Name: in vitro assessment of myocardial protection following hypothermia-preconditioning in a human cardiac myocytes model
Uploaded: 2020-10-27T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
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この研究の一部は中国国立自然科学財団(81970265、81900281,81700288)、中国ポスドク科学財団(2019M651904)によって資金提供されました。中国の国家主要研究開発プログラム(2016YFC1101001、2017YFC1308105)。

市販の試薬や器具に関する情報は、 資料表に記載されています。
AC16ヒト心筋細胞株は、BLUEFBIO(上海、中国)から購入したSV40形質転換ヒト線維芽細胞17と成体心室心臓組織からの初代細胞の融合に由来した。細胞株は、心筋細胞の特徴を多くの生化学的および形態学的特徴を開発する。また、細胞株は、ビトロ18,19において心筋損傷および心筋機能を評価するために広く用いられている。
1. 細胞培養
注:基底培養培地は、無血清のダルベッコの修飾されたイーグルの培地(DMEM)、10%のウシ胎児血清(FBS)、1%心臓筋細胞増殖サプリメント、および1%ペニシリン/ストレプトマイシン溶液で構成されています。使用前に4°C、前温37°Cで保存してください。
<ol><li>凍結保存されたヒト心筋細胞(HCM)細胞を液体窒素から取り出し、37°Cの水浴で解凍します。</li>
	<li>バイアルに小さな氷が残るまで、37°Cの水浴でバイアル(<1分)を軽く振ります。</li>
	<li>バイアルを無菌層流れフードに移します。70%のアルコールを浸した綿のボールでバイアルの外側を拭きます。</li>
	<li>解凍した細胞を含む遠心分離管に滴下する4mLの前温成長培地を移す。</li>
	<li>200×gで細胞懸濁液を10分間遠心分離する。 遠心分離後、上清を捨て、ペレットを完全培地の5mLに再懸濁します。</li>
	<li>95%の空気と5%のCO2を有する雰囲気の下で加湿インキュベーターで37°Cの細胞を維持する。 注:実験のために細胞を収穫する前に、細胞は約60〜70%の合流に達するまで増殖することができます。</li>
</ol>酸素グルコース欠乏(OGD)モデルの確立
注:研究期間の2時間前に、成長培地を無血清培地に置き換え、細胞を5%CO2の雰囲気下で37°Cで2時間加湿インキュベーターで再インキュベーターに再インキュベーターした。
<ol><li>培地を6ウェルプレートから吸引し、リン酸緩衝生理食塩液(PBS)で細胞を3回軽く洗浄します。</li>
	<li>1ウェルあたり2mLの新鮮な無糖DMEMを加えます。</li>
	<li>3ガスインキュベーターで、3ガスインキュベーターで、35%N2、5%CO2、および0.1%O2を37°Cで1、2、4、8、12、または16時間の一定温度で培養します。</li>
	<li>低酸素処理後、培地を6ウェルプレートから吸引し、PBS(pH7.4)で細胞を3回洗浄する。</li>
	<li>井戸ごとに完全なDMEMの2 mLを追加します。</li>
	<li>95%の空気と5%のCO2を有する雰囲気の下で加湿インキュベーターで37°Cの細胞を維持する。</li>
</ol>3. 時間温度プロトコル
注: 標準の時間温度プロトコルは、心臓手術中に使用されます。以下のプロトコルに従ってHCMを処理する(図1):タイムポイント1(T1)は誘導の終了を示し、タイムポイント2(T2)はメンテナンスの終了を示し、タイムポイント3(T3)は再温暖化の終了を示す。連続性標準条件下で維持された制御細胞を解析(37°C)。温度条件は、正確な温度調節を可能にする三ガスインキュベーターを使用して作成されます。
<ol><li>実験の2時間前に、培養液を6ウェルプレートから吸引し、1ウェルあたり2mLの新鮮な無血清DMEMを加える。</li>
	<li>5%CO2の雰囲気下で37°Cで2時間加湿インキュベーターで細胞を再インキュベートする。</li>
	<li>2時間後、培地を6ウェルプレートから吸引し、PBS(pH7.4)で細胞を3回洗浄する。</li>
	<li>1ウェルあたり2mLの新鮮な無血清DMEMを加えます。</li>
	<li>三ガスインキュベーター内の細胞を再インキュベートします。 メモ:取り付けられていない細胞や破片を取り除くために、媒体を交換してください。</li>
	<li>培養皿を三ガスインキュベーターに置くことにより、直ちに温度を変えます。</li>
	<li>1時間の冷却後、6ウェルプレートから培地を素早く吸引し、1ウェルあたり2mLの新鮮な無糖DMEMを加える。</li>
	<li>低酸素症を確立するために37°Cで95%N2、5%CO2、および0.1%O2を含む雰囲気下で三ガスインキュベーターで細胞を培養する。</li>
	<li>温度を以下のように設定します。 注:プロトコルは、低温処理の10時間から始まり、2時間から37°Cまでの再温暖化相、ノルメロザミア(37°C)の24時間の再温暖化が続きます。各時点で、3つのペトリ皿が分析のために取り除かれます。</li>
	<li>低温処理後、培地を6ウェルプレートから吸引し、PBS(pH7.4)で3回洗浄する。</li>
	<li>井戸ごとに完全なDMEMの2 mLを追加します。</li>
	<li>95%の空気と5%のCO2を有する雰囲気の下で加湿インキュベーターで37°Cの細胞を維持する。</li>
</ol>4. CCK-8実行可能性アッセイ
<ol><li>0.25%トリプシン-エチレンアミン酢酸(EDTA)溶液とPBSを使用前に37°Cに温めます。</li>
	<li>培地を吸引し、1 mLのPBSで細胞をすすい、ウェルの壁に沿って0.25%のトリプシンの0.5 mLを加えます。ほぼすべてのHCMが剥離されるまで37°Cでインキュベート(約1分)</li>
	<li>トリプシンを中和するためにウェルにDMEM完全培地の1 mLを追加します。</li>
	<li>細胞懸濁液を15mL遠心チューブに移し、500×gで遠心分離してHCMを3分間ペレットします。ペレットを邪魔することなく上清を吸引する。</li>
	<li>細胞懸濁液(5000細胞/ウェル)の100μLアリコートを96ウェルプレートに分配します。加湿インキュベーターでプレートを24時間前にインキュベートする(37°C)</li>
	<li>培養した細胞を96ウェルプレートに使用して、異なる処理群を生成します。</li>
