Diese Arbeit wurde zum Teil von der National Natural Science Foundation of China (81970265, 81900281,81700288), der China Postdoctoral Science Foundation (2019M651904) finanziert. und das National Key Research and Development Program of China (2016YFC1101001, 2017YFC1308105).

Informationen zu kommerziellen Reagenzien und Instrumenten sind in der Tabelle der Materialienaufgeführt.
Die AC16 humane Kardiomyozyten-Zelllinie wurde aus der Fusion von Primärzellen aus adultem ventrikulärem Herzgewebe mit SV40-transformierten menschlichen Fibroblasten17abgeleitet, die von BLUEFBIO (Shanghai, China) gekauft wurden. Die Zelllinie entwickelt viele biochemische und morphologische Merkmale, die für Kardiomyozyten charakteristisch sind. Darüber hinaus ist die Zelllinie weit verbreitet verwendet, um Myokardschäden und Myokardfunktion in vitro18,19zu bewerten.
1. Zellkultur
HINWEIS: Das Basalkulturmedium besteht aus dem serumfreien Dulbecco-modifizierten Eagle-Medium (DMEM), 10% fetalem Rinderserum (FBS), 1% Herzmyozytenwachstumsergänzung und 1% Penicillin/Streptomycin-Lösung. Das Medium bei 4 °C aufbewahren und vor Gebrauch auf 37 °C vorwärmen.
<ol><li>Entfernen Sie die kryokonservierten menschlichen Kardiomyozytenzellen (HCM) aus flüssigem Stickstoff und tauen Sie sie in einem Wasserbad bei 37 °C auf.</li>
	<li>Die Durchstechflasche (<1 Minute) in einem 37 °C-Wasserbad vorsichtig schütteln, bis nur noch ein kleines Stück Eis in der Durchstechflasche verbleibt.</li>
	<li>Die Durchstechflasche in eine sterile laminare Durchflusshaube übertragen. Wischen Sie die Außenseite der Durchstechflasche mit einer In 70% Alkohol getauchten Wattekugel ab.</li>
	<li>Transfer 4 ml vorgewärmtes komplettes Wachstumsmedium tropfenweise in das Zentrifugenrohr, das die aufgetauten Zellen enthält.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 200 × g für 10 Minuten. Nach der Zentrifugation den Überstand entsorgen und das Pellet in 5 ml komplettem Medium wieder aufhängen.</li>
	<li>Bewahren Sie die Zellen bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator unter einer Atmosphäre mit 95% Luft und 5%CO2auf. HINWEIS: Vor der Ernte der Zellen für Experimente dürfen die Zellen wachsen, bis sie etwa 60-70% Konfluenz erreichen.</li>
</ol>2. Erstellung eines Sauerstoff-Glukose-Entzugsmodells (OGD)
HINWEIS: Ersetzen Sie zwei Stunden vor der Studienzeit das Wachstumsmedium durch ein serumfreies Medium, und die Zellen wurden in einem befeuchteten Inkubator für 2 h bei 37 °C unter einer Atmosphäre mit 5%CO2wieder inkubiert.
<ol><li>Das Medium von einer 6-Well-Platte absaugen und die Zellen dreimal mit Phosphatgepufferter Kochsaline (PBS) vorsichtig waschen.</li>
	<li>Fügen Sie 2 ml frisches zuckerfreies DMEM pro Brunnen hinzu.</li>
	<li>Kultur die Zellen bei konstanter Temperatur in einem Drei-Gas-Inkubator unter einer Atmosphäre mit einem Gemisch von 95%N2,5%CO2und 0,1%O2 bei 37 °C für 1, 2, 4, 8, 12 oder 16 h.</li>
	<li>Nach der Hypoxie-Behandlung das Medium von der 6-Well-Platte ansaugen und die Zellen dreimal mit PBS (pH 7.4) waschen.</li>
	<li>Fügen Sie 2 ml komplette DMEM pro Brunnen hinzu.</li>
	<li>Bewahren Sie die Zellen bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator unter einer Atmosphäre mit 95% Luft und 5%CO2auf.</li>
</ol>3. Zeit-Temperatur-Protokoll
HINWEIS: Ein Standard-Zeittemperaturprotokoll wird während der Herzchirurgie verwendet, wie zuvor von anderen20,21beschrieben. Behandeln Sie HCMs nach dem folgenden Protokoll (Abbildung 1): Der Zeitpunkt 1 (T1) gibt das Ende der Induktion an, der Zeitpunkt 2 (T2) gibt das Ende der Wartung an und der Zeitpunkt 3 (T3) gibt das Ende der Rewarminganuktion an. Analysieren Sie Kontrollzellen, die unter kontinuierlichen normothermischen Bedingungen (37 °C) gehalten werden. Die Temperaturbedingungen werden mit einem Tri-Gas-Inkubator erzeugt, der eine präzise Temperaturregelung ermöglicht.
<ol><li>Zwei Stunden vor den Experimenten das Kulturmedium von einer 6-Well-Platte ansaugen und 2 ml frisches serumfreies DMEM pro Brunnen hinzufügen.</li>
	<li>Die Zellen in einem befeuchteten Inkubator für 2 h bei 37 °C unter einer Atmosphäre mit 5%CO2wieder inkubieren.</li>
	<li>Nach 2 h das Medium von der 6-Well-Platte absaugen und die Zellen dreimal mit PBS (pH 7.4) waschen.</li>
	<li>Fügen Sie 2 ml frisches serumfreies DMEM pro Brunnen hinzu.</li>
	<li>Reinkubieren Sie die Zellen im Trigas-Inkubator. HINWEIS: Ersetzen Sie das Medium, um nicht angeschlossene Zellen und Schmutz zu entfernen.</li>
	<li>Ändern Sie sofort die Temperatur, indem Sie die Kulturgerichte einen Tri-Gas-Inkubator platzieren.</li>
	<li>Nach 1 h Abkühlung das Medium schnell von der 6-Well-Platte absaugen und 2 ml frisches, zuckerfreies DMEM pro Brunnen hinzufügen.</li>
	<li>Kultur die Zellen in einem Tri-Gas-Inkubator unter einer Atmosphäre, die 95%N2, 5%CO2und 0,1%O2 bei 37 °C für 12 h zur Etablierung von Hypoxie.</li>
	<li>Stellen Sie die Temperatur wie unten beschrieben ein. HINWEIS: Das Protokoll beginnt mit 10 h einer Niedertemperaturbehandlung, gefolgt von einer Aufwärmphase für 2 h bis 37 °C und 24 h Normothermie (37 °C). Zu jedem Zeitpunkt werden drei Petrischalen zur Analyse entfernt.</li>
	<li>Nach der Niedertemperaturbehandlung das Medium von der 6-Well-Platte absaugen und dreimal mit PBS (pH 7.4) waschen.</li>
	<li>Fügen Sie 2 ml komplette DMEM pro Brunnen hinzu.</li>
	<li>Bewahren Sie die Zellen bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator unter einer Atmosphäre mit 95% Luft und 5%CO2auf.</li>
</ol>4. CCK-8-Fähigkeitstest
<ol><li>Die 0,25% Trypsin-Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)-Lösung und PBS vor der Anwendung auf 37 °C erwärmen.</li>
	<li>Saugen Sie das Medium, spülen Sie die Zellen mit 1 ml PBS und fügen Sie dann 0,5 ml von 0,25% Trypsin entlang der Wand des Brunnens hinzu. Bei 37 °C inkubieren, bis fast alle HCMs abgelöst sind (ca. 1 min).</li>
	<li>Fügen Sie 1 ml DMEM-Gesamtmedium in die Brunnen ein, um das Trypsin zu neutralisieren.</li>
	<li>Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15 ml Zentrifugenrohr und pellet die HCMs durch Zentrifugation bei 500 × g für 3 min. Aspirieren Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören.</li>
	<li>Geben Sie 100 L Aliquots der Zellsuspension (5000 Zellen/Well) in eine 96-Well-Platte. Die Platte für 24 h in einem befeuchteten Inkubator (bei 37 °C) vorinkubieren</li>
