Este trabalho foi financiado em parte pela Fundação Nacional de Ciência Natural da China (81970265, 81900281,81700288), a Fundação de Pós-Doutorado da China (2019M651904); e o Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento da China (2016YFC1101001, 2017YFC1308105).

As informações relativas aos reagentes e instrumentos comerciais estão listadas na Tabela de Materiais.
A linha de células cardiomiócitos humanas AC16 foi derivada da fusão de células primárias do tecido cardíaco ventricular adulto com fibroblastos humanos transformados em SV4017,que foram comprados da BLUEFBIO (Xangai, China). A linha celular desenvolve muitas características bioquímicas e morfológicas características dos cardiomiócitos. Além disso, a linha celular é amplamente utilizada para avaliar danos do miocárdio e função miocárdio in vitro18,19.
1. Cultura celular
NOTA: O meio de cultura basal consiste no meio de águia modificado de Dulbecco (DMEM), 10% de soro bovino fetal (FBS), 1% suplemento de crescimento de miócito cardíaco e solução de penicilina/estreptomicina de 1%. Armazene o meio a 4 °C e pré-aquecimento a 37 °C antes de usar.
<ol><li>Remova as células criopreservadas de cardiomiócito humano (HCM) do nitrogênio líquido e descongele-as em um banho de água a 37 °C.</li>
	<li>Agite suavemente o frasco (<1 minuto) em um banho de água de 37 °C até que apenas um pequeno pedaço de gelo permaneça no frasco.</li>
	<li>Transfira o frasco para um capô de fluxo laminar estéril. Limpe o lado de fora do frasco com uma bola de algodão mergulhada em 70% de álcool.</li>
	<li>Transfira 4 mL de crescimento completo pré-armado para o tubo de centrífuga contendo as células descongeladas.</li>
	<li>Centrifugar a suspensão da célula a 200 × g por 10 minutos. Após a centrifugação, descarte o supernasce e resuspenque a pelota em 5 mL de meio completo.</li>
	<li>Mantenha as células a 37 °C em uma incubadora umidificada sob uma atmosfera com 95% de ar e 5% de CO2. NOTA: Antes de colher as células para experimentos, as células podem crescer até atingir aproximadamente 60-70% de confluência.</li>
</ol>2. Estabelecimento de um modelo de privação de oxigênio-glicose (OGD)
NOTA: Duas horas antes do período de estudo, substitua o meio de crescimento por meio livre de soro, e as células foram reincidadas em uma incubadora umidificada por 2h a 37 °C sob uma atmosfera com 5% de CO2.
<ol><li>Aspire o meio a partir de uma placa de 6 poços e lave suavemente as células três vezes com soro fisco tamponado de fosfato (PBS).</li>
	<li>Adicione 2 mL de DMEM sem açúcar fresco por poço.</li>
	<li>Cultura as células a uma temperatura constante em uma incubadora de três gáss sob uma atmosfera com uma mistura de 95% N2, 5% CO2, e 0,1% O2 a 37 °C para 1, 2, 4, 8, 12 ou 16 h.</li>
	<li>Após o tratamento da hipóxia, aspire o meio da placa de 6 poços e lave as células com PBS (pH 7.4) três vezes.</li>
	<li>Adicione 2 mL de DMEM completo por poço.</li>
	<li>Mantenha as células a 37 °C em uma incubadora umidificada sob uma atmosfera com 95% de ar e 5% de CO2.</li>
</ol>3. Protocolo de temperatura do tempo
NOTA: Um protocolo padrão de temperatura-hora é usado durante a cirurgia cardíaca, conforme descrito anteriormente por outros20,21. Tratar os HCMs de acordo com o seguinte protocolo (Figura 1): ponto de tempo 1 (T1) indica o fim da indução, o ponto de tempo 2 (T2) indica o fim da manutenção e o ponto de tempo 3 (T3) indica o fim do reaquecimento. Analisar células de controle mantidas em condições normômicas contínuas (37 °C). As condições de temperatura são criadas usando uma incubadora de três gases, que permite uma regulação precisa da temperatura.
<ol><li>Duas horas antes dos experimentos, aspire o meio de cultura a partir de uma placa de 6 poços e adicione 2 mL de DMEM fresco sem soro por poço.</li>
	<li>Rec incubar as células em uma incubadora umidificada por 2h a 37 °C sob uma atmosfera com 5% de CO2.</li>
	<li>Depois de 2h, aspire o meio da placa de 6 poços e lave as células com PBS (pH 7.4) três vezes.</li>
	<li>Adicione 2 mL de DMEM fresco sem soro por poço.</li>
	<li>Reincodute as células da incubadora de três gases. NOTA: Substitua o meio para remover células e detritos não ligados.</li>
	<li>Mude imediatamente a temperatura colocando os pratos da cultura em uma incubadora de três gáss.</li>
	<li>Após 1h de resfriamento, aspire rapidamente o meio da placa de 6 poços e adicione 2 mL de DMEM sem açúcar fresco por poço.</li>
	<li>Cultura as células em uma incubadora de três gases sob uma atmosfera composta por 95% N2, 5% CO2e 0,1% O2 a 37 °C por 12 h para estabelecer hipóxia.</li>
	<li>Defina a temperatura como descrito abaixo. NOTA: O protocolo começa com 10h de tratamento de baixa temperatura, seguido de uma fase de reaquecimento de 2h até 37 °C, e 24h de normotermia (37 °C). Em todos os momentos, três pratos de Petri são removidos para análise.</li>
	<li>Após tratamento de baixa temperatura, aspire o meio da placa de 6 poços e lave com PBS (pH 7.4) três vezes.</li>
	<li>Adicione 2 mL de DMEM completo por poço.</li>
	<li>Mantenha as células a 37 °C em uma incubadora umidificada sob uma atmosfera com 95% de ar e 5% de CO2.</li>
</ol>4. Ensaio de viabilidade CCK-8