	<li>インキュベーターでプレートを適当な時間(16時間)インキュベートします。</li>
	<li>プレートの各ウェルに10 μLのCCK-8溶液を加えます。</li>
	<li>インキュベーターでプレートを1時間インキュベートします。</li>
	<li>マイクロプレートリーダーを使用して450 nmで吸光度を測定します。 注意: 気泡は、ODの読み取り測定を妨げるので、井戸に気泡を導入しないように注意してください。</li>
</ol>5. アポトーシス解析のためのフローサイトメトリー
<ol><li>ステップ 4.2~4.4 に従って、トリプシン化と遠心化の手順を実行します。 メモ:細胞はEDTAなしでトリプシンで収穫されます。アポトーシスを評価するために、浮遊細胞と付着細胞の両方が収集される。</li>
	<li>1000×gで5分間細胞を遠心分離する。上清を捨て、PBSの1mLでペレットを再懸濁します。</li>
	<li>ヘモサイトメーターを使用して細胞を数えます。ピペットを使用して、トリパンブルー処理細胞懸濁液の100 μLをヘモサイトメーターに移します。ハンド集計カウンターを使用して、16個の正方形の1組に生きた未染色細胞を数え、PBSを使用して1×107 セル/mlで細胞懸濁液を生成する。</li>
	<li>200μLの細胞懸濁液(5×105-1×106細胞)を得る。 </li>
	<li>遠心分離機は1000×gで5分間、アネキシンV-FITC結合溶液中のペレットを再懸濁します。</li>
	<li>5 μLのアネキシンV-FITCを加えて細胞を染色します。</li>
	<li>10μLのヨウ化プロピジウムを細胞懸濁液に加えます。</li>
	<li>細胞を穏やかに混ぜ、暗闇の中で室温で20分間インキュベートします。 注:細胞は、染色を改善するために、インキュベーション中に2〜3回再懸濁されます。</li>
	<li>フローサイトメーターを起動し、ソフトウェアが適切に動作していることを確認します。</li>
	<li>フローサイトメトリーソフトウェアで2つのドットプロットウィンドウを開きます。</li>
	<li>X 軸の前方散乱光 (FSC) と Y 軸の側面散乱光 (SSC) を選択して、それぞれサイズと粒度の観点からセルの破片や束を除外します。</li>
	<li>細胞の蛍光強度を測定するために使用されるPE(590 mm)検出チャネルおよびFITC(530 mm)を選択します。</li>
	<li>フローサイトメーターにブランク(染色されていないHCM)サンプルチューブを置きます。</li>
	<li>[ 記録 ]をクリックして、空のサンプルチューブ内の懸濁液からパーティクルを収集し、最初のドットプロットでさらなる分析のためにセルの母集団をゲートします。</li>
	<li>単染色サンプルをチューブサポートアームに配置します。[ レコード ]をクリックして懸濁液からパーティクルを収集し、最初のドット プロットでさらなる解析のためにセルの母集団をゲートします。</li>
	<li>他のサンプルチューブにHcMを集め、蛍光チャネルの電圧を調整して測定を最適化します。 注: 染色されていないサンプルと単染色されたサンプルは、実験中に補正コントロールとして使用されます。</li>
	<li>各サンプルチューブの統計を表示し、各サンプルのアポトーシス率を計算します。</li>
</ol>6. ミトコンドリア脱分極評価
<ol><li>ステップ 4.2-4.4 に従ってトリプシン化と遠心分離を行います。</li>
	<li>完全な培地の500 μLで細胞を再懸濁し、1×105 - 6 ×106 細胞に調整した細胞密度を調整します</li>
	<li>各チューブに0.5 mLのJC-1作業溶液を追加します。</li>
	<li>細胞インキュベーター中の細胞を37°Cで20分間インキュベートします。 注:インキュベーション期間中、5×JC-1染色バッファーを4mLの蒸留水に1mL添加し、JC-1染色バッファーを調製します。</li>
	<li>インキュベーション後、4°Cで3分間600×gで細胞を遠心分離する。</li>
	<li>上清を捨て、JC-1染色バッファーの1 mLにペレットを再懸濁します。</li>
	<li>手順 6.5 ~ 6.6 を 3 回繰り返します。</li>
	<li>1.5 mL遠心分離管内の氷冷染色バッファーの1 mLでHCMを再懸濁し、30分以内に分析するために細胞を使用します。</li>
	<li>PE(590 nm)検出チャネルとFITC(530 nm)を選択して、細胞内のJC-1色素の蛍光強度を測定します。 メモ:手順5.10~5.17に従ってフローサイトメーターを設定します。</li>
</ol>7. 活性酸素種アッセイ
<ol><li>ステップ 4.2-4.4 に従ってトリプシン化と遠心分離を行います。</li>
	<li>10 μM DCFDA を用いて培地中の細胞を染色し、細胞密度を 1 × 106 ~ 1 × 107 細胞に調整する</li>
	<li>37°Cで30分間インキュベートする。</li>
	<li>3~5分ごとに細胞を上下に軽くピペットします。</li>
	<li>インキュベーション後、細胞を無血清細胞培養培地で3回洗浄する。</li>
	<li>フローサイトメーターの細胞を、ステップ 5.10~5.17 に従って分析します。 注: DCF は 488 nm で励起され、530 nm で測定された発光強度です。</li>
</ol>8. カスパーゼ3/カスパーゼ8活性測定
<ol><li>ステップ 4.2 から 4.4 に従ってトリプシンを実行します。</li>
	<li>4°Cで600×gで5分間遠心分離して細胞を回収する。</li>
	<li>2個の×106細胞あたり100μLのライセートバッファーを加えます。</li>
	<li>氷の上で15分間細胞をライスします。</li>
	<li>氷浴で15分間インキュベートした後、1.6×104 x gでサンプルを遠心分離し、4°Cで15分間遠心します。</li>
	<li>上清を氷冷遠心管に移して使用します。 注:サンプル中のタンパク質濃度は、少なくとも1〜3mg/mLでなければなりません。</li>
	<li>Ac-DEVD-pNA(2 mM)を取り出し、氷浴に置いて使用してください。</li>
	<li>酵素標識プレートに40 μLのバッファー溶液を正確に添加し、サンプルを80 μL添加し、最後に10 μLのAc-DEVD-pNA(2 mM)を加えます。</li>
	<li>37°Cで120分間インキュベートします。</li>
	<li>メーカーの指示に従ってマイクロプレートリーダーでA405値を測定。 注: caspase-3/caspase-8 によって生成される pNA によって生成される吸光度は、サンプルのブランクコントロールの A405 値を減算して計算されます。</li>
</ol>

<ol>
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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase+inhibition+attenuates+contractile+dysfunction+following+cardioplegic+arrest+and+rewarming+in+the+setting+of+left+ventricular+failure.">Caspase inhibition attenuates contractile dysfunction following cardioplegic arrest and rewarming in the setting of left ventricular failure.</a> Journal of cardiovascular pharmacology. 44 (6), 645-650 (2004).</li><li>Egorov, Y. V., Glukhov, A. V., Efimov, I. R., Rosenshtraukh, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothermia-induced+spatially+discordant+action+potential+duration+alternans+and+arrhythmogenesis+in+nonhibernating+versus+hibernating+mammals.">Hypothermia-induced spatially discordant action potential duration alternans and arrhythmogenesis in nonhibernating versus hibernating mammals.</a> AMERICAN JOURNAL OF PHYSIOLOGY-HEART AND CIRCULATORY PHYSIOLOGY. 303 (8), 1035-1046 (2012).</li><li>Bobi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderate+Hypothermia+Modifies+Coronary+Hemodynamics+and+Endothelium-Dependent+Vasodilation+in+a+Porcine+Model+of+Temperature+Management.">Moderate Hypothermia Modifies Coronary Hemodynamics and Endothelium-Dependent Vasodilation in a Porcine Model of Temperature Management.</a> Journal of the American Heart Association. 9 (3), 014035 (2020).</li><li>Dietrichs, E. S., Tveita, T., Myles, R., Smith, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+ECG-biomarker+for+cardiac+arrest+during+hypothermia.">A novel ECG-biomarker for cardiac arrest during hypothermia.</a> Scandinavian Journal of Trauma Resuscitation &amp; Emergency Medicine. 28 (1), 27 (2020).</li></ol>

著者らは開示するものは何もない。

異なるタイプの細胞間の相互作用を含む無傷の動物の複雑さは、しばしばI/R傷害の特定の構成要素の詳細な研究を妨げる。そのため、インビボでの虚血後の分子変化を正確に反映できるインビトロ細胞モデルを確立する必要がある。OGDモデルに関する研究は、以前に報告されています13,22, そして多くの洗練された方法が確立されています<sup class="x...