	<li>Verwenden Sie die kultivierten Zellen in den 96-Well-Platten, um verschiedene Behandlungsgruppen zu erzeugen.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Platte für eine angemessene Zeitdauer (16 h) in einem Inkubator.</li>
	<li>Fügen Sie jeder Bohrung der Platte 10 L CCK-8-Lösung hinzu.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Platte für 1 Stunde im Inkubator.</li>
	<li>Messen Sie die Absorption bei 450 nm mit einem Mikroplattenleser. VORSICHT: Achten Sie darauf, keine Blasen in die Brunnen einzuführen, da sie die OD-Messwerte stören.</li>
</ol>5. Durchflusszytometrie zur Apoptoseanalyse
<ol><li>Führen Sie Trypsinisierungs- und Zentrifugationsschritte durch, indem Sie die Schritte 4.2-4.4 befolgen. HINWEIS: Zellen werden mit Trypsin ohne EDTA geerntet. Um die Apoptose zu bewerten, werden sowohl schwimmende als auch anhimante Zellen gesammelt.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Zellen für 5 min bei 1000 × g. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 1 ml PBS wieder auf.</li>
	<li>Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer. Übertragen Sie mit einer Pipette 100 l Trypan Blue-treated Cell Suspension auf ein Hämozytometer. Zählen Sie mit einem Handzähler die lebenden, ungefärbten Zellen in einem Satz von 16 Quadraten und verwenden Sie dann PBS, um eine Zellsuspension bei 1×107 Zellen/ml zu erzeugen.</li>
	<li>Erhalten Sie 200 l der Zellsuspension (5 × 105 -1 × 106 Zellen).</li>
	<li>Zentrifuge für 5 min bei 1000 × g und das Pellet in der Annexin V-FITC-Bindungslösung wieder aufsetzen.</li>
	<li>Fügen Sie 5 L Von Annexin V-FITC hinzu, um die Zellen zu färben.</li>
	<li>Fügen Sie der Zellsuspension 10 L Propidiumjodid hinzu.</li>
	<li>Mischen Sie die Zellen vorsichtig und bebrüten Sie sie 20 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln. HINWEIS: Die Zellen werden während der Inkubation 2-3 Mal resuspendiert, um die Färbung zu verbessern.</li>
	<li>Starten Sie das Durchflusszytometer, und stellen Sie sicher, dass die Software ordnungsgemäß funktioniert.</li>
	<li>Öffnen Sie zwei Punktdiagrammfenster in der Flow-Zytometrie-Software.</li>
	<li>Wählen Sie Vorwärtsstreulicht (FSC) auf der X-Achse und seitengestreutes Licht (SSC) auf der Y-Achse aus, um Zellablagerungen bzw. Klumpen hinsichtlich ihrer Größe bzw. Granularität auszuschließen.</li>
	<li>Wählen Sie den PE (590 mm) Detektionskanal und FITC (530 mm), der verwendet wird, um die Fluoreszenzintensität der Zellen zu messen.</li>
	<li>Legen Sie das leere (HCMs, die nicht gefärbt wurden) Probenrohr auf das Durchflusszytometer.</li>
	<li>Klicken Sie auf Aufzeichnen, um Partikel aus der Suspension im leeren Probenrohr zu sammeln, und dann die Zellpopulation zur weiteren Analyse im ersten Punktdiagramm zu beaufnehmen.</li>
	<li>Legen Sie die eingefärbten Proben auf den Rohrträgerarm. Klicken Sie auf Aufzeichnen, um Partikel aus der Suspension zu sammeln, und dann die Zellpopulation zur weiteren Analyse im ersten Punktdiagramm zu beorchen.</li>
	<li>Sammeln Sie die HCMs in anderen Probenröhren und optimieren Sie die Messung, indem Sie die Spannungen der Fluoreszenzkanäle anpassen. HINWEIS: Ungefärbte und eingefärbte Proben werden während des Experiments als Kompensationskontrollen verwendet.</li>
	<li>Zeigen Sie die Statistiken der einzelnen Probenröhrchen an und berechnen Sie die Apoptoserate jeder Probe.</li>
</ol>6. Mitochondriale Depolarisationsbewertung
<ol><li>Führen Sie Trypsinisierung und Zentrifugation durch die folgenden Schritte 4.2-4.4 durch.</li>
	<li>Setzen Sie die Zellen in 500 l des gesamten Mediums wieder auf, und passen Sie dann die Zelldichte an 1 × 105 - 6 × 106 Zellen an</li>
	<li>Fügen Sie 0,5 ml JC-1 Arbeitslösung zu jedem Rohr hinzu.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Zellen in einem Zellinkubator bei 37 °C für 20 Minuten. HINWEIS: Während der Inkubationszeit 1 ml 5× JC-1 Färbepuffer zu 4 ml destilliertem Wasser hinzufügen, um den JC-1-Färbepuffer vorzubereiten.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Zellen nach der Inkubation bei 600 × g für 3 min bei 4 °C.</li>
	<li>Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 1 ml JC-1-Färbepuffer wieder auf.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 6.5 bis 6.6 dreimal.</li>
	<li>Setzen Sie die HCMs in 1 ml eiskalten Färbepuffer in einem 1,5 ml Zentrifugenrohr aus und verwenden Sie die Zellen für die Analyse innerhalb von 30 min.</li>
	<li>Wählen Sie den PE (590 nm) Detektionskanal und FITC (530 nm) aus, um die Fluoreszenzintensität des JC-1-Farbstoffs in den Zellen zu messen. HINWEIS: Richten Sie das Durchflusszytometer mit den folgenden Schritten 5.10-5.17 ein.</li>
</ol>7. Reaktive Sauerstoffspezies Assay
<ol><li>Führen Sie Trypsinisierung und Zentrifugation durch die folgenden Schritte 4.2-4.4 durch.</li>
	<li>Stainieren Sie die Zellen im Kulturmedium mit 10 M DCFDA und passen Sie die Zelldichte auf 1 × 106 - 1 × 107 Zellen an</li>
	<li>30 Minuten bei 37 °C inkubieren.</li>
	<li>Pipette die Zellen alle 3-5 min nach oben/unten.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen nach der Inkubation dreimal mit serumfreiem Zellkulturmedium.</li>
	<li>Analysieren Sie die Zellen auf einem Durchflusszytometer, indem Sie die Schritte 5.10-5.17 ausführen. HINWEIS: DCF wird bei 488 nm angeregt und die Emissionsintensität bei 530 nm gemessen.</li>
</ol>8. Messung von Caspase 3/ Caspase 8 Aktivität
<ol><li>Führen Sie die Trypsinisierung durch die folgenden Schritte 4.2-4.4 aus.</li>
	<li>Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 600 × g bei 4 °C für 5 Minuten.</li>
	<li>Fügen Sie 100 l Lysatpuffer pro 2 × 106 Zellen hinzu.</li>
	<li>Lyse die Zellen für 15 Minuten auf Eis.</li>
	<li>Nach 15 min Inkubation in einem Eisbad zentrieren Sie die Probe bei 1,6 × 104 x g bei 4 °C 15 Minuten lang.</li>
	<li>Übertragen Sie den Überstand zur Verwendung in ein eiskaltes Zentrifugenrohr. HINWEIS: Die Proteinkonzentration in der Probe sollte mindestens 1-3 mg/ml betragen.</li>
	<li>Entfernen Sie Ac-DEVD-pNA (2 mM) und legen Sie es auf ein Eisbad für den Einsatz.</li>
	<li>Fügen Sie der enzymbeschriftten Platte eine Pufferlösung von 40 l genau hinzu, fügen Sie 80 l der Probe hinzu und fügen Sie schließlich 10 l Ac-DEVD-pNA (2 mM) hinzu.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Probe bei 37 °C für 120 Minuten.</li>
	<li>Gemessen den A405-Wert auf einem Mikroplattenleser gemäß den Anweisungen des Herstellers. HINWEIS: Die von der pNA erzeugte Absorption wird durch Subtraktion des A405-Wertes des Rohlingssteuerelements von dem der Probe berechnet.</li>
</ol>

<ol>
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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothermia+protects+H9c2+cardiomyocytes+from+H2O2+induced+apoptosis.">Hypothermia protects H9c2 cardiomyocytes from H2O2 induced apoptosis.</a> Cryobiology. 62 (1), 53-61 (2011).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIF-1alpha/BNIP3+signaling+pathway-induced-autophagy+plays+protective+role+during+myocardial+ischemia-reperfusion+injury.">HIF-1alpha/BNIP3 signaling pathway-induced-autophagy plays protective role during myocardial ischemia-reperfusion injury.</a> BIOMEDICINE &amp; PHARMACOTHERAPY. 120, 109464 (2019).</li><li>An, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exogenous+IL-19+attenuates+acute+ischaemic+injury+and+improves+survival+in+male+mice+with+myocardial+infarction.">Exogenous IL-19 attenuates acute ischaemic injury and improves survival in male mice with myocardial infarction.</a> BRITISH JOURNAL OF PHARMACOLOGY. 176 (5), 699-710 (2019).</li><li>Han, Y. S., Schaible, N., Tveita, T., Sieck, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discontinued+stimulation+of+cardiomyocytes+provides+protection+against+hypothermia-rewarming-induced+disruption+of+excitation-contraction+coupling.">Discontinued stimulation of cardiomyocytes provides protection against hypothermia-rewarming-induced disruption of excitation-contraction coupling.</a> EXPERIMENTAL PHYSIOLOGY. 103 (6), 819-826 (2018).</li><li>Yarbrough, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase+inhibition+attenuates+contractile+dysfunction+following+cardioplegic+arrest+and+rewarming+in+the+setting+of+left+ventricular+failure.">Caspase inhibition attenuates contractile dysfunction following cardioplegic arrest and rewarming in the setting of left ventricular failure.</a> Journal of cardiovascular pharmacology. 44 (6), 645-650 (2004).</li><li>Egorov, Y. V., Glukhov, A. V., Efimov, I. R., Rosenshtraukh, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothermia-induced+spatially+discordant+action+potential+duration+alternans+and+arrhythmogenesis+in+nonhibernating+versus+hibernating+mammals.">Hypothermia-induced spatially discordant action potential duration alternans and arrhythmogenesis in nonhibernating versus hibernating mammals.</a> AMERICAN JOURNAL OF PHYSIOLOGY-HEART AND CIRCULATORY PHYSIOLOGY. 303 (8), 1035-1046 (2012).</li><li>Bobi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderate+Hypothermia+Modifies+Coronary+Hemodynamics+and+Endothelium-Dependent+Vasodilation+in+a+Porcine+Model+of+Temperature+Management.">Moderate Hypothermia Modifies Coronary Hemodynamics and Endothelium-Dependent Vasodilation in a Porcine Model of Temperature Management.</a> Journal of the American Heart Association. 9 (3), 014035 (2020).</li><li>Dietrichs, E. S., Tveita, T., Myles, R., Smith, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+ECG-biomarker+for+cardiac+arrest+during+hypothermia.">A novel ECG-biomarker for cardiac arrest during hypothermia.</a> Scandinavian Journal of Trauma Resuscitation &amp; Emergency Medicine. 28 (1), 27 (2020).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Die Komplexität intakter Tiere, einschließlich der Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Zelltypen, verhindert häufig detaillierte Untersuchungen spezifischer Komponenten von I/R-Verletzungen. Daher ist es notwendig, ein In-vitro-Zellmodell zu etablieren, das die molekularen Veränderungen nach Ischämie in vivo genau reflektieren kann. Forschung an OGD-Modelle wurde bereits berichtet13,22, und viele ausgeklügelte Methoden wurden etabliert...