<ol><li>Aqueça a solução de 0,25% de trypsin-etilenodiaminetetraactic acid (EDTA) e PBS a 37 °C antes de usar.</li>
	<li>Aspire o meio, enxágue as células com 1 mL de PBS e, em seguida, adicione 0,5 mL de trippsina de 0,25% ao longo da parede do poço. Incubar a 37 °C até que quase todos os HCMs sejam destacados (aproximadamente 1 min).</li>
	<li>Adicione 1 mL de MMEM médio completo aos poços para neutralizar a trippsina.</li>
	<li>Transfira a suspensão celular para um tubo de centrífuga de 15 mL e pelota os HCMs por centrifugação a 500 × g por 3 min. Aspire o supernatante sem perturbar a pelota.</li>
	<li>Dispense 100 alíquotas de μL da suspensão celular (5000 células/bem) em uma placa de 96 poços. Pré-insuse a placa por 24 h em uma incubadora umidificada (a 37 °C.)</li>
	<li>Use as células cultivadas nas placas de 96 poços para gerar diferentes grupos de tratamento.</li>
	<li>Incubar a placa por um período de tempo apropriado (16 h) em uma incubadora.</li>
	<li>Adicione 10 μL de solução CCK-8 a cada poço da placa.</li>
	<li>Incubar a placa por 1 hora na incubadora.</li>
	<li>Meça a absorvância em 450 nm usando um leitor de microplacas. ATENÇÃO: Tenha cuidado para não introduzir bolhas nos poços, pois interferem nas medições de leitura de OD.</li>
</ol>5. Citometria de fluxo para análise de apoptose
<ol><li>Realize etapas de trypsinização e centrifugação seguindo as etapas 4.2-4.4. NOTA: As células são colhidas com trippsina sem EDTA. Para avaliar apoptose, tanto as células flutuantes quanto as aderentes são coletadas.</li>
	<li>Centrifugar as células por 5 minutos a 1000 × g. Descarte o supernatante e resuspenque a pelota em 1 mL de PBS.</li>
	<li>Conte as células usando um hemócito. Usando uma pipeta, transfira 100 μL de suspensão celular tratada com azul trypan para um hemócito. Usando um contador de contagem manual, conte as células ao vivo e sem manutenção em um conjunto de 16 quadrados e, em seguida, use PBS para gerar uma suspensão celular a1×10 7 células/ml.</li>
	<li>Obtenha 200 μL de suspensão celular (5 × 105 -1 × 106 células).</li>
	<li>Centrifugar por 5 min a 1000 × g e resuspensar a pelota na solução de ligação Anexo V-FITC.</li>
	<li>Adicione 5 μL de Anexo V-FITC para tingir as células.</li>
	<li>Adicione 10 μL de iodeto de propídio na suspensão celular.</li>
	<li>Misture suavemente as células e incuba-as por 20 minutos à temperatura ambiente no escuro. NOTA: As células são resuspendidas 2-3 vezes durante a incubação para melhorar a coloração.</li>
	<li>Inicie o citómetro de fluxo e certifique-se de que o software está funcionando adequadamente.</li>
	<li>Abra duas janelas de gráfico de pontos no software de citometria de fluxo.</li>
	<li>Selecione a luz dispersa dianteira (FSC) no eixo X e luz dispersa lateral (SSC) no eixo Y para excluir detritos celulares e/ou aglomerados em termos de seu tamanho e granularidade, respectivamente.</li>
	<li>Selecione o canal de detecção PE (590 mm) e o FITC (530 mm), que é usado para medir a intensidade da fluorescência das células.</li>
	<li>Coloque o tubo de amostra em branco (HCMs que não foram tingidos) no cítmetro de fluxo.</li>
	<li>Clique em Gravar para coletar partículas da suspensão no tubo de amostra em branco e, em seguida, portão da população celular para análise suplementar no primeiro gráfico de pontos.</li>
	<li>Coloque as amostras de uma única mancha no braço de suporte do tubo. Clique em Gravar para coletar partículas da suspensão e, em seguida, portal a população celular para análise suplementar no primeiro gráfico de pontos.</li>
	<li>Colete os HCMs em outros tubos de amostra e otimize a medição ajustando as tensões dos canais de fluorescência. NOTA: Amostras não manchadas e manchadas são usadas como controles de compensação durante o experimento.</li>
	<li>Exiba as estatísticas de cada tubo amostral e calcule a taxa de apoptose de cada amostra.</li>
</ol>6. Avaliação de despolarização mitocondrial
<ol><li>Realize a experimentação e a centrifugação seguindo as etapas 4.2-4.4.</li>
	<li>Resuspenda as células em 500 μL de meio completo e, em seguida, ajuste a densidade celular ajustada para 1 × 105 - 6 × 106 células</li>
	<li>Adicione 0,5 mL de solução de trabalho JC-1 a cada tubo.</li>
	<li>Incubar as células em uma incubadora celular a 37 °C por 20 minutos. NOTA: Durante o período de incubação, adicione 1 mL de 5× tampão de coloração JC-1 a 4 mL de água destilada para preparar o tampão de coloração JC-1.</li>
	<li>Após a incubação, centrifugar as células a 600 × g por 3 min a 4 °C.</li>
	<li>Descarte o supernatante e resuspenque a pelota em 1 mL de tampão de coloração JC-1.</li>
	<li>Repita as etapas 6,5 a 6,6 três vezes.</li>
	<li>Resuspengue os HCMs em 1 mL de tampão de coloração gelada em um tubo de centrífuga de 1,5 mL e use as células para análise dentro de 30 minutos.</li>
	<li>Selecione o canal de detecção PE (590 nm) e o FITC (530 nm) para medir a intensidade de fluorescência do corante JC-1 nas células. NOTA: Configure o citômetro de fluxo seguindo as etapas 5.10-5.17.</li>
</ol>7. Ensaio de espécies reativas de oxigênio
<ol><li>Realize a experimentação e a centrifugação seguindo as etapas 4.2-4.4.</li>
	<li>Manche as células em meio de cultura com 10 μM DCFDA e ajuste a densidade celular para 1 × 106 - 1 × 107 células</li>
	<li>Incubar por 30 minutos a 37 °C.</li>
	<li>Pipeta suavemente as células para cima/para baixo a cada 3-5 minutos.</li>
	<li>Após a incubação, lave as células três vezes com meio de cultura celular livre de soro.</li>
	<li>Analise as células em um citômetro de fluxo seguindo as etapas 5.10-5.17. NOTA: O DCF está animado em 488 nm e a intensidade de emissão medida em 530 nm.</li>
</ol>8. Medição do Caspase 3/ Caspase 8 Atividade
<ol><li>Realize a trypsinização seguindo as etapas 4.2-4.4.</li>
	<li>Colete as células por centrifugação a 600 × g a 4 °C por 5 minutos.</li>
	<li>Adicione 100 μL de tampão de lise por 2 × 106 células.</li>
	<li>Lyse as células por 15 minutos no gelo.</li>
	<li>Depois de incubar por 15 minutos em um banho de gelo, centrifugar a amostra a 1,6 × 104 x g a 4 °C por 15 minutos.</li>
	<li>Transfira o supernatante para um tubo de centrífuga gelado para uso. NOTA: A concentração proteica na amostra deve ser de pelo menos 1-3 mg/mL.</li>
	<li>Remova Ac-DEVD-pNA (2 mM) e coloque-o em um banho de gelo para uso.</li>
	<li>Adicione com precisão 40 μL de solução tampão à placa etiquetada por enzima, adicione 80 μL da amostra e, finalmente, adicione 10 μL de Ac-DEVD-pNA (2 mM).</li>
	<li>Incubar a amostra a 37 °C durante 120 minutos.</li>
	<li>Mediu o valor A405 em um leitor de microplacão de acordo com as instruções do fabricante. NOTA: A absorvância produzida pela pNA gerada pelo caspase-3/caspase-8 é calculada subtraindo o valor A405 do controle em branco do da amostra.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Kim, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+Ischemia+Induces+SDF-1alpha+Release+in+Cardiac+Surgery+Patients.">Myocardial Ischemia Induces SDF-1alpha Release in Cardiac Surgery Patients.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 9 (3), 230-238 (2016).</li><li>Klein, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Less+invasive+ventricular+reconstruction+for+ischaemic+heart+failure.">Less invasive ventricular reconstruction for ischaemic heart failure.</a> EUROPEAN JOURNAL OF HEART FAILURE. 21 (12), 1638-1650 (2019).</li><li>Otto, K. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothermia+protects+H9c2+cardiomyocytes+from+H2O2+induced+apoptosis.">Hypothermia protects H9c2 cardiomyocytes from H2O2 induced apoptosis.</a> Cryobiology. 62 (1), 53-61 (2011).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIF-1alpha/BNIP3+signaling+pathway-induced-autophagy+plays+protective+role+during+myocardial+ischemia-reperfusion+injury.">HIF-1alpha/BNIP3 signaling pathway-induced-autophagy plays protective role during myocardial ischemia-reperfusion injury.</a> BIOMEDICINE &amp; PHARMACOTHERAPY. 120, 109464 (2019).</li><li>An, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exogenous+IL-19+attenuates+acute+ischaemic+injury+and+improves+survival+in+male+mice+with+myocardial+infarction.">Exogenous IL-19 attenuates acute ischaemic injury and improves survival in male mice with myocardial infarction.</a> BRITISH JOURNAL OF PHARMACOLOGY. 176 (5), 699-710 (2019).</li><li>Han, Y. S., Schaible, N., Tveita, T., Sieck, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discontinued+stimulation+of+cardiomyocytes+provides+protection+against+hypothermia-rewarming-induced+disruption+of+excitation-contraction+coupling.">Discontinued stimulation of cardiomyocytes provides protection against hypothermia-rewarming-induced disruption of excitation-contraction coupling.</a> EXPERIMENTAL PHYSIOLOGY. 103 (6), 819-826 (2018).</li><li>Yarbrough, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase+inhibition+attenuates+contractile+dysfunction+following+cardioplegic+arrest+and+rewarming+in+the+setting+of+left+ventricular+failure.">Caspase inhibition attenuates contractile dysfunction following cardioplegic arrest and rewarming in the setting of left ventricular failure.</a> Journal of cardiovascular pharmacology. 44 (6), 645-650 (2004).</li><li>Egorov, Y. V., Glukhov, A. V., Efimov, I. R., Rosenshtraukh, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothermia-induced+spatially+discordant+action+potential+duration+alternans+and+arrhythmogenesis+in+nonhibernating+versus+hibernating+mammals.">Hypothermia-induced spatially discordant action potential duration alternans and arrhythmogenesis in nonhibernating versus hibernating mammals.</a> AMERICAN JOURNAL OF PHYSIOLOGY-HEART AND CIRCULATORY PHYSIOLOGY. 303 (8), 1035-1046 (2012).</li><li>Bobi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderate+Hypothermia+Modifies+Coronary+Hemodynamics+and+Endothelium-Dependent+Vasodilation+in+a+Porcine+Model+of+Temperature+Management.">Moderate Hypothermia Modifies Coronary Hemodynamics and Endothelium-Dependent Vasodilation in a Porcine Model of Temperature Management.</a> Journal of the American Heart Association. 9 (3), 014035 (2020).</li><li>Dietrichs, E. S., Tveita, T., Myles, R., Smith, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+ECG-biomarker+for+cardiac+arrest+during+hypothermia.">A novel ECG-biomarker for cardiac arrest during hypothermia.</a> Scandinavian Journal of Trauma Resuscitation &amp; Emergency Medicine. 28 (1), 27 (2020).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

As complexidades dos animais intactos, incluindo as interações entre diferentes tipos de células, muitas vezes impedem estudos detalhados de componentes específicos da lesão de I/R. Portanto, é necessário estabelecer um modelo de célula in vitro que possa refletir com precisão as mudanças moleculares após a isquemia in vivo. Pesquisas sobre modelos OGD foram relatadas anteriormente13,22, e muitos métodos sofisticados foram estabelecidos<sup class="xre...

A disfunção miocárdica derivada da isquemia/reperfusão é um cenário clínico comum em pacientes após cirurgia cardíaca1,2. Durante a perfusão de baixo fluxo não pulsatile e períodos de parada circulatória total, ainda ocorre danos envolvendo todos os tipos de células cardíacas. Em particular, a sensibilidade dos cardiomiócitos à lesão isquêmica é maior do que a de outras populações celulares. Atualmente, a hipotermia terapêutica (TH) oferece proteção substancial contra um insulto isquêmico esperado em pacientes submetidos à cirurgia cardíaca3,4. O TH é definido como uma temperatura corporal do núcleo de 14-34 °C, embora não exista consenso quanto a uma definição de resfriamento durante a cirurgia cardíaca5,6,7. Em 2013, um painel internacional de especialistas propôs um sistema padronizado de relatórios para classificar várias faixas de temperatura de parada circulatória hipotérmica sistêmica8. Com base em estudos de eletroencefalografia e metabolismo do cérebro, eles dividiram a hipotermia em quatro níveis: hipotermia profunda (≤ 14 °C), hipotermia profunda (14,1-20 °C), hipotermia moderada (20,1-28 °C) e hipotermia leve (28,1-34 °C). O consenso dos especialistas proporcionou uma classificação clara e uniforme, permitindo que os estudos fossem mais comparáveis e proporcionassem resultados mais relevantes clinicamente. Esta proteção proporcionada pelo TH baseia-se em sua capacidade de reduzir a atividade metabólica das células, limitando ainda mais sua taxa de consumo de fosfatos de alta energia9,10. No entanto, o papel do TH na proteção do miocárdio é controverso e pode ter múltiplos efeitos dependendo do grau de hipotermia.
A I/R miocárdio é bem conhecida por ser acompanhada pelo aumento da apoptisecelular 11. Relatórios recentes observaram que a morte programada por cardiomiócito aumenta durante a cirurgia de coração aberto, podendo coincidir com a necrose, aumentando assim o número de células miocárdia mortas12. Portanto, reduzir a apoptose cardiomiócito é uma abordagem terapêutica útil na prática clínica. No modelo de cardiomiócito atrial hl-1 do camundongo, a hipotermia terapêutica foi demonstrada para reduzir a liberação mitocondrial do citocromo c e fator indutor de apoptose (AIF) durante a reperfusão13. No entanto, o efeito da temperatura na regulação da apoptose é controverso e parece depender do grau de hipotermia. Cooper e colegas observaram que, em comparação com um grupo de controle de bypass cardiopulmonar normoérmico, a taxa de apoptose do tecido miocárdio de suínos com a profunda parada circulatória hipotérmica foi aumentada14. Além disso, os resultados de alguns estudos sugerem que hipotermia profunda pode ativar a via da apoptose, enquanto hipotermia menos agressiva parece inibir a via12,15,16. A razão para este resultado pode ser devido aos efeitos confusos associados à lesão isquêmica e à falta de compreensão dos mecanismos pelos quais a temperatura afeta o tecido miocárdio. Portanto, os limites de temperatura nos quais a apoptose é aprimorada ou atenuada devem ser definidos com precisão.
Para se ter uma melhor compreensão dos mecanismos associados à eficácia da hipotermia e fornecer uma base racional para sua implementação em humanos, é essencial identificar uma condição cultural semelhante às condições in vivo que possam produzir danos semelhantes aos observados para a condição clínica de forma reprodutível. Um passo essencial para alcançar esse objetivo é estabelecer as condições ideais para induzir a apoptose cardiomiocócica. Assim, no presente estudo, exploramos os detalhes metodológicos relativos aos experimentos de privação de oxigênio-glicose com células cultivadas, um modelo áxile in vitro de isquemia-reperfusão. Além disso, avaliamos o efeito de diferentes tempos hipoxicos-isquêmicos na apoptose cardiomiófica, e verificamos nossa hipótese quanto ao efeito de diferentes condições de temperatura na apoptose celular in vitro.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Annexin V-FITC cell apoptosis detection kit</td>
			<td>Bio-Technology,China</td>
			<td>C1062M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiac myocyte growth supplement</td>
			<td>Sciencell,USA</td>
			<td>6252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caspase 3 activity assay kit</td>
			<td>Bio-Technology,China</td>
			<td>C1115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caspase 8 activity assay kit</td>
			<td>Bio-Technology,China</td>
			<td>C1151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, no glucose</td>
			<td>Gibco,USA</td>
			<td>11966025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified eagle medium</td>
			<td>Gibco,USA</td>
			<td>11960044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco,USA</td>
			<td>16140071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry</td>
			<td>CytoFLEX,USA</td>
			<td>B49007AF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human myocardial cells</td>
			<td>BLUEFBIO,China</td>
			<td>BFN60808678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1</td>
			<td>Bio-Technology,China</td>
			<td>C2006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin solution</td>
			<td>Gibco,USA</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reactive oxygen species assay kit</td>
			<td>Bio-Technology,China</td>
			<td>S0033S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Three-gas incubator</td>
			<td>Memmert,Germany</td>
			<td>ICO50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Gibco,USA</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro assessment of myocardial protection following hypothermia-preconditioning in a human cardiac myocytes model