虚血/再灌流由来心筋機能障害は、心臓手術1、2後の患者における一般的な臨床シナリオである。非パルスタイル低流動灌流および総循環停止期間中に、すべてのタイプの心臓細胞を含む損傷がまだ起こる。特に、虚血性損傷に対する心筋細胞の感受性は、他の細胞集団のそれよりも高い。現在、治療低体温症(TH)は、心臓手術3、4を受けている患者において予想される虚血性侮辱に対して実質的な保護を与える。THは、心臓手術中の冷却の定義に関するコンセンサスは存在しないが、14-34 °Cのコア体温として定義される5、6、7。2013年、国際的な専門家パネルは、全身低体温循環停止8の様々な温度範囲を分類するための標準化された報告システムを提案した。脳の脳波と代謝の研究に基づいて、彼らは低体温症を4つのレベルに分けた:深度低体温症(≤14°C)、深い低体温症(14.1-20°C)、中等度の低体温(20.1-28°C)、および軽度の低体温症(28.1-34°C)。専門家のコンセンサスは明確で均一な分類を提供し、研究がより比較可能になり、より臨床的に関連する結果を提供することを可能にした。THによって与えられるこの保護は、細胞の代謝活性を低下させる能力に基づいており、高エネルギーリン酸塩消費の速度をさらに制限する9,10。しかし、心筋保護におけるTHの役割は議論の余地があり、低体温症の程度に応じて複数の効果を有する可能性がある。
心筋I/Rは、細胞アポプシス11の増加を伴うことはよく知られている。最近の報告では、プログラムされた心筋細胞死が開胸手術中に増加し、壊死と一致し、それによって死んだ心筋細胞の数が12に増加することが観察されている。従って、心筋細胞アポトーシスの低減は、臨床現場で有用な治療アプローチである。マウス心房HL-1心筋細胞モデルにおいて、治療下垂体は、再灌流中のチトクロムcおよびアポトーシス誘導因子(AIF)のミトコンドリア放出を減少させることが示された13。しかし、アポトーシスの調節における温度の影響は議論の余地があり、低体温症の程度に依存しているように見える。Cooperたちの研究グループは、ノルマンサーミック心肺バイパスコントロール群と比較して、深低体温循環停止を有する豚由来の心筋組織のアポトーシス率が14増加したことを観察した。さらに、いくつかの研究の結果は、深い低体温がアポトーシス経路を活性化する可能性があることを示唆しているが、あまり積極的な低体温は経路12、15、16を阻害するように見える。この結果の理由は、虚血性損傷に関連する交核化効果と、温度が心筋組織に影響を与えるメカニズムの理解の欠如に起因する可能性があります。したがって、アポトーシスが増強または減衰する温度制限は正確に定義されるべきである。
低体温症の効力に関連するメカニズムをよりよく理解し、ヒトにおけるその実施の合理的な基礎を提供するためには、臨床状態に対して観察されたような損傷を再現可能なin vivo状態と同様の培養条件を同定することが不可欠である。この目標を達成するための重要なステップは、心筋細胞アポトーシスを誘導するための最適な条件を確立することです。そこで、本研究では、虚血再灌流の容易なインビトロモデルである培養細胞による酸素グルコース欠乏実験に関する方法論的詳細を検討した。さらに、心筋細胞アポトーシスに対する異なる低酸素虚血時間の影響を評価し、インビトロにおける細胞アポトーシスに対する異なる温度条件の影響に関する仮説を検証した。

<table><tbody><tr><td>Annexin V-FITC cell apoptosis detection kit</td><td>Bio-Technology,China</td><td>C1062M</td><td></td></tr><tr><td>Cardiac myocyte growth supplement</td><td>Sciencell,USA</td><td>6252</td><td></td></tr><tr><td>Caspase 3 activity assay kit</td><td>Bio-Technology,China</td><td>C1115</td><td></td></tr><tr><td>Caspase 8 activity assay kit</td><td>Bio-Technology,China</td><td>C1151</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, no glucose</td><td>Gibco,USA</td><td>11966025</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s modified eagle medium</td><td>Gibco,USA</td><td>11960044</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Gibco,USA</td><td>16140071</td><td></td></tr><tr><td>Flow cytometry</td><td>CytoFLEX,USA</td><td>B49007AF</td><td></td></tr><tr><td>Human myocardial cells</td><td>BLUEFBIO,China</td><td>BFN60808678</td><td></td></tr><tr><td>Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1</td><td>Bio-Technology,China</td><td>C2006</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin solution</td><td>Gibco,USA</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>Reactive oxygen species assay kit</td><td>Bio-Technology,China</td><td>S0033S</td><td></td></tr><tr><td>Three-gas incubator</td><td>Memmert,Germany</td><td>ICO50</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td><td>Gibco,USA</td><td>25200056</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro assessment of myocardial protection following hypothermia-preconditioning in a human cardiac myocytes model

虚血/再灌流由来心筋機能障害は、心臓手術後の患者における一般的な臨床シナリオである。特に、虚血性損傷に対する心筋細胞の感受性は、他の細胞集団のそれよりも高い。現在、低体温症は、予想される虚血性侮辱に対してかなりの保護を与える。しかし、複雑な低体温症による分子変化の調査は依然として限定的である。そのため、臨床状態で観察されたような損傷を再現可能な方法で誘導できるin vivo状態と同様の培養条件を特定することが不可欠である。インビトロで虚血様の状態を模倣するために、これらのモデルの細胞は酸素/グルコース欠乏(OGD)によって処理された。また、心臓手術時に使用される標準時間温度プロトコルを適用しました。さらに、心筋損傷の定量的分析に、シンプルかつ包括的な手法を用いたアプローチを提案する。アポトーシス関連タンパク質のアポトーシスおよび発現レベルを、フローサイトメトリーおよびELISAキットを用いて評価した。本モデルでは、異なる温度条件が体外での心筋細胞アポトーシスに及ぼす影響に関する仮説を検証した。このモデルの信頼性は、厳密な温度制御、制御可能な実験手順、および安定した実験結果に依存します。さらに、このモデルは、低体温療法の開発に重要な意味を持つ低体温心保護の分子機構を研究するために使用することができます。

HCMの生存率に対するOGD暴露の効果は、CCK-8アッセイによって決定された。対照群で観察されたものと比較して、細胞生存率は時間依存的に有意に低下した(図2A)。再灌流後の異なる時期におけるHCMのアポトーシス率は、0から16時間までの特定の傾向を示し、アポトーシス率は徐々に増加し、16時間時点で最大速度に達した(図2B)。OGDとして12hの細胞活?...

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In vitro Assessment of Myocardial Protection following Hypothermia-Preconditioning in a Human Cardiac Myocytes Model

心筋保護に対する低体温の異なる程度の明確な影響は十分に評価されていない。本研究の目的は、ヒト心筋細胞系モデルにおける異なる低体温症治療に続く細胞死のレベルを定量化し、将来の詳細な分子研究の基礎を築くことであった。

ヒト心臓筋細胞モデルにおける低体温症前処理に対する心筋保護のインビトロ評価

Ischemia/reperfusion-derived myocardial dysfunction is a common clinical scenario in patients after cardiac surgery. In particular, the sensitivity of ...

in-vitro-assessment-myocardial-protection-following-hypothermia

Research

JoVE Journal

Medicine

3.0K ビュー.  Children's Hospital of Nanjing Medical University. 心筋保護に対する低体温の異なる程度の明確な影響は十分に評価されていない。本研究の目的は、ヒト心筋細胞系モデルにおける異なる低体温症治療に続く細胞死のレベルを定量化し、将来の詳細な分子研究の基礎を築くことであった。

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A Murine Closed-chest Model of Myocardial Ischemia and Reperfusion

Surgical trauma by thoracotomy in open-chest models of coronary ligation induces an immune response which modifies different mechanisms involved in ischemia and reperfusion. Immune response includes cytokine expression and release or secretion of endogenous ligands of innate immune receptors. Activation of innate immunity can potentially modulate infarct size. We have modified an existing murine closed-chest model using hanging weights which could be useful for studying myocardial pre- and postconditioning and the role of innate immunity in myocardial ischemia and reperfusion. This model allows animals to recover from surgical trauma before onset of myocardial ischemia.
Volatile anesthetics have been intensely studied and their preconditioning effect for the ischemic heart is well known. However, this protective effect precludes its use in open chest models of coronary artery ligation. Thus, another advantage could be the use of the well controllable volatile anesthetics for instrumentation in a chronic closed-chest model, since their preconditioning effect lasts up to 72 hours. Chronic heart diseases with intermittent ischemia and multiple hit models are other possible applications of this model.
For the chronic closed-chest model, intubated and ventilated mice undergo a lateral blunt thoracotomy via the 4th intercostal space. Following identification of the left anterior descending a ligature is passed underneath the vessel and both suture ends are threaded through an occluder. Then, both suture ends are passed through the chest wall, knotted to form a loop and left in the subcutaneous tissue. After chest closure and recovery for 5 days, mice are anesthetized again, chest skin is reopened and hanging weights are hooked up to the loop under ECG control.
At the end of the ischemia/reperfusion protocol, hearts can be stained with TTC for infarct size assessment or undergo perfusion fixation to allow morphometric studies in addition to histology and immunohistochemistry.

Surgical trauma induces an inflammatory response. Cytokines and endogenous ligands are known to modulate myocardial infarct size following ischemia and reperfusion. We present a modified closed-chest model of murine ischemia and reperfusion using hanging weights to minimize effects of thoracotomy.

心筋虚血再灌流障害のマウスクローズド胸モデル

Surgical trauma by thoracotomy in open-chest models of coronary ligation induces an immune response which modifies different mechanisms involved in ...

医学

Murine Isolated Heart Model of Myocardial Stunning Associated with Cardioplegic Arrest

The following protocol is of use to evaluate impaired cardiac function or myocardial stunning following moderate ischemic insults. The technique is useful for modeling ischemic injury associated with numerous clinically relevant phenomenon including cardiac surgery with cardioplegic arrest and cardiopulmonary bypass, off-pump CABG, transplant, angina, brief ischemia, etc. The protocol presents a general method to model hypothermic hyperkalemic cardioplegic arrest and reperfusion in rodent hearts focusing on measurement of myocardial contractile function. In brief, a mouse heart is perfused in langendorff mode, instrumented with an intraventricular balloon, and baseline cardiac functional parameters are recorded. Following stabilization, the heart is then subject to brief infusion of a cardioprotective hypothermic cardioplegia solution to initiate diastolic arrest. Cardioplegia is delivered intermittently over 2 hr. The heart is then reperfused and warmed to normothermic temperatures and recovery of myocardial function is monitored. Use of this protocol results in reliable depressed cardiac contractile function free from gross myocardial tissue damage in rodents.

The goal of this protocol to assess myocardial stunning following ischemic cardioplegic arrest in rodents.

心臓麻痺逮捕と気絶心筋関連のマウス単離された心臓モデル

The following protocol is of use to evaluate impaired cardiac function or myocardial stunning following moderate ischemic insults. The technique is useful ...

Induction and Assessment of Ischemia-reperfusion Injury in Langendorff-perfused Rat Hearts

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for myocardial infarction and cardiac complications of thoracic surgery. The ability of certain drugs to precondition the myocardium against ischemia reperfusion injury has led to multiple clinical trials, with little success. The isolated heart model allows acute observation of the functional effects of ischemia reperfusion injury in real time, including the effects of various pharmacological interventions administered at any time-point before or within the ischemia-reperfusion injury window. Since brief periods of ischemia can precondition the heart against ischemic injury, in situ aortic cannulation is performed to allow for functional assessment of non-preconditioned myocardium. A saline filled balloon is placed into the left ventricle to allow for real-time measurement of pressure generation. Ischemic injury is simulated by the cessation of perfusion buffer flow, followed by reperfusion. The duration of both ischemia and reperfusion can be modulated to examine biochemical events at any given time-point. Although the Langendorff isolated heart model does not allow for the consideration of systemic events affecting ischemia and reperfusion, it is an excellent model for the examination of acute functional and biochemical events within the window of ischemia reperfusion injury as well as the effect of pharmacological intervention on cardiac pre- and postconditioning. The goal of this protocol is to demonstrate how to perform in situ aortic cannulation and heart excision followed by ischemia/reperfusion injury in the Langendorff model.

The isolated rat heart is an enduring model for ischemia reperfusion injury. Here, we describe the process of harvesting the beating heart from a rat via in situ aortic cannulation, Langendorff perfusion of the heart, simulated ischemia-reperfusion injury, and infarct staining to confirm the extent of ischemic insult.

ランゲンドルフ灌流ラット心臓における虚血再灌流傷害の誘導と評価

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for ...

A Recovery Cardiopulmonary Bypass Model Without Transfusion or Inotropic Agents in Rats

Cardiopulmonary bypass (CPB) is indispensable in cardiovascular surgery. Despite the dramatic refinement of CPB technique and devices, multi-organ complications related to prolonged CPB still compromise the outcome of cardiovascular surgeries, and may worsen postoperative morbidity and mortality. Animal models recapitulating the clinical usage of CPB enable the clarification of the pathophysiological processes that occur during CPB, and facilitate pre-clinical studies to develop strategies protecting against these complications. Rat CPB models are advantageous because of their greater cost-effectiveness, convenient experimental processes, abundant testing methods at the genetic or protein levels, and genetic consistency. They can be used for investigating the immune system activation and synthesis of proinflammatory cytokines, compliment activation, and production of oxygen free radicals. The rat models have been refined and have gradually taken the place of large-animal models. Here, we describe a simple CPB model without transfusion and/or inotropic agents in a rat. This recovery model allows the study of the long-term multiple organ sequelae of CPB.

Here, we present a protocol to describe a simple recovery cardiopulmonary bypass model without transfusion or inotropic agents in a rat. This model allows the study of the long-term multiple organ sequelae of cardiopulmonary bypass.

輸血やラットの変力作用エージェントなし回復心肺モデル

Cardiopulmonary bypass (CPB) is indispensable in cardiovascular surgery. Despite the dramatic refinement of CPB technique and devices, multi-organ ...

免疫・感染学

Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model Throughput of Engineered Cardiac Tissues

Heart failure remains the leading cause of death worldwide, creating a pressing need for better preclinical models of the human heart. Tissue engineering is crucial for basic science cardiac research; in vitro human cell culture eliminates the interspecies differences of animal models, while a more tissue-like 3D environment (e.g., with extracellular matrix and heterocellular coupling) simulates in vivo conditions to a greater extent than traditional two-dimensional culture on plastic Petri dishes. However, each model system requires specialized equipment, for example, custom-designed bioreactors and functional assessment devices. Additionally, these protocols are often complicated, labor-intensive, and plagued by the failure of the small, delicate tissues.
This paper describes a process for generating a robust human engineered cardiac tissue (hECT) model system using induced pluripotent stem-cell-derived cardiomyocytes for the longitudinal measurement of tissue function. Six hECTs with linear strip geometry are cultured in parallel, with each hECT&#160;suspended from a pair of force-sensing polydimethylsiloxane (PDMS) posts attached to PDMS racks. Each post is capped with a black PDMS stable post tracker (SPoT), a new feature that improves the ease of use, throughput, tissue retention, and data quality. The shape allows for the reliable optical tracking of post deflections, yielding improved twitch force tracings with absolute active and passive tension. The cap geometry eliminates tissue failure due to hECTs slipping off the posts, and as they involve a second step after PDMS rack fabrication, the SPoTs can be added to existing PDMS post-based designs without major changes to the bioreactor fabrication process.
The system is used to demonstrate the importance of measuring hECT function at physiological temperatures and shows stable tissue function during data acquisition. In summary, we describe a state-of-the-art model system that reproduces key physiological conditions to advance the biofidelity, efficiency, and rigor of engineered cardiac tissues for in vitro applications.

Three-dimensional cardiac tissues bioengineered using stem-cell-derived cardiomyocytes have emerged as promising models for studying healthy and diseased human myocardium in vitro while recapitulating key aspects of the native cardiac niche. This manuscript describes a protocol for fabricating and analyzing high-content engineered cardiac tissues generated from human induced pluripotent stem-cell-derived cardiomyocytes.

人工心臓組織のデータ取得とモデルスループットを向上させるバイオリアクターの設計

Heart failure remains the leading cause of death worldwide, creating a pressing need for better preclinical models of the human heart. Tissue engineering ...

生物工学

Pre-clinical Model of Cardiac Donation after Circulatory Death

Cardiac transplantation demand is on the rise; nevertheless, organ availability is limited due to a paucity of suitable donors. Organ donation after circulatory death (DCD) is a solution to address this limited availability, but due to a period of prolonged warm ischemia and the risk of tissue injury, its routine use in cardiac transplantation is seldom seen. In this manuscript we provide a detailed protocol closely mimicking current clinical practices in the context of DCD with continuous monitoring of heart function, allowing for the evaluation of novel cardioprotective strategies and interventions to decrease ischemia-reperfusion injury.
In this model, the DCD protocol is initiated in anesthetized Lewis rats by stopping ventilation to induce circulatory death. When systolic blood pressure drops below 30 mmHg, the warm ischemic time is initiated. After a pre-set warm ischemic period, hearts are flushed with a normothermic cardioplegic solution, procured, and mounted onto a Langendorff ex vivo heart perfusion system. Following 10 min of initial reperfusion and stabilization, cardiac reconditioning is continuously evaluated for 60 min using intraventricular pressure monitoring. A heart injury is assessed by measuring cardiac troponin T and the infarct size is quantified by histological staining. The warm ischemic time can be modulated and tailored to develop the desired amount of structural and functional damage. This simple protocol allows for the evaluation of different cardioprotective conditioning strategies introduced at the moment of cardioplegia, initial reperfusion and/or during ex vivo perfusion. Findings obtained from this protocol can be reproduced in large models, facilitating clinical translation.

This protocol shows a simple and flexible approach for the evaluation of new conditioning agents or strategies to increase the feasibility of cardiac donation after circulatory death.

循環死後の心臓寄付の前臨床モデル

Cardiac transplantation demand is on the rise; nevertheless, organ availability is limited due to a paucity of suitable donors. Organ donation after ...

A Cryoinjury Model to Study Myocardial Infarction in the Mouse

The use of animal models is essential for developing new therapeutic strategies for acute coronary syndrome and its complications. In this article, we demonstrate a murine cryoinjury infarct model that generates precise infarct sizes with high reproducibility and replicability. In brief, after intubation and sternotomy of the animal, the heart is lifted from the thorax. The probe of a handheld liquid nitrogen delivery system is applied onto the myocardial wall to induce cryoinjury. Impaired ventricular function and electrical conduction can be monitored with echocardiography or optical mapping. Transmural myocardial remodeling of the infarcted area is characterized by collagen deposition and loss of cardiomyocytes. Compared to other models (e.g., LAD-ligation), this model utilizes a handheld liquid nitrogen delivery system to generate more uniform infarct sizes.

This article demonstrates a model to study cardiac remodeling after myocardial cryoinjury in mice.

マウスの心筋梗塞を研究する凍結傷害モデル

The use of animal models is essential for developing new therapeutic strategies for acute coronary syndrome and its complications. In this article, we ...

In Vitro Assessment of Cardiac Function Using Skinned Cardiomyocytes

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring apparatus and a motor to perform functional studies. These studies will allow measurement of cardiomyocyte stiffness (passive force) and its activation with different calcium (Ca2+)-containing solutions to determine, amongst others: maximum force development, myofilament Ca2+-sensitivity (pCa50), cooperativity (nHill) and the rate of force redevelopment (ktr). This method also enables determination of the effects of drugs acting directly on myofilaments and of the expression of exogenous recombinant proteins on both active and passive properties of cardiomyocytes. Clinically, skinned cardiomyocyte studies highlight the pathophysiology of many myocardial diseases and allow in vitro assessment of the impact of therapeutic interventions targeting the myofilaments. Altogether, this technique enables the clarification of cardiac pathophysiology by investigating correlations between in vitro and in vivo parameters in animal models and human tissue obtained during open heart or transplant surgery.

This protocol aims to describe step-by-step the technique of extraction and assessment of cardiac function using skinned cardiomyocytes. This methodology allows measurement and acutemodulation of myofilament function using small frozen biopsies that can be collected from different cardiac locations, from mice to men.

皮膚心筋細胞を用いた心機能のインビトロ評価

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring ...

Assessment of Ex Vivo Murine Biventricular Function in a Langendorff Model

Primary graft dysfunction (PGD) remains the leading cause of early death following heart transplantation. Prolonged ischemic time during cold preservation is an important risk factor for PGD, and reliable evaluation of cardiac function is essential to study the functional responses of the donor heart after cold preservation. The accompanying video describes a technique to assess murine right and left ventricular function using ex vivo perfusion based in a Langendorff model after cold preservation for different durations. In brief, the heart is isolated and stored in a cold histidine-tryptophan-ketoglutarate (HTK) solution. Then, the heart is perfused with a Kreb buffer in a Langendorff model for 60 min. A silicone balloon is inserted into the left and right ventricle, and cardiac functional parameters are recorded (dP/dt, pressure-volume relationships). This protocol allows the reliable evaluation of cardiac function after different heart preservation protocols. Importantly, this technique allows the study of cardiac preservation responses specifically in native cardiac cells. The use of very small murine hearts allows access to an enormous array of transgenic mice to investigate the mechanisms of PGD.

Assessment of Ex Vivo Murine Biventricular Function in a Langendorff Model

Presented here is a protocol to reliably quantify the right and left ventricular function of donor hearts after cold preservation using an ex vivo perfusion system.

ランゲンドルフモデルにおける Ex vivo マウス両心室機能の評価

Primary graft dysfunction (PGD) remains the leading cause of early death following heart transplantation. Prolonged ischemic time during cold preservation ...

Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices

The isolation of ventricular cardiac myocytes from animal and human hearts is a fundamental method in cardiac research. Animal cardiomyocytes are commonly isolated by coronary perfusion with digestive enzymes. However, isolating human cardiomyocytes is challenging because human myocardial specimens usually do not allow for coronary perfusion, and alternative isolation protocols result in poor yields of viable cells. In addition, human myocardial specimens are rare and only regularly available at institutions with on-site cardiac surgery. This hampers the translation of findings from animal to human cardiomyocytes. Described here is a reliable protocol that enables efficient isolation of ventricular myocytes from human and animal myocardium. To increase the surface-to-volume ratio while minimizing cell damage, myocardial tissue slices 300 &#181;m thick are generated from myocardial specimens with a vibratome. Tissue slices are then digested with protease and collagenase. Rat myocardium was used to establish the protocol and quantify yields of viable, calcium-tolerant myocytes by flow-cytometric cell counting. Comparison with the commonly used tissue-chunk method showed significantly higher yields of rod-shaped cardiomyocytes (41.5 &#177; 11.9 vs. 7.89 &#177; 3.6%, p &#60; 0.05). The protocol was translated to failing and non-failing human myocardium, where yields were similar as in rat myocardium and, again, markedly higher than with the tissue-chunk method (45.0 &#177; 15.0 vs. 6.87 &#177; 5.23 cells/mg, p &#60; 0.05). Notably, with the protocol presented it is possible to isolate reasonable numbers of viable human cardiomyocytes (9&#8211;200 cells/mg) from minimal amounts of tissue (&#60;50 mg). Thus, the method is applicable to healthy and failing myocardium from both human and animal hearts. Furthermore, it is possible to isolate excitable and contractile myocytes from human tissue specimens stored for up to 36 h in cold cardioplegic solution, rendering the method particularly useful for laboratories at institutions without on-site cardiac surgery.

Presented is a protocol for the isolation of human and animal ventricular cardiomyocytes from vibratome-cut myocardial slices. High yields of calcium-tolerant cells (up to 200 cells/mg) can be obtained from small amounts of tissue (&#60;50 mg). The protocol is applicable to myocardium exposed to cold ischemia for up to 36 h.

ビブラートムカット心筋切れ切り切れからヒト心室心筋細胞を分離

The isolation of ventricular cardiac myocytes from animal and human hearts is a fundamental method in cardiac research. Animal cardiomyocytes are commonly ...