Ischämie/Reperfusion abgeleitete Myokardfunktionsstörung ist ein häufiges klinisches Szenario bei Patienten nach Herzoperationen1,2. Während der nichtpulsatilen Durchflussdurchblutung und Perioden des gesamten Kreislaufstillstands treten immer noch Schäden bei allen Arten von Herzzellen auf. Insbesondere ist die Empfindlichkeit von Kardiomyozyten gegenüber ischämischen Verletzungen höher als bei anderen Zellpopulationen. Derzeit bietet die therapeutische Unterkühlung (TH) einen erheblichen Schutz gegen eine erwartete ischämische Beleidigung bei Patienten, die sich einer Herzoperation unterziehen3,4. TH ist definiert als eine Kernkörpertemperatur von 14-34 °C, obwohl es keinen Konsens über eine Definition der Kühlung während der Herzchirurgie5,6,7gibt. Im Jahr 2013 schlug eine internationale Expertengruppe ein standardisiertes Meldesystem vor, um verschiedene Temperaturbereiche des systemischen hypothermischen Kreislaufstillstands8zu klassifizieren. Basierend auf Elektroenzephalographie- und Stoffwechselstudien des Gehirns teilten sie die Hypothermie in vier Ebenen auf: tiefe Hypothermie (≤ 14 °C), tiefe Hypothermie (14,1-20 °C), moderate Unterkühlung (20,1-28 °C) und leichte Hypothermie (28,1-34 °C). Der Expertenkonsens bot eine klare und einheitliche Klassifizierung, die es ermöglicht, dass Studien vergleichbarer sind und klinisch relevantere Ergebnisse liefern. Dieser Schutz durch TH basiert auf seiner Fähigkeit, die metabolische Aktivität von Zellen zu reduzieren, was ihre Rate des verbrauchshöchstenergetischen Phosphatverbrauchs weiter begrenzt9,10. Jedoch, die Rolle der TH im Myokardschutz ist umstritten und kann mehrere Auswirkungen haben, je nach Grad der Unterkühlung.
Myokardi/R ist bekannt, dass sie von erhöhter Zellapoptisis11begleitet wird. Jüngste Berichte haben beobachtet, dass programmierte KardiomyozytenTod steigt während der Operation am offenen Herzen, und kann mit Nekrose zusammenfallen, wodurch die Zahl der toten Myokardzellen12erhöht. Daher ist die Verringerung der Kardiomyozytenapoptose ein nützlicher therapeutischer Ansatz in der klinischen Praxis. Im Maus-Atrial-HL-1-Kardiomyozytenmodell wurde gezeigt, dass die therapeutische Hypothermie die mitochondriale Freisetzung von Cytochrom c und Apoptose-induzierendem Faktor (AIF) während der Reperfusion13reduziert. Jedoch, die Wirkung der Temperatur bei der Regulierung der Apoptose ist umstritten und scheint vom Grad der Unterkühlung abhängen. Cooper und Kollegen beobachteten, dass im Vergleich zu einer normothermen kardiopulmonalen Bypass-Kontrollgruppe die Apoptoserate des Myokardgewebes von Schweinen mit dem tiefen hypothermen Kreislaufstillstandum 14erhöht wurde. Darüber hinaus haben die Ergebnisse einiger Studien darauf hindeutet, dass tiefe Hypothermie den Apoptose-Weg aktivieren kann, während weniger aggressive Hypothermie den Weg zu hemmen scheint12,15,16. Der Grund für dieses Ergebnis kann auf verwirrende Effekte im Zusammenhang mit ischämischen Verletzungen und ein Mangelndes Verständnis der Mechanismen, durch die Temperatur wirkt sich auf Myokardgewebe. Daher sollten die Temperaturgrenzwerte, bei denen die Apoptose erhöht oder abgeschwächt wird, genau definiert werden.
Um ein besseres Verständnis der Mechanismen zu gewinnen, die mit der Wirksamkeit der Hypothermie verbunden sind, und eine rationale Grundlage für ihre Umsetzung beim Menschen zu schaffen, ist es wichtig, einen Kulturzustand ähnlich wie in vivo-Bedingungen zu identifizieren, die Schäden ähnlich denen für den klinischen Zustand in reproduzierbarer Weise verursachen können. Ein wesentlicher Schritt zur Erreichung dieses Ziels ist die Schaffung der optimalen Bedingungen für die Induktion von Kardiomyozyten-Apoptose. Dementsprechend untersuchten wir in der vorliegenden Studie die methodischen Details zu Sauerstoff-Glukose-Entzugsexperimenten mit kultivierten Zellen, einem einfachen In-vitro-Modell der Ischämie-Reperfusion. Darüber hinaus haben wir die Wirkung verschiedener hypoxisch-ischämischer Zeiten auf die Kardiomyozytenapoptose bewertet und unsere Hypothese über die Wirkung unterschiedlicher Temperaturbedingungen auf die Zellapoptose in vitro überprüft.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Annexin V-FITC cell apoptosis detection kit</td>
			<td>Bio-Technology,China</td>
			<td>C1062M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiac myocyte growth supplement</td>
			<td>Sciencell,USA</td>
			<td>6252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caspase 3 activity assay kit</td>
			<td>Bio-Technology,China</td>
			<td>C1115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caspase 8 activity assay kit</td>
			<td>Bio-Technology,China</td>
			<td>C1151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, no glucose</td>
			<td>Gibco,USA</td>
			<td>11966025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified eagle medium</td>
			<td>Gibco,USA</td>
			<td>11960044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco,USA</td>
			<td>16140071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry</td>
			<td>CytoFLEX,USA</td>
			<td>B49007AF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human myocardial cells</td>
			<td>BLUEFBIO,China</td>
			<td>BFN60808678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1</td>
			<td>Bio-Technology,China</td>
			<td>C2006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin solution</td>
			<td>Gibco,USA</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reactive oxygen species assay kit</td>
			<td>Bio-Technology,China</td>
			<td>S0033S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Three-gas incubator</td>
			<td>Memmert,Germany</td>
			<td>ICO50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Gibco,USA</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro assessment of myocardial protection following hypothermia-preconditioning in a human cardiac myocytes model

Ischämie/Reperfusion abgeleitete Myokardfunktionsstörung ist ein häufiges klinisches Szenario bei Patienten nach einer Herzoperation. Insbesondere ist die Empfindlichkeit von Kardiomyozyten gegenüber ischämischen Verletzungen höher als bei anderen Zellpopulationen. Derzeit bietet Unterkühlung erheblichen Schutz vor einer erwarteten ischämischen Beleidigung. Untersuchungen zu komplexen Hypothermie-induzierten molekularen Veränderungen halten sich jedoch in Grenzen. Daher ist es wichtig, einen Kulturzustand ähnlich wie in vivo-Bedingungen zu identifizieren, die schäden ähnlich denen im klinischen Zustand in einer reproduzierbaren Weise verursachen können. Um Ischämie-ähnliche Bedingungen in vitro nachzuahmen, wurden die Zellen in diesen Modellen durch Sauerstoff-/Glukoseentzug (OGD) behandelt. Darüber hinaus haben wir ein Standard-Zeittemperaturprotokoll angewendet, das während der Herzchirurgie verwendet wird. Darüber hinaus schlagen wir einen Ansatz vor, um eine einfache, aber umfassende Methode für die quantitative Analyse von Myokardverletzungen zu verwenden. Apoptose und Expressionsniveaus von Apoptose-assoziierten Proteinen wurden durch Durchflusszytometrie und mit einem ELISA-Kit bewertet. In diesem Modell haben wir eine Hypothese über die Auswirkungen unterschiedlicher Temperaturbedingungen auf die Kardiomyozytenapoptose in vitro getestet. Die Zuverlässigkeit dieses Modells hängt von einer strengen Temperaturregelung, kontrollierbaren experimentellen Verfahren und stabilen experimentellen Ergebnissen ab. Darüber hinaus kann dieses Modell verwendet werden, um den molekularen Mechanismus des hypothermischen Kardioschutzes zu untersuchen, was wichtige Auswirkungen auf die Entwicklung von ergänzenden Therapien zur Verwendung mit Hypothermie haben kann.

Die Wirkung der OGD-Exposition auf die Lebensfähigkeit von HCM wurde durch CCK-8-Assay bestimmt. Im Vergleich zu der in der Kontrollgruppe beobachteten wurde die Zelllebensfähigkeit zeitabhängig signifikant verringert (Abbildung 2A). Die Apoptoseraten von HCM zu unterschiedlichen Zeiten nach der Reperfusion zeigten einen spezifischen Trend, bei dem die Apoptoseraten allmählich stiegen und die Höchstrate zum 16-Stunden-Zeitpunkt erreichten(Abbildung 2B). Da ...

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In vitro Assessment of Myocardial Protection following Hypothermia-Preconditioning in a Human Cardiac Myocytes Model

Die unterschiedlichen Auswirkungen unterschiedlicher Unterkühlungsgrade auf den Myokardschutz wurden nicht gründlich bewertet. Ziel der vorliegenden Studie war es, die Konzentration des Zelltodes nach verschiedenen Hypothermie-Behandlungen in einem auf humanem Kardiomyozyten basierenden Modell zu quantifizieren und damit den Grundstein für zukünftige vertiefte molekulare Forschung zu legen.

In-vitro-Bewertung des Myokardschutzes nach Hypothermie-Vorkonditionierung in einem Human-Herz-Myozyten-Modell

Ischemia/reperfusion-derived myocardial dysfunction is a common clinical scenario in patients after cardiac surgery. In particular, the sensitivity of ...

in-vitro-assessment-myocardial-protection-following-hypothermia

Research

JoVE Journal

Medicine

2.9K Aufrufe.  Children's Hospital of Nanjing Medical University. Die unterschiedlichen Auswirkungen unterschiedlicher Unterkühlungsgrade auf den Myokardschutz wurden nicht gründlich bewertet. Ziel der vorliegenden Studie war es, die Konzentration des Zelltodes nach verschiedenen Hypothermie-Behandlungen in einem auf humanem Kardiomyozyten basierenden Modell zu quantifizieren und damit den Grundstein für zukünftige vertiefte molekulare Forschung zu legen.

Serie: In vitro Assessment of Myocardial Protection following Hypothermia-Preconditioning in a Human Cardiac Myocytes Model

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and finding new sources for implantable cells are the focus of recent research4,5. Investigating the effectiveness of cell therapies is not an easy task and new tools are needed to investigate the mechanisms involved in the treatment process6. We designed an experimental protocol of ischemia/reperfusion in order to allow the observation of cellular connections and even subcellular mechanisms during ischemia/reperfusion injury and after stem cell transplantation and to evaluate the efficacy of cell therapy. H9c2 cardiomyoblast cells were placed onto cell culture plates7,8. Ischemia was simulated with 150 minutes in a glucose free medium with oxygen level below 0.5%. Then, normal media and oxygen levels were reintroduced to simulate reperfusion. After oxygen glucose deprivation, the damaged cells were treated with transplantation of labeled human bone marrow derived mesenchymal stem cells by adding them to the culture. Mesenchymal stem cells are preferred in clinical trials because they are easily accessible with minimal invasive surgery, easily expandable and autologous. After 24 hours of co-cultivation, cells were stained with calcein and ethidium-homodimer to differentiate between live and dead cells. This setup allowed us to investigate the intercellular connections using confocal fluorescent microscopy and to quantify the survival rate of postischemic cells by flow cytometry. Confocal microscopy showed the interactions of the two cell populations such as cell fusion and formation of intercellular nanotubes. Flow cytometry analysis revealed 3 clusters of damaged cells which can be plotted on a graph and analyzed statistically. These populations can be investigated separately and conclusions can be drawn on these data on the effectiveness of the simulated therapeutical approach.

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

We demonstrate how to set up an in vitro ischemia/reperfusion model and how to evaluate the effect of stem cell therapy on postischemic cardiac cells.

Stem Cell Transplantation in einem In-vitro- Simulierte Ischämie / Reperfusion-Modell

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and ...

Forschung

Medizin

Assessment of Cardiac Function and Myocardial Morphology Using Small Animal Look-locker Inversion Recovery (SALLI) MRI in Rats

Small animal magnetic resonance imaging is an important tool to study cardiac function and changes in myocardial tissue. The high heart rates of small animals (200 to 600 beats/min) have previously limited the role of CMR imaging. Small animal Look-Locker inversion recovery (SALLI) is a T1 mapping sequence for small animals to overcome this problem 1. T1 maps provide quantitative information about tissue alterations and contrast agent kinetics. It is also possible to detect diffuse myocardial processes such as interstitial fibrosis or edema 1-6. Furthermore, from a single set of image data, it is possible to examine heart function and myocardial scarring by generating cine and inversion recovery-prepared late gadolinium enhancement-type MR images 1.
	The presented video shows step-by-step the procedures to perform small animal CMR imaging. Here it is presented with a healthy Sprague-Dawley rat, however naturally it can be extended to different cardiac small animal models.

Assessment of Cardiac Function and Myocardial Morphology Using Small Animal Look-locker Inversion Recovery SALLI MRI in Rats

Contrast enhanced cardiac magnetic resonance (CMR) imaging allows comprehensive in vivo assessment of the heart in small animal models of cardiovascular disease. Here we detail the procedures to perform CMR imaging, reconstruction and analysis using Small Animal Lock-Locker Inversion Recovery (SALLI) in rats.

Beurteilung der Herzfunktion und Morphologie Myokardiale Mit Small Animal Look-Locker Inversion Recovery (SALLI) MRI in Ratten

Small animal magnetic resonance  imaging is an important tool to study cardiac function and changes in myocardial  tissue. The high heart rates of small ...

Myocardial Infarction and Functional Outcome Assessment in Pigs

Introduction of newly discovered cardiovascular therapeutics into first-in-man trials depends on a strictly regulated ethical and legal roadmap. One important prerequisite is a good understanding of all safety and efficacy aspects obtained in a large animal model that validly reflect the human scenario of myocardial infarction (MI). Pigs are widely used in this regard since their cardiac size, hemodynamics, and coronary anatomy are close to that of humans. Here, we present an effective protocol for using the porcine MI model using a closed-chest coronary balloon occlusion of the left anterior descending artery (LAD), followed by reperfusion. This approach is based on 90 min of myocardial ischemia, inducing large left ventricle infarction of the anterior, septal and inferoseptal walls. Furthermore, we present protocols for various measures of outcome that provide a wide range of information on the heart, such as cardiac systolic and diastolic function, hemodynamics, coronary flow velocity, microvascular resistance, and infarct size. This protocol can be easily tailored to meet study specific requirements for the validation of novel cardioregenerative biologics at different stages (i.e. directly after the acute ischemic insult, in the subacute setting or even in the chronic MI once scar formation has been completed). This model therefore provides a useful translational tool to study MI, subsequent adverse remodeling, and the potential of novel cardioregenerative agents.

This protocol describes the porcine myocardial infarction (MI) model using a 90 min closed-chest coronary balloon occlusion of the left anterior descending artery (LAD), followed by reperfusion. Furthermore, the protocol for several outcome parameters, such as cardiac function, hemodynamics, microvascular resistance, and infarct size, are also presented.

Myokardinfarkt und Functional Outcome Assessment in Schweine

Introduction of newly discovered cardiovascular therapeutics into first-in-man trials depends on a strictly regulated ethical and legal roadmap. One ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As such, primary or &#39;neuronal-like&#39; cell culture systems are commonly utilized. While&#160;these systems are relatively easy to work with, and are useful model systems in which various functional outcomes (such as cell death) can be readily quantified, the examined outcomes and pathways in cultured immature neurons (such as excitotoxicity-mediated cell death pathways) are not necessarily the same as those observed in mature brain, or in intact tissue. Therefore, there is the need to develop models in which cellular mechanisms in mature neural tissue can be examined. We have developed an in vitro technique that can be used to investigate a variety of molecular pathways in intact nervous tissue. The technique described herein utilizes rat cortical tissue, but this technique can be adapted to use tissue from a variety of species (such as mouse, rabbit, guinea pig, and chicken) or brain regions (for example, hippocampus, striatum, etc.). Additionally, a variety of stimulations/treatments can be used (for example, excitotoxic, administration of inhibitors, etc.). In conclusion, the brain slice model described herein can be used to examine a variety of molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

We have developed a brain slice model which can be used to examine molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.&#160;This technique generates viable mature brain tissue and reduces animal numbers required for experimentation, whilst keeping the neuronal circuitry, cellular interactions, and postsynaptic compartments partly intact.

Exzitotoxische Stimulation der Hirn Microslices als<em&gt; In-vitro-</em&gt; Modell der Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Primary Outcome Assessment in a Pig Model of Acute Myocardial Infarction

Mortality after acute myocardial infarction remains substantial and is associated with significant morbidity, like heart failure. Novel therapeutics are therefore required to confine cardiac damage, promote survival and reduce the disease burden of heart failure. Large animal experiments are an essential part in the translational process from experimental to clinical therapies. To optimize clinical translation, robust and representative outcome measures are mandatory. The present manuscript aims to address this need by describing the assessment of three clinically relevant outcome modalities in a pig acute myocardial infarction (AMI) model: infarct size in relation to area at risk (IS/AAR) staining, 3-dimensional transesophageal echocardiography (TEE) and admittance-based pressure-volume (PV) loops. Infarct size is the main determinant driving the transition from AMI to heart failure and can be quantified by IS/AAR staining. Echocardiography is a reliable and robust tool in the assessment of global and regional cardiac function in clinical cardiology. Here, a method for three-dimensional transesophageal echocardiography (3D-TEE) in pigs is provided. Extensive insight into cardiac performance can be obtained by admittance-based pressure-volume (PV) loops, including intrinsic parameters of myocardial function that are pre- and afterload independent. Combined with a clinically feasible experimental study protocol, these outcome measures provide researchers with essential information to determine whether novel therapeutic strategies could yield promising targets for future testing in clinical studies.

Reliable and accurate outcome assessment is the key for translation of preclinical therapies into clinical treatment. The current paper describes how to assess three clinically relevant primary outcome parameters of cardiac performance and damage in a pig acute myocardial infarction model.

Primärer Ergebnisbeurteilung in einem Schwein Modell eines akuten Myokardinfarkts

Mortality after acute myocardial infarction remains substantial and is associated with significant morbidity, like heart failure. Novel therapeutics are ...

Myocardial Infarction in Neonatal Mice, A Model of Cardiac Regeneration

Myocardial infarction induced by coronary artery ligation has been used in many animal models as a tool to study the mechanisms of cardiac repair and regeneration, and to define new targets for therapeutics. For decades, models of complete heart regeneration existed in amphibians and fish, but a mammalian counterpart was not available. The recent discovery of a postnatal window during which mice possess regenerative capabilities has led to the establishment of a mammalian model of cardiac regeneration. A surgical model of mammalian cardiac regeneration in the neonatal mouse is presented herein. Briefly, postnatal day 1 (P1) mice are anesthetized by isoflurane and placed on an ice pad to induce hypothermia. After the chest is opened, and the left anterior descending coronary artery (LAD) is visualized, a suture is placed around the LAD to inflict myocardial ischemia in the left ventricle. The surgical procedure takes 10-15 min. Visualizing the coronary artery is crucial for accurate suture placement and reproducibility. Myocardial infarction and cardiac dysfunction are confirmed by triphenyl-tetrazolium chloride (TTC) staining and echocardiography, respectively. Complete regeneration 21 days post myocardial infarction is verified by histology. This protocol can be used to as a tool to elucidate mechanisms of mammalian cardiac regeneration after myocardial infarction.

This protocol describes a highly reproducible model of cardiac regeneration by surgical induction of myocardial infarction in the left ventricle of postnatal day 1 mice. The method involves induction of hypothermic anesthesia and ligation of the left anterior descending coronary artery.

Myokardinfarkts bei neugeborenen Mäusen, ein Modell von Cardiac Regeneration

Myocardial infarction induced by coronary artery ligation has been used in many animal models as a tool to study the mechanisms of cardiac repair and ...

A Flow Cytometry-based Assay for Measuring Mitochondrial Membrane Potential in Cardiac Myocytes After Hypoxia/Reoxygenation

Timely and efficient reperfusion of the occluded coronary artery is the best strategy for decreasing myocardial infarct size in patients with a ST-segment elevated myocardial infarction. However, reperfusion per se can result in further cardiomyocyte death, a phenomenon known as reperfusion injury. The opening of the mitochondrial permeability transition pore (mPTP), with the decrease of the mitochondrial membrane potential (MMP), or mitochondrial depolarization, is universally recognized as the final step of reperfusion injury and is responsible for mitochondrial and cardiomyocyte death. JC-1 is a lipophilic cationic dye that accumulates in mitochondria depending on the value of MMP. The higher the MMP is, the more JC-1 accumulates in the mitochondria. The increasing amounts of JC-1 in mitochondria can be reflected by a fluorescence emission shift from green (~530 nm) to red (~590 nm). Therefore, the reduction of the red/green fluorescence intensity ratio can indicate the depolarization of mitochondria. Here, we take advantage of JC-1 to measure MMP, or the opening of mPTP in human cardiac myocytes after hypoxia/reoxygenation, detected by flow cytometry.

Here, we present a protocol that uses JC-1 dye to assess the mitochondrial membrane potential of cells after being exposed to hypoxia/reoxygenation with or without a protective agent.

Ein Flow Cytometry-basierten Test zur Messung der Mitochondrien-Membran-Potential in kardialen Myozyten nach Hypoxie/Flussbettfilters

Timely and efficient reperfusion of the occluded coronary artery is the best strategy for decreasing myocardial infarct size in patients with a ST-segment ...

Implantation of hiPSC-derived Cardiac-muscle Patches after Myocardial Injury in a Guinea Pig Model

Due to the limited regeneration capacity of the heart in adult mammals, myocardial infarction results in an irreversible loss of cardiomyocytes. This loss of relevant amounts of heart muscle mass can lead to the heart failure. Besides heart transplantation, there is no curative treatment option for the end-stage heart failure. In times of organ donor shortage, organ independent treatment modalities are needed. Left-ventricular assist devices are a promising therapy option, however, especially as destination therapy, limited by its side-effects like stroke, infections and bleedings. In recent years, several cardiac repair strategies including stem cell injection, cardiac progenitors or myocardial tissue engineering have been investigated. Recent improvements in cell biology allow for the differentiation of large amounts of cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells (iPSC). One of the cardiac repair strategies currently under evaluation is to transplant artificial heart tissue. Engineered heart tissue (EHT) is a three-dimensional in vitro created cardiomyocyte network, with functional properties of native heart tissue. We have created EHT-patches from hiPSC derived cardiomyocytes. Here we present a protocol for the induction of left ventricular myocardial cryoinjury in a guinea pig, followed by implantation of hiPSC derived EHT on the left ventricular wall.

Here we present a protocol for the induction of left ventricular cryoinjury followed by the implantation of a cardiac muscle patch, derived from human iPS-cell cardiomyocytes in a guinea pig model.

Implantation von HiPSC abgeleitete Herzmuskel Patches nach Myokard-Schädigung in einem Meerschweinchen-Modell

Due to the limited regeneration capacity of the heart in adult mammals, myocardial infarction results in an irreversible loss of cardiomyocytes. This loss ...

Isolation of Atrial Myocytes from Adult Mice

The electrophysiological properties of atrial myocytes importantly affect overall cardiac function. Alterations in the underlying ionic currents responsible for the action potential can cause pro-arrhythmic substrates that underlie arrhythmias, such as atrial fibrillation, which are highly prevalent in many conditions and disease states. Isolating adult mouse atrial cardiomyocytes for use in patch-clamp experiments has greatly advanced our knowledge and understanding of the cellular electrophysiology in the healthy atrial myocardium and in the setting of atrial pathophysiology. In addition, studies using genetic mouse models have elucidated the role of a vast array of proteins in regulating atrial electrophysiology. Here we provide a detailed protocol for the isolation of cardiomyocytes from the atrial appendages of adult mice using a combination of enzymatic digestion and mechanical dissociation of these tissues. This approach consistently and reliably yields isolated atrial cardiomyocytes that can then be used to characterize cellular electrophysiology by measuring action potentials and ionic currents in patch-clamp experiments under a number of experimental conditions.

This protocol is used to isolate single atrial cardiomyocytes from the adult mouse heart using a chunk digestion approach. This approach is used to isolate right or left atrial myocytes that can be used to characterize atrial myocyte electrophysiology in patch-clamp studies.

Isolierung von Atrial Myozyten von erwachsenen Mäusen

The electrophysiological properties of atrial myocytes importantly affect overall cardiac function. Alterations in the underlying ionic currents ...

In Vitro Assessment of Cardiac Function Using Skinned Cardiomyocytes

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring apparatus and a motor to perform functional studies. These studies will allow measurement of cardiomyocyte stiffness (passive force) and its activation with different calcium (Ca2+)-containing solutions to determine, amongst others: maximum force development, myofilament Ca2+-sensitivity (pCa50), cooperativity (nHill) and the rate of force redevelopment (ktr). This method also enables determination of the effects of drugs acting directly on myofilaments and of the expression of exogenous recombinant proteins on both active and passive properties of cardiomyocytes. Clinically, skinned cardiomyocyte studies highlight the pathophysiology of many myocardial diseases and allow in vitro assessment of the impact of therapeutic interventions targeting the myofilaments. Altogether, this technique enables the clarification of cardiac pathophysiology by investigating correlations between in vitro and in vivo parameters in animal models and human tissue obtained during open heart or transplant surgery.

This protocol aims to describe step-by-step the technique of extraction and assessment of cardiac function using skinned cardiomyocytes. This methodology allows measurement and acutemodulation of myofilament function using small frozen biopsies that can be collected from different cardiac locations, from mice to men.

In Vitro-Bewertung der Herzfunktion mit gehäuteten Kardiomyozyten

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring ...