Bu çalışma kısmen Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81970265, 81900281,81700288), Çin Doktora Sonrası Bilim Vakfı (2019M651904) tarafından finanse edildi; ve Çin Ulusal Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programı (2016YFC1101001, 2017YFC1308105).

Ticari reaktifler ve aletlerle ilgili bilgiler Malzeme Tablosundalistelenmiştir.
AC16 insan kardiyomiyosit hücre hattı, yetişkin ventrikül kalp dokusundan birincil hücrelerin BLUEFBIO'dan (Şanghay, Çin) satın alınan SV40 dönüştürülmüş insan fibroblastları17ile füzyonundan türetilmiştir. Hücre hattı kardiyomiyositlerin karakteristik birçok biyokimyasal ve morfolojik özelliğini geliştirir. Ek olarak, hücre hattı miyokard hasarını ve miyokard fonksiyonunu değerlendirmek için yaygın olarak kullanılır in vitro18,19.
1. Hücre kültürü
NOT: Bazal kültür ortamı serumsuz Dulbecco'nun modifiye Eagle medium (DMEM), %10 fetal sığır serumu (FBS), %1 kardiyak miyozit büyüme takviyesi ve %1 penisilin/streptomisin çözeltisi içerir. Ortamı kullanmadan önce 4 °C'de ve ön ısıtmadan 37 °C'ye saklayın.
<ol><li>Kriyoprezer korunmuş insan kardiyomiyosit (HCM) hücrelerini sıvı azottan çıkarın ve 37 °C'de bir su banyosunda çözün.</li>
	<li>Şişeyi (<1 dakika) 37 °C'lik bir su banyosunda şişenin içinde sadece küçük bir buz parçası kalana kadar hafifçe sallayın.</li>
	<li>Şişeyi steril bir laminar akış başlığına aktarın. Şişenin dışını% 70 alkole batırılmış bir pamuk topu ile silin.</li>
	<li>4 mL önceden ısıtılmamış komple büyüme ortamını, çözülmüş hücreleri içeren santrifüj tüpüne damla yönünde aktarın.</li>
	<li>Hücre süspansiyonu 10 dakika boyunca 200 × g'da santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı atın ve peletin 5 mL'lik tam orta olarak yeniden ıslatın.</li>
	<li>Hücreleri% 95 hava ve% 5 CO2ile bir atmosfer altında nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de koruyun. NOT: Deneyler için hücreleri toplamadan önce, hücrelerin yaklaşık% 60-70 izdiah edene kadar büyümesine izin verilir.</li>
</ol>2. Oksijen-glukoz yoksunluğu (OGD) modelinin kurulması
NOT: Çalışma döneminden iki saat önce, büyüme ortamını serumsuz ortamla değiştirin ve hücreler% 5CO2 ile bir atmosfer altında 37 ° C'de 2 saat boyunca nemlendirilmiş bir inkübatörde yeniden kapatıldı.
<ol><li>Ortamı 6 kuyulu bir plakadan emiş ve hücreleri fosfat tamponlu salin (PBS) ile üç kez hafifçe yıkayın.</li>
	<li>Kuyu başına 2 mL taze şekersiz DMEM ekleyin.</li>
	<li>Hücreleri bir atmosfer altında üç gazlı bir inkübatörde% 95 N 2 , % 5 CO 2 ve 1,2,4, 8,12veya 16 saat boyunca 37 ° C'de% 0.1 O 2 karışımı ile sabit bir sıcaklıkta kültürleyin.</li>
	<li>Hipoksi tedavisinden sonra, ortamı 6 kuyulu plakadan aspire edin ve hücreleri PBS (pH 7.4) ile üç kez yıkayın.</li>
	<li>Kuyu başına 2 mL tam DMEM ekleyin.</li>
	<li>Hücreleri% 95 hava ve% 5 CO2ile bir atmosfer altında nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de koruyun.</li>
</ol>3. Zaman sıcaklığı protokolü
NOT: Kalp cerrahisi sırasında daha önce diğerleri tarafından açıklandığı gibi standart bir zaman sıcaklığı protokolü kullanılır20,21. HCM'leri aşağıdaki protokole göre tedavi edin (Şekil 1): zaman noktası 1 (T1) indüksiyonun sonunu, zaman noktası 2 (T2) bakımın sonunu ve zaman noktası 3 (T3) yeniden ısıtmanın sonunu gösterir. Sürekli normotermik koşullar altında tutulan kontrol hücrelerini analiz edin (37 °C). Sıcaklık koşulları, hassas sıcaklık düzenlemesine izin veren bir üç gaz inkübatörü kullanılarak oluşturulur.
<ol><li>Deneylerden iki saat önce, kültür ortamını 6 kuyulu bir plakadan epire edin ve kuyu başına 2 mL taze serumsuz DMEM ekleyin.</li>
	<li>Hücreleri% 5 CO 2 ile bir atmosfer altında 37 ° C'de 2 saat boyunca nemlendirilmiş bir inkübatördeyenideninkübatör.</li>
	<li>2 saat sonra, ortamı 6 kuyulu plakadan aspire edin ve hücreleri PBS (pH 7.4) ile üç kez yıkayın.</li>
	<li>Kuyu başına 2 mL taze serumsuz DMEM ekleyin.</li>
	<li>Üç gazlı inkübatördeki hücreleri yeniden kuluçkaya yatırın. NOT: Eklenmemiş hücreleri ve kalıntıları kaldırmak için ortamı değiştirin.</li>
	<li>Kültür yemeklerini üç gazlı bir inkübatör yerleştirerek sıcaklığı hemen değiştirin.</li>
	<li>1 saat soğudktan sonra, ortamı 6 kuyulu plakadan hızlı bir şekilde aspire edin ve kuyu başına 2 mL taze şekersiz DMEM ekleyin.</li>
	<li>Hipoksiyi kurmak için 37 °C'de %95 N 2 ,%5CO 2 ve%0,1O2'den oluşan bir atmosfer altında üç gazlı inkübatördeki hücreleri kültüre edin.</li>
	<li>Sıcaklığı aşağıda açıklandığı gibi ayarlayın. NOT: Protokol, düşük sıcaklıklı bir tedavinin 10 h'si ile başlar, ardından 2 h ila 37 °C ve 24 saat normotermi (37 °C) için yeniden ısıtma aşaması ile başlar. Her zaman noktasında, analiz için üç Petri kabı çıkarılır.</li>
	<li>Düşük sıcaklık tedavisinden sonra, ortamı 6 kuyulu plakadan aspire edin ve PBS (pH 7.4) ile üç kez yıkayın.</li>
	<li>Kuyu başına 2 mL tam DMEM ekleyin.</li>
	<li>Hücreleri% 95 hava ve% 5 CO2ile bir atmosfer altında nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de koruyun.</li>
</ol>4. CCK-8 uygulanabilirlik tahlilleri
<ol><li>Kullanmadan önce %0,25 tripsin-etylenediaminetetraasetik asit (EDTA) çözeltisini ve PBS'yi 37 °C'ye ısıtın.</li>
	<li>Ortamı aspire edin, hücreleri 1 mL PBS ile durulayın ve ardından kuyunun duvarı boyunca% 0,25 tripsin 0,5 mL ekleyin. Hemen hemen tüm HCM'ler ayrılana kadar 37 °C'de kuluçkaya yaslanın (yaklaşık 1 dk).</li>
	<li>Tripsin nötralize etmek için kuyulara 1 mL DMEM komple orta ekleyin.</li>
	<li>Hücre süspansiyonunu 15 mL santrifüj tüpüne aktarın ve HCM'leri 3 dakika boyunca 500 × g'da santrifüjleme ile pelet edin. Peletin rahatsız etmeden süpernatantı aspire edin.</li>
	<li>Hücre süspansiyonunun 100 μL'lik aliquotlarını (5000 hücre/kuyu) 96 kuyu plakasına dağıtın. Plakayı nemlendirilmiş bir inkübatörde (37 °C'de) 24 saat önceden kesin.</li>
	<li>Farklı tedavi grupları oluşturmak için 96 kuyu plakalarındaki kültürlü hücreleri kullanın.</li>
	<li>Plakayı bir inkübatörde uygun bir süre (16 saat) kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Plakanın her kuyusuna 10 μL CCK-8 çözeltisi ekleyin.</li>
	<li>Plakayı inkübatörde 1 saat kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Bir mikro plaka okuyucu kullanarak emiciliği 450 nm'de ölçün. DİkKAT: OD okuma ölçümlerine müdahale ettikleri için kuyulara kabarcık sokmamaya dikkat edin.</li>
</ol>5. Apoptoz analizi için akış sitometrisi
<ol><li>4.2-4.4 adımlarını izleyerek trypsinization ve santrifüjleme adımlarını gerçekleştirin. NOT: Hücreler EDTA olmadan tripsin ile toplanır. Apoptrozu değerlendirmek için hem yüzen hem de yapışan hücreler toplanır.</li>
	<li>Hücreleri 1000 × g'da 5 dakika santrifüj edin. Süpernatant atın ve peleti 1 mL PBS'de yeniden atın.</li>
	<li>Hemositometre kullanarak hücreleri sayın. Bir pipet kullanarak, 100 μL Trypan Mavi işlem görmüş hücre süspansiyonu hemositometreye aktarın. Bir el çetele sayacı kullanarak, canlı, lekelenmemiş hücreleri 16 karelik bir kümede sayın ve sonra PBS'yi kullanarak 1×107 hücre/ml'de bir hücre süspansiyonu oluşturun.</li>
	<li>Hücre süspansiyonunun 200 μL'× elde edin (5 ×10 5 -1 × 106 hücre).</li>
	<li>1000 g'da 5 dakika santrifüj × ve peletin Ek V-FITC bağlama çözeltisinde yeniden kullanın.</li>
	<li>Hücreleri boyamak için 5 μL Annexin V-FITC ekleyin.</li>
	<li>Hücre süspansiyonuna 10 μL propidium iyodür ekleyin.</li>
	<li>Hücreleri hafifçe karıştırın ve karanlıkta oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya yatırın. NOT: Lekelenmeyi iyileştirmek için hücreler kuluçka sırasında 2-3 kez yeniden biriktirilir.</li>
	<li>Akış sitometresini başlatın ve yazılımın uygun şekilde çalıştığından emin olun.</li>
	<li>Akış sitometri yazılımında iki nokta çizim penceresi açın.</li>
	<li>Hücre kalıntılarını ve/veya kümeleri sırasıyla boyutları ve tanecikleri açısından dışlamak için X ekseninde öne dağılmış ışığı (FSC) ve Y eksenindeki yan dağınık ışığı (SSC) seçin.</li>
	<li>Hücrelerin floresan yoğunluğunu ölçmek için kullanılan PE (590 mm) algılama kanalını ve FITC'yi (530 mm) seçin.</li>
	<li>Boş (boyanmamış HCM'ler) numune tüpünü akış sitometresine yerleştirin.</li>
	<li>Boş örnek tüpteki süspansiyondan parçacık toplamak için Kaydet'i tıklatın ve sonra ilk nokta çiziminde daha fazla analiz için hücre popülasyonunun kapısını kapatın.</li>
	<li>Tek lekeli numuneleri tüp destek koluna yerleştirin. Süspansiyondan parçacık toplamak için Kaydet'i tıklatın ve sonra ilk nokta çiziminde daha fazla analiz için hücre popülasyonunun kapısını girin.</li>
	<li>Diğer numune tüplerindeki HCM'leri toplayın ve floresan kanallarının voltajlarını ayarlayarak ölçümü optimize edin. NOT: Deney sırasında kompanzasyon kontrolü olarak lekesiz ve tek lekeli numuneler kullanılır.</li>
	<li>Her numune tüpünün istatistiklerini görüntüleyin ve her numunenin kesme oranı hesaplayın.</li>
</ol>6. Mitokondriyal depolarizasyon değerlendirmesi
<ol><li>4.2-4.4 adımlarını izleyerek trypsinization ve santrifüjleme gerçekleştirin.</li>
	<li>Hücreleri 500 μL tam ortamda yeniden biriktirin ve ardından 1 × 105 - 6 × 106 hücreye ayarlanmış hücre yoğunluğunu ayarlayın</li>
	<li>Her tüpe 0,5 mL JC-1 çalışma çözümü ekleyin.</li>
	<li>Hücreleri 37 °C'de bir hücre inkübatöründe 20 dakika kuluçkaya yatırın. NOT: Kuluçka süresi boyunca, JC-1 boyama tamponunu hazırlamak için 4 mL damıtılmış suya 1 mL 5× JC-1 boyama tamponu ekleyin.</li>
	<li>Kuluçkadan sonra, hücreleri 600 × g'da 4 °C'de 3 dakika santrifüj edin.</li>
	<li>Süpernatant atın ve peletin 1 mL JC-1 boyama tamponunda yeniden süzülür.</li>
	<li>6,5 ile 6,6 olan adımları üç kez yineleyin.</li>
	<li>HCM'leri 1,5 mL santrifüj tüpünde 1 mL buz gibi boyama tamponunda yeniden kullanın ve hücreleri 30 dakika içinde analiz için kullanın.</li>
	<li>Hücrelerdeki JC-1 boyasının floresan yoğunluğunu ölçmek için PE (590 nm) algılama kanalını ve FITC'yi (530 nm) seçin. NOT: 5.10-5.17 adımlarını izleyerek akış sitometresini ayarlayın.</li>
</ol>7. Reaktif oksijen türleri tahlili
<ol><li>4.2-4.4 adımlarını izleyerek trypsinization ve santrifüjleme gerçekleştirin.</li>
	<li>Kültür ortamındaki hücreleri 10 μM DCFDA ile lekelenin ve hücre yoğunluğunu 1 × 10 6 -1 × 107 hücreye ayarlayın</li>
	<li>37 °C'de 30 dakika kuluçkaya yaslanın.</li>
	<li>Hücreleri her 3-5 dakikada bir yavaşça yukarı / aşağı borulayın.</li>
	<li>Kuluçkadan sonra hücreleri serumsuz hücre kültürü ortamı ile üç kez yıkayın.</li>
	<li>5.10-5.17 adımlarını izleyerek akış sitometresti üzerindeki hücreleri analiz edin. NOT: DCF 488 nm'de heyecanlanır ve emisyon yoğunluğu 530 nm olarak ölçülür.</li>
</ol>8. Caspase Ölçümü 3/ Caspase 8 Aktivitesi
<ol><li>4.2-4.4 adımlarını izleyerek trypsinization gerçekleştirin.</li>
	<li>Hücreleri 5 dakika boyunca 4 °C'de 600 × g'da santrifüjleme ile toplayın.</li>
	<li>2 × 106 hücre başına 100 μL lysate tampon ekleyin.</li>
	<li>Hücreleri buzda 15 dakika boyunca yalım.</li>
	<li>Bir buz banyosunda 15 dakika kuluçkaya yatırtıktan sonra, numuneyi 15 dakika boyunca 4 °C'de1,6 × 10 4 x g'da santrifüjleyin.</li>
	<li>Süpernatantı kullanmak için buz gibi bir santrifüj tüpüne aktarın. NOT: Numunedeki protein konsantrasyonu en az 1-3 mg/mL olmalıdır.</li>
	<li>Ac-DEVD-pNA'yı (2 mM) çıkarın ve kullanmak için bir buz banyosuna yerleştirin.</li>
	<li>Enzim etiketli plakaya doğru bir şekilde 40 μL tampon çözeltisi ekleyin, numunenin 80 μL'sini ekleyin ve son olarak 10 μL Ac-DEVD-pNA (2 mM) ekleyin.</li>
	<li>Numuneyi 37 °C'de 120 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Üreticinin talimatlarına göre bir mikro plaka okuyucusunda A405 değeri ölçüldü. NOT: Caspase-3/caspase-8 tarafından üretilen pNA tarafından üretilen absorbans, boş kontrolün A405 değeri numuneninkinden çıkarılarak hesaplanır.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Kim, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+Ischemia+Induces+SDF-1alpha+Release+in+Cardiac+Surgery+Patients.">Myocardial Ischemia Induces SDF-1alpha Release in Cardiac Surgery Patients.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 9 (3), 230-238 (2016).</li><li>Klein, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Less+invasive+ventricular+reconstruction+for+ischaemic+heart+failure.">Less invasive ventricular reconstruction for ischaemic heart failure.</a> EUROPEAN JOURNAL OF HEART FAILURE. 21 (12), 1638-1650 (2019).</li><li>Otto, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+hypothermia+applicable+to+cardiac+surgery.">Therapeutic hypothermia applicable to cardiac surgery.</a> VETERINARY ANAESTHESIA AND ANALGESIA. 42 (6), 559-569 (2015).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+of+Hypothermic+Circulatory+Arrest+During+Unilateral+Antegrade+Cerebral+Perfusion+for+Aortic+Arch+Surgery.">Safety of Hypothermic Circulatory Arrest During Unilateral Antegrade Cerebral Perfusion for Aortic Arch Surgery.</a> CANADIAN JOURNAL OF CARDIOLOGY. 35 (11), 1483-1490 (2019).</li><li>Leshnower, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderate+Versus+Deep+Hypothermia+With+Unilateral+Selective+Antegrade+Cerebral+Perfusion+for+Acute+Type+A+Dissection.">Moderate Versus Deep Hypothermia With Unilateral Selective Antegrade Cerebral Perfusion for Acute Type A Dissection.</a> ANNALS OF THORACIC SURGERY. 100 (5), 1563-1568 (2015).</li><li>Vallabhajosyula, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderate+versus+deep+hypothermic+circulatory+arrest+for+elective+aortic+transverse+hemiarch+reconstruction.">Moderate versus deep hypothermic circulatory arrest for elective aortic transverse hemiarch reconstruction.</a> ANNALS OF THORACIC SURGERY. 99 (5), 1511-1517 (2015).</li><li>Keeling, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+of+Moderate+Hypothermia+With+Antegrade+Cerebral+Perfusion+in+Total+Aortic+Arch+Replacement.">Safety of Moderate Hypothermia With Antegrade Cerebral Perfusion in Total Aortic Arch Replacement.</a> ANNALS OF THORACIC SURGERY. 105 (1), 54-61 (2018).</li><li>Yan, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+on+hypothermia+in+aortic+arch+surgery.">Consensus on hypothermia in aortic arch surgery.</a> Annals of Cardiothoracic Surgery. 2 (2), 163-168 (2013).</li><li>Zhou, J., Empey, P. E., Bies, R. R., Kochanek, P. M., Poloyac, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+arrest+and+therapeutic+hypothermia+decrease+isoform-specific+cytochrome+P450+drug+metabolism.">Cardiac arrest and therapeutic hypothermia decrease isoform-specific cytochrome P450 drug metabolism.</a> DRUG METABOLISM AND DISPOSITION. 39 (12), 2209-2218 (2011).</li><li>Sharp, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+the+mitochondrial+fission+protein+dynamin-related+protein+1+improves+survival+in+a+murine+cardiac+arrest+model.">Inhibition of the mitochondrial fission protein dynamin-related protein 1 improves survival in a murine cardiac arrest model.</a> CRITICAL CARE MEDICINE. 43 (2), 38-47 (2015).</li><li>Zhu, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp90aa1:+a+novel+target+gene+of+miR-1+in+cardiac+ischemia/reperfusion+injury.">Hsp90aa1: a novel target gene of miR-1 in cardiac ischemia/reperfusion injury.</a> Sci Rep. 6, 24498 (2016).</li><li>Castedo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+hypothermia+on+right+atrial+cardiomyocyte+apoptosis+in+patients+undergoing+aortic+valve+replacement.">Influence of hypothermia on right atrial cardiomyocyte apoptosis in patients undergoing aortic valve replacement.</a> Journal of Cardiothoracic Surgery. 2, 7 (2007).</li><li>Krech, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderate+therapeutic+hypothermia+induces+multimodal+protective+effects+in+oxygen-glucose+deprivation/reperfusion+injured+cardiomyocytes.">Moderate therapeutic hypothermia induces multimodal protective effects in oxygen-glucose deprivation/reperfusion injured cardiomyocytes.</a> Mitochondrion. 35, 1-10 (2017).</li><li>Cooper, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothermic+circulatory+arrest+causes+multisystem+vascular+endothelial+dysfunction+and+apoptosis.">Hypothermic circulatory arrest causes multisystem vascular endothelial dysfunction and apoptosis.</a> ANNALS OF THORACIC SURGERY. 69 (3), 696-702 (2000).</li><li>Kajimoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+cerebral+perfusion+prevents+abnormalities+in+glutamate+cycling+and+neuronal+apoptosis+in+a+model+of+infant+deep+hypothermic+circulatory+arrest+and+reperfusion.">Selective cerebral perfusion prevents abnormalities in glutamate cycling and neuronal apoptosis in a model of infant deep hypothermic circulatory arrest and reperfusion.</a> JOURNAL OF CEREBRAL BLOOD FLOW AND METABOLISM. 36 (11), 1992-2004 (2016).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+Hypothermic+Circulatory+Arrest+Does+Not+Show+Better+Protection+for+Vital+Organs+Compared+with+Moderate+Hypothermic+Circulatory+Arrest+in+Pig+Model.">Deep Hypothermic Circulatory Arrest Does Not Show Better Protection for Vital Organs Compared with Moderate Hypothermic Circulatory Arrest in Pig Model.</a> Biomed Research International. 2019, 1420216 (2019).</li><li>Davidson, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+cell+lines+derived+from+adult+human+ventricular+cardiomyocytes.">Novel cell lines derived from adult human ventricular cardiomyocytes.</a> JOURNAL OF MOLECULAR AND CELLULAR CARDIOLOGY. 39 (1), 133-147 (2005).</li><li>Khan, K., Makhoul, G., Yu, B., Schwertani, A., Cecere, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytoprotective+impact+of+yes-associated+protein+1+after+ischemia-reperfusion+injury+in+AC16+human+cardiomyocytes.">The cytoprotective impact of yes-associated protein 1 after ischemia-reperfusion injury in AC16 human cardiomyocytes.</a> EXPERIMENTAL BIOLOGY AND MEDICINE. 244 (10), 802-812 (2019).</li><li>Pan, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-146a+attenuates+apoptosis+and+modulates+autophagy+by+targeting+TAF9b/P53+pathway+in+doxorubicin-induced+cardiotoxicity.">miR-146a attenuates apoptosis and modulates autophagy by targeting TAF9b/P53 pathway in doxorubicin-induced cardiotoxicity.</a> Cell Death Discovery. 10 (9), 668 (2019).</li><li>Schmitt, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S100B+modulates+IL-6+release+and+cytotoxicity+from+hypothermic+brain+cells+and+inhibits+hypothermia-induced+axonal+outgrowth.">S100B modulates IL-6 release and cytotoxicity from hypothermic brain cells and inhibits hypothermia-induced axonal outgrowth.</a> NEUROSCIENCE RESEARCH. 59 (1), 68-73 (2007).</li><li>Tong, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+hypothermia+therapy+attenuates+LPS-induced+microglia+neuroinflammation+via+the+STAT3+pathway.">Deep hypothermia therapy attenuates LPS-induced microglia neuroinflammation via the STAT3 pathway.</a> Neuroscience. 358, 201-210 (2017).</li><li>Yu, Z. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Troxerutin+attenuates+oxygenglucose+deprivation+and+reoxygenationinduced+oxidative+stress+and+inflammation+by+enhancing+the+PI3K/AKT/HIF1alpha+signaling+pathway+in+H9C2+cardiomyocytes.">Troxerutin attenuates oxygenglucose deprivation and reoxygenationinduced oxidative stress and inflammation by enhancing the PI3K/AKT/HIF1alpha signaling pathway in H9C2 cardiomyocytes.</a> Molecular Medicine Reports. 22 (2), 1351-1361 (2020).</li><li>Drescher, C., Diestel, A., Wollersheim, S., Berger, F., Schmitt, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+does+hypothermia+protect+cardiomyocytes+during+cardioplegic+ischemia.">How does hypothermia protect cardiomyocytes during cardioplegic ischemia.</a> European journal of cardiothoracic surgery. 40 (2), 352-359 (2011).</li><li>Diestel, A., Drescher, C., Miera, O., Berger, F., Schmitt, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothermia+protects+H9c2+cardiomyocytes+from+H2O2+induced+apoptosis.">Hypothermia protects H9c2 cardiomyocytes from H2O2 induced apoptosis.</a> Cryobiology. 62 (1), 53-61 (2011).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIF-1alpha/BNIP3+signaling+pathway-induced-autophagy+plays+protective+role+during+myocardial+ischemia-reperfusion+injury.">HIF-1alpha/BNIP3 signaling pathway-induced-autophagy plays protective role during myocardial ischemia-reperfusion injury.</a> BIOMEDICINE &amp; PHARMACOTHERAPY. 120, 109464 (2019).</li><li>An, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exogenous+IL-19+attenuates+acute+ischaemic+injury+and+improves+survival+in+male+mice+with+myocardial+infarction.">Exogenous IL-19 attenuates acute ischaemic injury and improves survival in male mice with myocardial infarction.</a> BRITISH JOURNAL OF PHARMACOLOGY. 176 (5), 699-710 (2019).</li><li>Han, Y. S., Schaible, N., Tveita, T., Sieck, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discontinued+stimulation+of+cardiomyocytes+provides+protection+against+hypothermia-rewarming-induced+disruption+of+excitation-contraction+coupling.">Discontinued stimulation of cardiomyocytes provides protection against hypothermia-rewarming-induced disruption of excitation-contraction coupling.</a> EXPERIMENTAL PHYSIOLOGY. 103 (6), 819-826 (2018).</li><li>Yarbrough, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase+inhibition+attenuates+contractile+dysfunction+following+cardioplegic+arrest+and+rewarming+in+the+setting+of+left+ventricular+failure.">Caspase inhibition attenuates contractile dysfunction following cardioplegic arrest and rewarming in the setting of left ventricular failure.</a> Journal of cardiovascular pharmacology. 44 (6), 645-650 (2004).</li><li>Egorov, Y. V., Glukhov, A. V., Efimov, I. R., Rosenshtraukh, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothermia-induced+spatially+discordant+action+potential+duration+alternans+and+arrhythmogenesis+in+nonhibernating+versus+hibernating+mammals.">Hypothermia-induced spatially discordant action potential duration alternans and arrhythmogenesis in nonhibernating versus hibernating mammals.</a> AMERICAN JOURNAL OF PHYSIOLOGY-HEART AND CIRCULATORY PHYSIOLOGY. 303 (8), 1035-1046 (2012).</li><li>Bobi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderate+Hypothermia+Modifies+Coronary+Hemodynamics+and+Endothelium-Dependent+Vasodilation+in+a+Porcine+Model+of+Temperature+Management.">Moderate Hypothermia Modifies Coronary Hemodynamics and Endothelium-Dependent Vasodilation in a Porcine Model of Temperature Management.</a> Journal of the American Heart Association. 9 (3), 014035 (2020).</li><li>Dietrichs, E. S., Tveita, T., Myles, R., Smith, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+ECG-biomarker+for+cardiac+arrest+during+hypothermia.">A novel ECG-biomarker for cardiac arrest during hypothermia.</a> Scandinavian Journal of Trauma Resuscitation &amp; Emergency Medicine. 28 (1), 27 (2020).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Farklı hücre türleri arasındaki etkileşimler de dahil olmak üzere sağlam hayvanların karmaşıklıkları, genellikle I /R yaralanmasının belirli bileşenlerinin ayrıntılı çalışmalarını önler. Bu nedenle, in vivo iskemi sonrası moleküler değişiklikleri doğru bir şekilde yansıtabilecek bir in vitro hücre modeli oluşturmak gerekir. OGD modelleri üzerinde yapılan araştırmalar daha önce13,22ve birçok sofistike yöntem oluşturulmuştu...

İskemi/reperfüzyondan türetilmiş miyokard disfonksiyonu kalp cerrahisi sonrası hastalarda sık görülen bir klinik senaryodur1,2. Zengin olmayan düşük akış perfüzyonu ve toplam dolaşım durması dönemlerinde, her türlü kalp hücresini içeren hasarlar oluşmaya devam eder. Özellikle, kardiyomiyositlerin iskemik yaralanmaya duyarlılığı diğer hücre popülasyonlarından daha yüksektir. Şu anda, terapötik hipotermi (TH), kalp cerrahisi uygulanan hastalarda beklenen iskemik hakarete karşı önemli bir koruma sağlar3,4. TH, 14-34 ° C çekirdek vücut sıcaklığı olarak tanımlanır, ancak kalp cerrahisi sırasında soğutma tanımı ile ilgili bir fikir birliği yoktur5,6,7. 2013 yılında, uluslararası bir uzman paneli, sistemik hipotermik dolaşım tutuklamasının çeşitli sıcaklık aralıklarını sınıflandırmak için standartlaştırılmış bir raporlama sistemi önerdi8. Beynin elektroensefalografisi ve metabolizma çalışmalarına dayanarak hipotermiyi dört düzeye ayırdılar: derin hipotermi (≤ 14 °C), derin hipotermi (14.1-20 °C), orta hipotermi (20.1-28 °C) ve hafif hipotermi (28.1-34 °C). Uzman konsensüsü, açık ve düzgün bir sınıflandırma sağlayarak çalışmaların daha karşılaştırılabilir olmasını ve klinik olarak daha alakalı sonuçlar vermesini sağladı. TH tarafından sağlanan bu koruma, hücrelerin metabolik aktivitesini azaltma kapasitesine dayanır ve yüksek enerjili fosfat tüketim hızlarını daha da sınırlar9,10. Bununla birlikte, miyokard korumasında TH'nin rolü tartışmalıdır ve hipotermi dereceine bağlı olarak birden fazla etkiye sahip olabilir.
Miyokard I/R'ye artmış hücre apoptizisi11eşlik ettiği bilinmektedir. Son raporlar, programlanmış kardiyomiyosit ölümünün açık kalp ameliyatı sırasında arttığını ve nekrozla çakışabileceğini ve böylece ölü miyokard hücrelerinin sayısını artırdığını gözlemlemıştır12. Bu nedenle kardiyomiyosit apoptozun azaltılması klinik pratikte yararlı bir terapötik yaklaşımdır. Fare atriyal HL-1 kardiyomiyosit modelinde, terapötik hipotermi, reperfüzyon sırasında sitokrom c ve apoptoz indükleyici faktörün (AIF) mitokondriyal salınımını azalttığı gösterilmiştir13. Bununla birlikte, sıcaklığın apoptozu düzenlemedeki etkisi tartışmalıdır ve hipotermi derecesine bağlı olduğu görülmektedir. Cooper ve meslektaşları, normotermik kardiyopulmoner bypass kontrol grubuna kıyasla, derin hipotermik dolaşım durması olan domuzlardan gelen miyokard dokusunun apoptoz oranının14arttığını gözlemlediler. Ek olarak, bazı çalışmaların sonuçları derin hipotermi apoptoz yolunu aktive edebilirken, daha az agresif hipotermi12 , 15,16yolunu inhibe ediyor gibi görünmektedir. Bu sonucun nedeni, iskemik yaralanma ile ilişkili kafa karıştırıcı etkilerden ve sıcaklığın miyokard dokusunu etkilediği mekanizmaların anlaşılmamasından kaynaklanabilir. Bu nedenle, apoptozun artırıldığı veya zayıfladığı sıcaklık sınırları doğru bir şekilde tanımlanmalıdır.
Hipotermi etkinliği ile ilişkili mekanizmaların daha iyi anlaşılması ve insanlarda uygulanması için rasyonel bir temel sağlamak için, klinik durum için tekrarlanabilir bir şekilde gözlemlenene benzer hasar üretebilecek in vivo koşullara benzer bir kültür durumunun tanımlanması esastır. Bu hedefe ulaşmak için önemli bir adım, kardiyomiyosit apoptozun indüklene için en uygun koşulları belirlemektir. Bu nedenle, bu çalışmada, iskemi-reperfüzyonun bir facile in vitro modeli olan kültürlü hücrelerle yapılan oksijen-glikoz yoksunluğu deneyleri ile ilgili metodolojik ayrıntıları araştırdık. Ayrıca, farklı hipoksik-iskemik zamanların kardiyomiyosit apoptoz üzerindeki etkisini değerlendirdik ve farklı sıcaklık koşullarının hücreli apoptoz in vitro üzerindeki etkisine ilişkin hipotezimizi doğruladık.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Annexin V-FITC cell apoptosis detection kit</td>
			<td>Bio-Technology,China</td>
			<td>C1062M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiac myocyte growth supplement</td>
			<td>Sciencell,USA</td>
			<td>6252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caspase 3 activity assay kit</td>
			<td>Bio-Technology,China</td>
			<td>C1115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caspase 8 activity assay kit</td>
			<td>Bio-Technology,China</td>
			<td>C1151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, no glucose</td>
			<td>Gibco,USA</td>
			<td>11966025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified eagle medium</td>
			<td>Gibco,USA</td>
			<td>11960044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco,USA</td>
			<td>16140071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry</td>
			<td>CytoFLEX,USA</td>
			<td>B49007AF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human myocardial cells</td>
			<td>BLUEFBIO,China</td>
			<td>BFN60808678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1</td>
			<td>Bio-Technology,China</td>
			<td>C2006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin solution</td>
			<td>Gibco,USA</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reactive oxygen species assay kit</td>
			<td>Bio-Technology,China</td>
			<td>S0033S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Three-gas incubator</td>
			<td>Memmert,Germany</td>
			<td>ICO50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Gibco,USA</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro assessment of myocardial protection following hypothermia-preconditioning in a human cardiac myocytes model

İskemi/reperfüzyondan türetilmiş miyokard disfonksiyonu kalp cerrahisi sonrası hastalarda sık görülen bir klinik senaryodur. Özellikle, kardiyomiyositlerin iskemik yaralanmaya duyarlılığı diğer hücre popülasyonlarından daha yüksektir. Şu anda hipotermi, beklenen iskemik hakarete karşı önemli bir koruma sağlar. Bununla birlikte, karmaşık hipotermi kaynaklı moleküler değişikliklerle ilgili araştırmalar sınırlı kalmaktadır. Bu nedenle, klinik durumda gözlemlenene benzer hasarlara neden olabilecek in vivo durumlara benzer bir kültür durumunun tekrarlanabilir bir şekilde tanımlanması esastır. İn vitro iskemi benzeri durumları taklit etmek için, bu modellerdeki hücreler oksijen /glikoz yoksunluğu (OGD) ile tedavi edildi. Ayrıca kalp cerrahisi sırasında kullanılan standart bir zaman-sıcaklık protokolü uyguladık. Ayrıca, miyokard hasarının nicel analizi için basit ama kapsamlı bir yöntem kullanmak için bir yaklaşım öneriyoruz. Apoptoz ilişkili proteinlerin apoptoz ve ekspresyon düzeyleri akış sitometrisi ve ELISA kiti kullanılarak değerlendirildi. Bu modelde, farklı sıcaklık koşullarının kardiyomiyosit apoptoz in vitro üzerindeki etkileri ile ilgili bir hipotezi test ettik. Bu modelin güvenilirliği sıkı sıcaklık kontrolüne, kontrol edilebilir deneysel prosedürlere ve istikrarlı deneysel sonuçlara bağlıdır. Ek olarak, bu model hipotermik kardiyoproteksiyonun moleküler mekanizmasını incelemek için kullanılabilir, bu da hipotermi ile kullanılmak üzere tamamlayıcı tedavilerin geliştirilmesi için önemli etkileri olabilir.

OGD maruziyetinin HCM'lerin canlılığı üzerindeki etkisi CCK-8 tahlili ile belirlendi. Kontrol grubunda gözlenenlerle karşılaştırıldığında, hücre canlılığı zamana bağlı olarak önemli ölçüde azaldı (Şekil 2A). Reperfüzyondan sonra farklı zamanlarda HCM'lerin apoptoz oranları, 0 ila 16 saat arasında, apoptoz oranlarının kademeli olarak arttığı ve 16 saat zaman noktasında maksimum orana ulaştığı belirli bir eğilim göstermiştir (Şe...

Watch this Scientific Journal Video about In vitro Assessment of Myocardial Protection following Hypothermia-Preconditioning in a Human Cardiac Myocytes Model at JoVE.com

In vitro Assessment of Myocardial Protection following Hypothermia-Preconditioning in a Human Cardiac Myocytes Model

Farklı hipotermi derecelerinin miyokard koruması üzerindeki belirgin etkileri ayrıntılı olarak değerlendirilmemiştir. Bu çalışmanın amacı, insan kardiyomiyosit tabanlı bir modelde farklı hipotermi tedavilerinin ardından hücre ölüm seviyelerini ölçmek ve gelecekteki derinlemesine moleküler araştırmaların temelini atmaktı.

İnsan Kardiyak Miyosit Modelinde Hipotermi-Önkoşullama Sonrası Miyokard Korumasının İn vitro Değerlendirmesi

Ischemia/reperfusion-derived myocardial dysfunction is a common clinical scenario in patients after cardiac surgery. In particular, the sensitivity of ...

in-vitro-assessment-myocardial-protection-following-hypothermia

Research

JoVE Journal

Medicine

2.9K Görüntüleme.  Children's Hospital of Nanjing Medical University. Farklı hipotermi derecelerinin miyokard koruması üzerindeki belirgin etkileri ayrıntılı olarak değerlendirilmemiştir. Bu çalışmanın amacı, insan kardiyomiyosit tabanlı bir modelde farklı hipotermi tedavilerinin ardından hücre ölüm seviyelerini ölçmek ve gelecekteki derinlemesine moleküler araştırmaların temelini atmaktı.

Video: In vitro Assessment of Myocardial Protection following Hypothermia-Preconditioning in a Human Cardiac Myocytes Model

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and finding new sources for implantable cells are the focus of recent research4,5. Investigating the effectiveness of cell therapies is not an easy task and new tools are needed to investigate the mechanisms involved in the treatment process6. We designed an experimental protocol of ischemia/reperfusion in order to allow the observation of cellular connections and even subcellular mechanisms during ischemia/reperfusion injury and after stem cell transplantation and to evaluate the efficacy of cell therapy. H9c2 cardiomyoblast cells were placed onto cell culture plates7,8. Ischemia was simulated with 150 minutes in a glucose free medium with oxygen level below 0.5%. Then, normal media and oxygen levels were reintroduced to simulate reperfusion. After oxygen glucose deprivation, the damaged cells were treated with transplantation of labeled human bone marrow derived mesenchymal stem cells by adding them to the culture. Mesenchymal stem cells are preferred in clinical trials because they are easily accessible with minimal invasive surgery, easily expandable and autologous. After 24 hours of co-cultivation, cells were stained with calcein and ethidium-homodimer to differentiate between live and dead cells. This setup allowed us to investigate the intercellular connections using confocal fluorescent microscopy and to quantify the survival rate of postischemic cells by flow cytometry. Confocal microscopy showed the interactions of the two cell populations such as cell fusion and formation of intercellular nanotubes. Flow cytometry analysis revealed 3 clusters of damaged cells which can be plotted on a graph and analyzed statistically. These populations can be investigated separately and conclusions can be drawn on these data on the effectiveness of the simulated therapeutical approach.

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

We demonstrate how to set up an in vitro ischemia/reperfusion model and how to evaluate the effect of stem cell therapy on postischemic cardiac cells.

Bir Kök Hücre Nakli In vitro Simüle İskemi / Reperfüzyon Modeli

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and ...

Tıp

Assessment of Cardiac Function and Myocardial Morphology Using Small Animal Look-locker Inversion Recovery (SALLI) MRI in Rats

Small animal magnetic resonance imaging is an important tool to study cardiac function and changes in myocardial tissue. The high heart rates of small animals (200 to 600 beats/min) have previously limited the role of CMR imaging. Small animal Look-Locker inversion recovery (SALLI) is a T1 mapping sequence for small animals to overcome this problem 1. T1 maps provide quantitative information about tissue alterations and contrast agent kinetics. It is also possible to detect diffuse myocardial processes such as interstitial fibrosis or edema 1-6. Furthermore, from a single set of image data, it is possible to examine heart function and myocardial scarring by generating cine and inversion recovery-prepared late gadolinium enhancement-type MR images 1.
	The presented video shows step-by-step the procedures to perform small animal CMR imaging. Here it is presented with a healthy Sprague-Dawley rat, however naturally it can be extended to different cardiac small animal models.

Assessment of Cardiac Function and Myocardial Morphology Using Small Animal Look-locker Inversion Recovery SALLI MRI in Rats

Contrast enhanced cardiac magnetic resonance (CMR) imaging allows comprehensive in vivo assessment of the heart in small animal models of cardiovascular disease. Here we detail the procedures to perform CMR imaging, reconstruction and analysis using Small Animal Lock-Locker Inversion Recovery (SALLI) in rats.

Küçük Hayvan Bak-soyunma Ters Kurtarma (SALLI) Sıçanlarda MRI kullanarak Kalp Fonksiyonu ve Miyokard Morfoloji Değerlendirilmesi

Small animal magnetic resonance  imaging is an important tool to study cardiac function and changes in myocardial  tissue. The high heart rates of small ...

Myocardial Infarction and Functional Outcome Assessment in Pigs

Introduction of newly discovered cardiovascular therapeutics into first-in-man trials depends on a strictly regulated ethical and legal roadmap. One important prerequisite is a good understanding of all safety and efficacy aspects obtained in a large animal model that validly reflect the human scenario of myocardial infarction (MI). Pigs are widely used in this regard since their cardiac size, hemodynamics, and coronary anatomy are close to that of humans. Here, we present an effective protocol for using the porcine MI model using a closed-chest coronary balloon occlusion of the left anterior descending artery (LAD), followed by reperfusion. This approach is based on 90 min of myocardial ischemia, inducing large left ventricle infarction of the anterior, septal and inferoseptal walls. Furthermore, we present protocols for various measures of outcome that provide a wide range of information on the heart, such as cardiac systolic and diastolic function, hemodynamics, coronary flow velocity, microvascular resistance, and infarct size. This protocol can be easily tailored to meet study specific requirements for the validation of novel cardioregenerative biologics at different stages (i.e. directly after the acute ischemic insult, in the subacute setting or even in the chronic MI once scar formation has been completed). This model therefore provides a useful translational tool to study MI, subsequent adverse remodeling, and the potential of novel cardioregenerative agents.

This protocol describes the porcine myocardial infarction (MI) model using a 90 min closed-chest coronary balloon occlusion of the left anterior descending artery (LAD), followed by reperfusion. Furthermore, the protocol for several outcome parameters, such as cardiac function, hemodynamics, microvascular resistance, and infarct size, are also presented.

Domuzlar miyokard enfarktüsü ve Fonksiyonel Sonuç Değerlendirmesi

Introduction of newly discovered cardiovascular therapeutics into first-in-man trials depends on a strictly regulated ethical and legal roadmap. One ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As such, primary or &#39;neuronal-like&#39; cell culture systems are commonly utilized. While&#160;these systems are relatively easy to work with, and are useful model systems in which various functional outcomes (such as cell death) can be readily quantified, the examined outcomes and pathways in cultured immature neurons (such as excitotoxicity-mediated cell death pathways) are not necessarily the same as those observed in mature brain, or in intact tissue. Therefore, there is the need to develop models in which cellular mechanisms in mature neural tissue can be examined. We have developed an in vitro technique that can be used to investigate a variety of molecular pathways in intact nervous tissue. The technique described herein utilizes rat cortical tissue, but this technique can be adapted to use tissue from a variety of species (such as mouse, rabbit, guinea pig, and chicken) or brain regions (for example, hippocampus, striatum, etc.). Additionally, a variety of stimulations/treatments can be used (for example, excitotoxic, administration of inhibitors, etc.). In conclusion, the brain slice model described herein can be used to examine a variety of molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

We have developed a brain slice model which can be used to examine molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.&#160;This technique generates viable mature brain tissue and reduces animal numbers required for experimentation, whilst keeping the neuronal circuitry, cellular interactions, and postsynaptic compartments partly intact.

Bir olarak Beyin Microslices arasında excitotoxic uyarılması<em&gt; In vitro</em&gt; İnme Model

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Primary Outcome Assessment in a Pig Model of Acute Myocardial Infarction

Mortality after acute myocardial infarction remains substantial and is associated with significant morbidity, like heart failure. Novel therapeutics are therefore required to confine cardiac damage, promote survival and reduce the disease burden of heart failure. Large animal experiments are an essential part in the translational process from experimental to clinical therapies. To optimize clinical translation, robust and representative outcome measures are mandatory. The present manuscript aims to address this need by describing the assessment of three clinically relevant outcome modalities in a pig acute myocardial infarction (AMI) model: infarct size in relation to area at risk (IS/AAR) staining, 3-dimensional transesophageal echocardiography (TEE) and admittance-based pressure-volume (PV) loops. Infarct size is the main determinant driving the transition from AMI to heart failure and can be quantified by IS/AAR staining. Echocardiography is a reliable and robust tool in the assessment of global and regional cardiac function in clinical cardiology. Here, a method for three-dimensional transesophageal echocardiography (3D-TEE) in pigs is provided. Extensive insight into cardiac performance can be obtained by admittance-based pressure-volume (PV) loops, including intrinsic parameters of myocardial function that are pre- and afterload independent. Combined with a clinically feasible experimental study protocol, these outcome measures provide researchers with essential information to determine whether novel therapeutic strategies could yield promising targets for future testing in clinical studies.

Reliable and accurate outcome assessment is the key for translation of preclinical therapies into clinical treatment. The current paper describes how to assess three clinically relevant primary outcome parameters of cardiac performance and damage in a pig acute myocardial infarction model.

Akut Miyokard İnfarktüsü bir Domuz Modeli İlköğretim Sonuç Değerlendirmesi

Mortality after acute myocardial infarction remains substantial and is associated with significant morbidity, like heart failure. Novel therapeutics are ...

Myocardial Infarction in Neonatal Mice, A Model of Cardiac Regeneration

Myocardial infarction induced by coronary artery ligation has been used in many animal models as a tool to study the mechanisms of cardiac repair and regeneration, and to define new targets for therapeutics. For decades, models of complete heart regeneration existed in amphibians and fish, but a mammalian counterpart was not available. The recent discovery of a postnatal window during which mice possess regenerative capabilities has led to the establishment of a mammalian model of cardiac regeneration. A surgical model of mammalian cardiac regeneration in the neonatal mouse is presented herein. Briefly, postnatal day 1 (P1) mice are anesthetized by isoflurane and placed on an ice pad to induce hypothermia. After the chest is opened, and the left anterior descending coronary artery (LAD) is visualized, a suture is placed around the LAD to inflict myocardial ischemia in the left ventricle. The surgical procedure takes 10-15 min. Visualizing the coronary artery is crucial for accurate suture placement and reproducibility. Myocardial infarction and cardiac dysfunction are confirmed by triphenyl-tetrazolium chloride (TTC) staining and echocardiography, respectively. Complete regeneration 21 days post myocardial infarction is verified by histology. This protocol can be used to as a tool to elucidate mechanisms of mammalian cardiac regeneration after myocardial infarction.

This protocol describes a highly reproducible model of cardiac regeneration by surgical induction of myocardial infarction in the left ventricle of postnatal day 1 mice. The method involves induction of hypothermic anesthesia and ligation of the left anterior descending coronary artery.

Yenidoğan Farelerde Miyokard Enfarktüsü, Kalp Rejenerasyon Bir Model

Myocardial infarction induced by coronary artery ligation has been used in many animal models as a tool to study the mechanisms of cardiac repair and ...

A Flow Cytometry-based Assay for Measuring Mitochondrial Membrane Potential in Cardiac Myocytes After Hypoxia/Reoxygenation

Timely and efficient reperfusion of the occluded coronary artery is the best strategy for decreasing myocardial infarct size in patients with a ST-segment elevated myocardial infarction. However, reperfusion per se can result in further cardiomyocyte death, a phenomenon known as reperfusion injury. The opening of the mitochondrial permeability transition pore (mPTP), with the decrease of the mitochondrial membrane potential (MMP), or mitochondrial depolarization, is universally recognized as the final step of reperfusion injury and is responsible for mitochondrial and cardiomyocyte death. JC-1 is a lipophilic cationic dye that accumulates in mitochondria depending on the value of MMP. The higher the MMP is, the more JC-1 accumulates in the mitochondria. The increasing amounts of JC-1 in mitochondria can be reflected by a fluorescence emission shift from green (~530 nm) to red (~590 nm). Therefore, the reduction of the red/green fluorescence intensity ratio can indicate the depolarization of mitochondria. Here, we take advantage of JC-1 to measure MMP, or the opening of mPTP in human cardiac myocytes after hypoxia/reoxygenation, detected by flow cytometry.

Here, we present a protocol that uses JC-1 dye to assess the mitochondrial membrane potential of cells after being exposed to hypoxia/reoxygenation with or without a protective agent.

Kardiyak miyositler mitokondrial membran potansiyeli hipoksi/Reoxygenation sonra ölçmek için akış sitometresi tabanlı tahlil

Timely and efficient reperfusion of the occluded coronary artery is the best strategy for decreasing myocardial infarct size in patients with a ST-segment ...

Implantation of hiPSC-derived Cardiac-muscle Patches after Myocardial Injury in a Guinea Pig Model

Due to the limited regeneration capacity of the heart in adult mammals, myocardial infarction results in an irreversible loss of cardiomyocytes. This loss of relevant amounts of heart muscle mass can lead to the heart failure. Besides heart transplantation, there is no curative treatment option for the end-stage heart failure. In times of organ donor shortage, organ independent treatment modalities are needed. Left-ventricular assist devices are a promising therapy option, however, especially as destination therapy, limited by its side-effects like stroke, infections and bleedings. In recent years, several cardiac repair strategies including stem cell injection, cardiac progenitors or myocardial tissue engineering have been investigated. Recent improvements in cell biology allow for the differentiation of large amounts of cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells (iPSC). One of the cardiac repair strategies currently under evaluation is to transplant artificial heart tissue. Engineered heart tissue (EHT) is a three-dimensional in vitro created cardiomyocyte network, with functional properties of native heart tissue. We have created EHT-patches from hiPSC derived cardiomyocytes. Here we present a protocol for the induction of left ventricular myocardial cryoinjury in a guinea pig, followed by implantation of hiPSC derived EHT on the left ventricular wall.

Here we present a protocol for the induction of left ventricular cryoinjury followed by the implantation of a cardiac muscle patch, derived from human iPS-cell cardiomyocytes in a guinea pig model.

HiPSC elde edilen kalp kası yamalar implantasyonu eskiden şiling şimdi domuz modelinde miyokardiyal yaralanma sonra

Due to the limited regeneration capacity of the heart in adult mammals, myocardial infarction results in an irreversible loss of cardiomyocytes. This loss ...

Isolation of Atrial Myocytes from Adult Mice

The electrophysiological properties of atrial myocytes importantly affect overall cardiac function. Alterations in the underlying ionic currents responsible for the action potential can cause pro-arrhythmic substrates that underlie arrhythmias, such as atrial fibrillation, which are highly prevalent in many conditions and disease states. Isolating adult mouse atrial cardiomyocytes for use in patch-clamp experiments has greatly advanced our knowledge and understanding of the cellular electrophysiology in the healthy atrial myocardium and in the setting of atrial pathophysiology. In addition, studies using genetic mouse models have elucidated the role of a vast array of proteins in regulating atrial electrophysiology. Here we provide a detailed protocol for the isolation of cardiomyocytes from the atrial appendages of adult mice using a combination of enzymatic digestion and mechanical dissociation of these tissues. This approach consistently and reliably yields isolated atrial cardiomyocytes that can then be used to characterize cellular electrophysiology by measuring action potentials and ionic currents in patch-clamp experiments under a number of experimental conditions.

This protocol is used to isolate single atrial cardiomyocytes from the adult mouse heart using a chunk digestion approach. This approach is used to isolate right or left atrial myocytes that can be used to characterize atrial myocyte electrophysiology in patch-clamp studies.

Yetişkin fareler atriyal Miyoksit izolasyonu

The electrophysiological properties of atrial myocytes importantly affect overall cardiac function. Alterations in the underlying ionic currents ...

In Vitro Assessment of Cardiac Function Using Skinned Cardiomyocytes

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring apparatus and a motor to perform functional studies. These studies will allow measurement of cardiomyocyte stiffness (passive force) and its activation with different calcium (Ca2+)-containing solutions to determine, amongst others: maximum force development, myofilament Ca2+-sensitivity (pCa50), cooperativity (nHill) and the rate of force redevelopment (ktr). This method also enables determination of the effects of drugs acting directly on myofilaments and of the expression of exogenous recombinant proteins on both active and passive properties of cardiomyocytes. Clinically, skinned cardiomyocyte studies highlight the pathophysiology of many myocardial diseases and allow in vitro assessment of the impact of therapeutic interventions targeting the myofilaments. Altogether, this technique enables the clarification of cardiac pathophysiology by investigating correlations between in vitro and in vivo parameters in animal models and human tissue obtained during open heart or transplant surgery.

This protocol aims to describe step-by-step the technique of extraction and assessment of cardiac function using skinned cardiomyocytes. This methodology allows measurement and acutemodulation of myofilament function using small frozen biopsies that can be collected from different cardiac locations, from mice to men.

Derili Kardiyomiyositler Kullanarak Kardiyak Fonksiyonun İn Vitro Değerlendirilmesi

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring ...