikroliter-Lastspitze, die mit einem Vakuum verbunden ist, um die obere Kollagenschicht sanft zu stören und jede unspezifische Bindung mit einem Milliliter 5%Rinderserumalbumin in PBS Tween für zwei Stunden zu blockieren. Am Ende der Inkubation, fügen Sie die primären Antikörper von Interesse in Blockierlösung zu jeder Schale verdünnt und inkubieren über Nacht bei 37 Grad Celsius.
Am nächsten Morgen waschen Sie das Geschirr mit drei 15-minütigen Wäschen in PBS Tween, gefolgt von der Etikettierung mit den entsprechenden Sekundärantikörpern bei 37 Grad Celsius für fünf Stunden. Waschen Sie die Kulturen am Ende der Inkubation zweimal mit PBS Tween und einmal mit destilliertem Wasser, wie vor der Montage der Schale mit Anti-Fade-Montagemedium für die Mikroskopie demonstriert. Innerhalb eines Tages in 3D-Kollagen-Sandwiches, Maus primäre Hepatozyten gebildet Cluster und selbst organisiert in einem ungefähr regelmäßigen Netzwerk von Galle Canaliculi.
Innerhalb von drei bis sechs Tagen werden Cluster von fünf bis zehn Zellen in der Regel mit vollständig polarisierten Hepatozyten beobachtet, die ein kanalikuläres Netzwerk bilden. Die Behandlung mit Toxin- oder Zytoskelett-verändernden Medikamenten führt zu Veränderungen im Hepatozyten-Zytoskelett und der Galle Canaliculi-Breite, -Form und -Zahl. Obwohl die Ethanolbehandlung nur eine leichte Wirkung auf die Organisation von Keratin 8 aufweist, erhöht sie die Tortuosität und Verteilung der Gallekanalbreiten.
Die Signalintensität der ZO-1-Färbung wird in ethanolbehandelten Gallenkanaliculi im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen verringert, die auf einen Verlust von Typ-Kreuzungen nach der Ethanolbehandlung hindeuten. Die Hemmung der Actomyosin-Kontraktilität mit Blebbistatin induziert die Bildung von ungeordnet geformten, dicken, abgerundeten Galle Canaliculi. Darüber hinaus hemmt die Behandlung mit Okadainsäure Phosphatasen, die die physikalischen Eigenschaften von Keratinen stark beeinflussen und zu Gallenkanaliculi führen, die im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen signifikant verengt werden.
Darüber hinaus erhöht die Ethanolbehandlung signifikant die Konzentrationen von Alanin- und Aspartat-Aminotransferasen, die auf eine schwere hepatozelluläre Verletzung hindeuten, während die Behandlung von Blebbistatin nicht zu Überlegungen veränderungen im Transaminasespiegel führt und die Behandlung von Okadainsäure milde biochemische Veränderungen in der Alanin-Aminotransferase auslöst, aber keine Veränderung der Aspartat-Aminotransferase-Expression. Es ist wichtig, während der Cannulation und zu Beginn der Perfusion relativ schnell zu arbeiten und zu vermeiden, dass Blasen in das Perfusionssystem gelangen. Zelllysate können in doppelten Brunnen für Proteine von Interesse gesammelt werden, um festzustellen, ob Veränderungen in der Proteinexpression und/oder Aktivierungsstadien während der Behandlung auftreten.