A disfunção miocárdica derivada da isquemia/reperfusão é um cenário clínico comum em pacientes após cirurgia cardíaca. Em particular, a sensibilidade dos cardiomiócitos à lesão isquêmica é maior do que a de outras populações celulares. Atualmente, a hipotermia oferece proteção considerável contra um insulto isquêmico esperado. No entanto, as investigações sobre complexas alterações moleculares induzidas por hipotermia permanecem limitadas. Portanto, é essencial identificar uma condição de cultura semelhante às condições in vivo que possam induzir danos semelhantes aos observados na condição clínica de forma reprodutível. Para imitar condições semelhantes à isquemia in vitro, as células nesses modelos foram tratadas por privação de oxigênio/glicose (OGD). Além disso, aplicamos um protocolo padrão de temperatura de tempo usado durante a cirurgia cardíaca. Além disso, propomos uma abordagem para utilizar um método simples, mas abrangente, para a análise quantitativa da lesão do miocárdio. Os níveis de apoptose e expressão das proteínas associadas à apoptose foram avaliados por citometria de fluxo e utilizando um kit ELISA. Neste modelo, testamos uma hipótese sobre os efeitos de diferentes condições de temperatura na apoptose cardiomiócito in vitro. A confiabilidade deste modelo depende de rigoroso controle de temperatura, procedimentos experimentais controláveis e resultados experimentais estáveis. Além disso, este modelo pode ser usado para estudar o mecanismo molecular da cardioproteção hipotérmica, que pode ter implicações importantes para o desenvolvimento de terapias complementares para uso com hipotermia.

O efeito da exposição ao OGD na viabilidade dos HCMs foi determinado pelo ensaio CCK-8. Em comparação com o observado no grupo controle, a viabilidade celular foi significativamente diminuída de forma dependente do tempo(Figura 2A). As taxas de apoptose de HCMs em diferentes horários após a reperfusão apresentaram tendência específica, onde de 0 a 16 h, as taxas de apoptose aumentaram gradualmente e atingiram a taxa máxima no ponto de tempo de 16h(Figura 2B).<...

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In vitro Assessment of Myocardial Protection following Hypothermia-Preconditioning in a Human Cardiac Myocytes Model

Os efeitos distintos de diferentes graus de hipotermia na proteção do miocárdio não foram minuciosamente avaliados. O objetivo do presente estudo foi quantificar os níveis de morte celular após diferentes tratamentos de hipotermia em um modelo baseado em cardiomiócito humano, estabelecendo as bases para futuras pesquisas moleculares aprofundadas.

Avaliação in vitro da proteção do miocárdio após hipotermia-pré-condicionamento em um modelo de miócitos cardíacos humanos

Ischemia/reperfusion-derived myocardial dysfunction is a common clinical scenario in patients after cardiac surgery. In particular, the sensitivity of ...

in-vitro-assessment-myocardial-protection-following-hypothermia

Research

JoVE Journal

Medicine

2.9K visualizações.  Children's Hospital of Nanjing Medical University. Os efeitos distintos de diferentes graus de hipotermia na proteção do miocárdio não foram minuciosamente avaliados. O objetivo do presente estudo foi quantificar os níveis de morte celular após diferentes tratamentos de hipotermia em um modelo baseado em cardiomiócito humano, estabelecendo as bases para futuras pesquisas moleculares aprofundadas.

Vídeo: In vitro Assessment of Myocardial Protection following Hypothermia-Preconditioning in a Human Cardiac Myocytes Model

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and finding new sources for implantable cells are the focus of recent research4,5. Investigating the effectiveness of cell therapies is not an easy task and new tools are needed to investigate the mechanisms involved in the treatment process6. We designed an experimental protocol of ischemia/reperfusion in order to allow the observation of cellular connections and even subcellular mechanisms during ischemia/reperfusion injury and after stem cell transplantation and to evaluate the efficacy of cell therapy. H9c2 cardiomyoblast cells were placed onto cell culture plates7,8. Ischemia was simulated with 150 minutes in a glucose free medium with oxygen level below 0.5%. Then, normal media and oxygen levels were reintroduced to simulate reperfusion. After oxygen glucose deprivation, the damaged cells were treated with transplantation of labeled human bone marrow derived mesenchymal stem cells by adding them to the culture. Mesenchymal stem cells are preferred in clinical trials because they are easily accessible with minimal invasive surgery, easily expandable and autologous. After 24 hours of co-cultivation, cells were stained with calcein and ethidium-homodimer to differentiate between live and dead cells. This setup allowed us to investigate the intercellular connections using confocal fluorescent microscopy and to quantify the survival rate of postischemic cells by flow cytometry. Confocal microscopy showed the interactions of the two cell populations such as cell fusion and formation of intercellular nanotubes. Flow cytometry analysis revealed 3 clusters of damaged cells which can be plotted on a graph and analyzed statistically. These populations can be investigated separately and conclusions can be drawn on these data on the effectiveness of the simulated therapeutical approach.

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

We demonstrate how to set up an in vitro ischemia/reperfusion model and how to evaluate the effect of stem cell therapy on postischemic cardiac cells.

Transplante de Células-tronco em um In vitro Modelo de isquemia / reperfusão Simulated

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and ...

Medicina

Assessment of Cardiac Function and Myocardial Morphology Using Small Animal Look-locker Inversion Recovery (SALLI) MRI in Rats

Small animal magnetic resonance imaging is an important tool to study cardiac function and changes in myocardial tissue. The high heart rates of small animals (200 to 600 beats/min) have previously limited the role of CMR imaging. Small animal Look-Locker inversion recovery (SALLI) is a T1 mapping sequence for small animals to overcome this problem 1. T1 maps provide quantitative information about tissue alterations and contrast agent kinetics. It is also possible to detect diffuse myocardial processes such as interstitial fibrosis or edema 1-6. Furthermore, from a single set of image data, it is possible to examine heart function and myocardial scarring by generating cine and inversion recovery-prepared late gadolinium enhancement-type MR images 1.
	The presented video shows step-by-step the procedures to perform small animal CMR imaging. Here it is presented with a healthy Sprague-Dawley rat, however naturally it can be extended to different cardiac small animal models.

Assessment of Cardiac Function and Myocardial Morphology Using Small Animal Look-locker Inversion Recovery SALLI MRI in Rats

Contrast enhanced cardiac magnetic resonance (CMR) imaging allows comprehensive in vivo assessment of the heart in small animal models of cardiovascular disease. Here we detail the procedures to perform CMR imaging, reconstruction and analysis using Small Animal Lock-Locker Inversion Recovery (SALLI) in rats.

Avaliação da função cardíaca e Morfologia do miocárdio Usando Pequenos Animais Inversion Recovery Olha-locker (SALLI) MRI em ratos

Small animal magnetic resonance  imaging is an important tool to study cardiac function and changes in myocardial  tissue. The high heart rates of small ...

Myocardial Infarction and Functional Outcome Assessment in Pigs

Introduction of newly discovered cardiovascular therapeutics into first-in-man trials depends on a strictly regulated ethical and legal roadmap. One important prerequisite is a good understanding of all safety and efficacy aspects obtained in a large animal model that validly reflect the human scenario of myocardial infarction (MI). Pigs are widely used in this regard since their cardiac size, hemodynamics, and coronary anatomy are close to that of humans. Here, we present an effective protocol for using the porcine MI model using a closed-chest coronary balloon occlusion of the left anterior descending artery (LAD), followed by reperfusion. This approach is based on 90 min of myocardial ischemia, inducing large left ventricle infarction of the anterior, septal and inferoseptal walls. Furthermore, we present protocols for various measures of outcome that provide a wide range of information on the heart, such as cardiac systolic and diastolic function, hemodynamics, coronary flow velocity, microvascular resistance, and infarct size. This protocol can be easily tailored to meet study specific requirements for the validation of novel cardioregenerative biologics at different stages (i.e. directly after the acute ischemic insult, in the subacute setting or even in the chronic MI once scar formation has been completed). This model therefore provides a useful translational tool to study MI, subsequent adverse remodeling, and the potential of novel cardioregenerative agents.

This protocol describes the porcine myocardial infarction (MI) model using a 90 min closed-chest coronary balloon occlusion of the left anterior descending artery (LAD), followed by reperfusion. Furthermore, the protocol for several outcome parameters, such as cardiac function, hemodynamics, microvascular resistance, and infarct size, are also presented.

Infarto do Miocárdio e Avaliação de Resultados Funcional em porcos

Introduction of newly discovered cardiovascular therapeutics into first-in-man trials depends on a strictly regulated ethical and legal roadmap. One ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As such, primary or &#39;neuronal-like&#39; cell culture systems are commonly utilized. While&#160;these systems are relatively easy to work with, and are useful model systems in which various functional outcomes (such as cell death) can be readily quantified, the examined outcomes and pathways in cultured immature neurons (such as excitotoxicity-mediated cell death pathways) are not necessarily the same as those observed in mature brain, or in intact tissue. Therefore, there is the need to develop models in which cellular mechanisms in mature neural tissue can be examined. We have developed an in vitro technique that can be used to investigate a variety of molecular pathways in intact nervous tissue. The technique described herein utilizes rat cortical tissue, but this technique can be adapted to use tissue from a variety of species (such as mouse, rabbit, guinea pig, and chicken) or brain regions (for example, hippocampus, striatum, etc.). Additionally, a variety of stimulations/treatments can be used (for example, excitotoxic, administration of inhibitors, etc.). In conclusion, the brain slice model described herein can be used to examine a variety of molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

We have developed a brain slice model which can be used to examine molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.&#160;This technique generates viable mature brain tissue and reduces animal numbers required for experimentation, whilst keeping the neuronal circuitry, cellular interactions, and postsynaptic compartments partly intact.

Excitotóxico Estimulação do Microslices cérebro como um<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo de AVC

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Primary Outcome Assessment in a Pig Model of Acute Myocardial Infarction

Mortality after acute myocardial infarction remains substantial and is associated with significant morbidity, like heart failure. Novel therapeutics are therefore required to confine cardiac damage, promote survival and reduce the disease burden of heart failure. Large animal experiments are an essential part in the translational process from experimental to clinical therapies. To optimize clinical translation, robust and representative outcome measures are mandatory. The present manuscript aims to address this need by describing the assessment of three clinically relevant outcome modalities in a pig acute myocardial infarction (AMI) model: infarct size in relation to area at risk (IS/AAR) staining, 3-dimensional transesophageal echocardiography (TEE) and admittance-based pressure-volume (PV) loops. Infarct size is the main determinant driving the transition from AMI to heart failure and can be quantified by IS/AAR staining. Echocardiography is a reliable and robust tool in the assessment of global and regional cardiac function in clinical cardiology. Here, a method for three-dimensional transesophageal echocardiography (3D-TEE) in pigs is provided. Extensive insight into cardiac performance can be obtained by admittance-based pressure-volume (PV) loops, including intrinsic parameters of myocardial function that are pre- and afterload independent. Combined with a clinically feasible experimental study protocol, these outcome measures provide researchers with essential information to determine whether novel therapeutic strategies could yield promising targets for future testing in clinical studies.

Reliable and accurate outcome assessment is the key for translation of preclinical therapies into clinical treatment. The current paper describes how to assess three clinically relevant primary outcome parameters of cardiac performance and damage in a pig acute myocardial infarction model.

Avaliação do resultado principal em um modelo suíno de Infarto Agudo do Miocárdio

Mortality after acute myocardial infarction remains substantial and is associated with significant morbidity, like heart failure. Novel therapeutics are ...

Myocardial Infarction in Neonatal Mice, A Model of Cardiac Regeneration

Myocardial infarction induced by coronary artery ligation has been used in many animal models as a tool to study the mechanisms of cardiac repair and regeneration, and to define new targets for therapeutics. For decades, models of complete heart regeneration existed in amphibians and fish, but a mammalian counterpart was not available. The recent discovery of a postnatal window during which mice possess regenerative capabilities has led to the establishment of a mammalian model of cardiac regeneration. A surgical model of mammalian cardiac regeneration in the neonatal mouse is presented herein. Briefly, postnatal day 1 (P1) mice are anesthetized by isoflurane and placed on an ice pad to induce hypothermia. After the chest is opened, and the left anterior descending coronary artery (LAD) is visualized, a suture is placed around the LAD to inflict myocardial ischemia in the left ventricle. The surgical procedure takes 10-15 min. Visualizing the coronary artery is crucial for accurate suture placement and reproducibility. Myocardial infarction and cardiac dysfunction are confirmed by triphenyl-tetrazolium chloride (TTC) staining and echocardiography, respectively. Complete regeneration 21 days post myocardial infarction is verified by histology. This protocol can be used to as a tool to elucidate mechanisms of mammalian cardiac regeneration after myocardial infarction.

This protocol describes a highly reproducible model of cardiac regeneration by surgical induction of myocardial infarction in the left ventricle of postnatal day 1 mice. The method involves induction of hypothermic anesthesia and ligation of the left anterior descending coronary artery.

Infarto do miocárdio em ratos neonatais, um modelo de regeneração cardíaca

Myocardial infarction induced by coronary artery ligation has been used in many animal models as a tool to study the mechanisms of cardiac repair and ...

A Flow Cytometry-based Assay for Measuring Mitochondrial Membrane Potential in Cardiac Myocytes After Hypoxia/Reoxygenation

Timely and efficient reperfusion of the occluded coronary artery is the best strategy for decreasing myocardial infarct size in patients with a ST-segment elevated myocardial infarction. However, reperfusion per se can result in further cardiomyocyte death, a phenomenon known as reperfusion injury. The opening of the mitochondrial permeability transition pore (mPTP), with the decrease of the mitochondrial membrane potential (MMP), or mitochondrial depolarization, is universally recognized as the final step of reperfusion injury and is responsible for mitochondrial and cardiomyocyte death. JC-1 is a lipophilic cationic dye that accumulates in mitochondria depending on the value of MMP. The higher the MMP is, the more JC-1 accumulates in the mitochondria. The increasing amounts of JC-1 in mitochondria can be reflected by a fluorescence emission shift from green (~530 nm) to red (~590 nm). Therefore, the reduction of the red/green fluorescence intensity ratio can indicate the depolarization of mitochondria. Here, we take advantage of JC-1 to measure MMP, or the opening of mPTP in human cardiac myocytes after hypoxia/reoxygenation, detected by flow cytometry.

Here, we present a protocol that uses JC-1 dye to assess the mitochondrial membrane potential of cells after being exposed to hypoxia/reoxygenation with or without a protective agent.

Um ensaio de baseados em citometria de fluxo para medir o potencial de membrana mitocondrial em miócitos após hipóxia/reoxigenação

Timely and efficient reperfusion of the occluded coronary artery is the best strategy for decreasing myocardial infarct size in patients with a ST-segment ...

Implantation of hiPSC-derived Cardiac-muscle Patches after Myocardial Injury in a Guinea Pig Model

Due to the limited regeneration capacity of the heart in adult mammals, myocardial infarction results in an irreversible loss of cardiomyocytes. This loss of relevant amounts of heart muscle mass can lead to the heart failure. Besides heart transplantation, there is no curative treatment option for the end-stage heart failure. In times of organ donor shortage, organ independent treatment modalities are needed. Left-ventricular assist devices are a promising therapy option, however, especially as destination therapy, limited by its side-effects like stroke, infections and bleedings. In recent years, several cardiac repair strategies including stem cell injection, cardiac progenitors or myocardial tissue engineering have been investigated. Recent improvements in cell biology allow for the differentiation of large amounts of cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells (iPSC). One of the cardiac repair strategies currently under evaluation is to transplant artificial heart tissue. Engineered heart tissue (EHT) is a three-dimensional in vitro created cardiomyocyte network, with functional properties of native heart tissue. We have created EHT-patches from hiPSC derived cardiomyocytes. Here we present a protocol for the induction of left ventricular myocardial cryoinjury in a guinea pig, followed by implantation of hiPSC derived EHT on the left ventricular wall.

Here we present a protocol for the induction of left ventricular cryoinjury followed by the implantation of a cardiac muscle patch, derived from human iPS-cell cardiomyocytes in a guinea pig model.

Implantação de Patches hiPSC-derivado do músculo cardíaco após lesão miocárdica em um modelo de cobaia

Due to the limited regeneration capacity of the heart in adult mammals, myocardial infarction results in an irreversible loss of cardiomyocytes. This loss ...

Isolation of Atrial Myocytes from Adult Mice

The electrophysiological properties of atrial myocytes importantly affect overall cardiac function. Alterations in the underlying ionic currents responsible for the action potential can cause pro-arrhythmic substrates that underlie arrhythmias, such as atrial fibrillation, which are highly prevalent in many conditions and disease states. Isolating adult mouse atrial cardiomyocytes for use in patch-clamp experiments has greatly advanced our knowledge and understanding of the cellular electrophysiology in the healthy atrial myocardium and in the setting of atrial pathophysiology. In addition, studies using genetic mouse models have elucidated the role of a vast array of proteins in regulating atrial electrophysiology. Here we provide a detailed protocol for the isolation of cardiomyocytes from the atrial appendages of adult mice using a combination of enzymatic digestion and mechanical dissociation of these tissues. This approach consistently and reliably yields isolated atrial cardiomyocytes that can then be used to characterize cellular electrophysiology by measuring action potentials and ionic currents in patch-clamp experiments under a number of experimental conditions.

This protocol is used to isolate single atrial cardiomyocytes from the adult mouse heart using a chunk digestion approach. This approach is used to isolate right or left atrial myocytes that can be used to characterize atrial myocyte electrophysiology in patch-clamp studies.

Isolamento de miócitos atriais de camundongos adultos

The electrophysiological properties of atrial myocytes importantly affect overall cardiac function. Alterations in the underlying ionic currents ...

In Vitro Assessment of Cardiac Function Using Skinned Cardiomyocytes

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring apparatus and a motor to perform functional studies. These studies will allow measurement of cardiomyocyte stiffness (passive force) and its activation with different calcium (Ca2+)-containing solutions to determine, amongst others: maximum force development, myofilament Ca2+-sensitivity (pCa50), cooperativity (nHill) and the rate of force redevelopment (ktr). This method also enables determination of the effects of drugs acting directly on myofilaments and of the expression of exogenous recombinant proteins on both active and passive properties of cardiomyocytes. Clinically, skinned cardiomyocyte studies highlight the pathophysiology of many myocardial diseases and allow in vitro assessment of the impact of therapeutic interventions targeting the myofilaments. Altogether, this technique enables the clarification of cardiac pathophysiology by investigating correlations between in vitro and in vivo parameters in animal models and human tissue obtained during open heart or transplant surgery.

This protocol aims to describe step-by-step the technique of extraction and assessment of cardiac function using skinned cardiomyocytes. This methodology allows measurement and acutemodulation of myofilament function using small frozen biopsies that can be collected from different cardiac locations, from mice to men.

Avaliação in vitro da função cardíaca usando cardiomócitos esfolados

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring ...