Name: in vitro assessment of myocardial protection following hypothermia-preconditioning in a human cardiac myocytes model
Uploaded: 2020-10-27T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vitro Assessment of Myocardial Protection following Hypothermia-Preconditioning in a Human Cardiac Myocytes Model at JoVE.com

Bu çalışma kısmen Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81970265, 81900281,81700288), Çin Doktora Sonrası Bilim Vakfı (2019M651904) tarafından finanse edildi; ve Çin Ulusal Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programı (2016YFC1101001, 2017YFC1308105).

Ticari reaktifler ve aletlerle ilgili bilgiler Malzeme Tablosundalistelenmiştir.
AC16 insan kardiyomiyosit hücre hattı, yetişkin ventrikül kalp dokusundan birincil hücrelerin BLUEFBIO'dan (Şanghay, Çin) satın alınan SV40 dönüştürülmüş insan fibroblastları17ile füzyonundan türetilmiştir. Hücre hattı kardiyomiyositlerin karakteristik birçok biyokimyasal ve morfolojik özelliğini geliştirir. Ek olarak, hücre hattı miyokard hasarını ve miyokard fonksiyonunu değerlendirmek için yaygın olarak kullanılır in vitro18,19.
1. Hücre kültürü
NOT: Bazal kültür ortamı serumsuz Dulbecco'nun modifiye Eagle medium (DMEM), %10 fetal sığır serumu (FBS), %1 kardiyak miyozit büyüme takviyesi ve %1 penisilin/streptomisin çözeltisi içerir. Ortamı kullanmadan önce 4 °C'de ve ön ısıtmadan 37 °C'ye saklayın.
<ol><li>Kriyoprezer korunmuş insan kardiyomiyosit (HCM) hücrelerini sıvı azottan çıkarın ve 37 °C'de bir su banyosunda çözün.</li>
	<li>Şişeyi (<1 dakika) 37 °C'lik bir su banyosunda şişenin içinde sadece küçük bir buz parçası kalana kadar hafifçe sallayın.</li>
	<li>Şişeyi steril bir laminar akış başlığına aktarın. Şişenin dışını% 70 alkole batırılmış bir pamuk topu ile silin.</li>
	<li>4 mL önceden ısıtılmamış komple büyüme ortamını, çözülmüş hücreleri içeren santrifüj tüpüne damla yönünde aktarın.</li>
	<li>Hücre süspansiyonu 10 dakika boyunca 200 × g'da santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı atın ve peletin 5 mL'lik tam orta olarak yeniden ıslatın.</li>
	<li>Hücreleri% 95 hava ve% 5 CO2ile bir atmosfer altında nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de koruyun. NOT: Deneyler için hücreleri toplamadan önce, hücrelerin yaklaşık% 60-70 izdiah edene kadar büyümesine izin verilir.</li>
</ol>2. Oksijen-glukoz yoksunluğu (OGD) modelinin kurulması
NOT: Çalışma döneminden iki saat önce, büyüme ortamını serumsuz ortamla değiştirin ve hücreler% 5CO2 ile bir atmosfer altında 37 ° C'de 2 saat boyunca nemlendirilmiş bir inkübatörde yeniden kapatıldı.
<ol><li>Ortamı 6 kuyulu bir plakadan emiş ve hücreleri fosfat tamponlu salin (PBS) ile üç kez hafifçe yıkayın.</li>
	<li>Kuyu başına 2 mL taze şekersiz DMEM ekleyin.</li>
	<li>Hücreleri bir atmosfer altında üç gazlı bir inkübatörde% 95 N 2 , % 5 CO 2 ve 1,2,4, 8,12veya 16 saat boyunca 37 ° C'de% 0.1 O 2 karışımı ile sabit bir sıcaklıkta kültürleyin.</li>
	<li>Hipoksi tedavisinden sonra, ortamı 6 kuyulu plakadan aspire edin ve hücreleri PBS (pH 7.4) ile üç kez yıkayın.</li>
	<li>Kuyu başına 2 mL tam DMEM ekleyin.</li>
	<li>Hücreleri% 95 hava ve% 5 CO2ile bir atmosfer altında nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de koruyun.</li>
</ol>3. Zaman sıcaklığı protokolü
NOT: Kalp cerrahisi sırasında daha önce diğerleri tarafından açıklandığı gibi standart bir zaman sıcaklığı protokolü kullanılır20,21. HCM'leri aşağıdaki protokole göre tedavi edin (Şekil 1): zaman noktası 1 (T1) indüksiyonun sonunu, zaman noktası 2 (T2) bakımın sonunu ve zaman noktası 3 (T3) yeniden ısıtmanın sonunu gösterir. Sürekli normotermik koşullar altında tutulan kontrol hücrelerini analiz edin (37 °C). Sıcaklık koşulları, hassas sıcaklık düzenlemesine izin veren bir üç gaz inkübatörü kullanılarak oluşturulur.
<ol><li>Deneylerden iki saat önce, kültür ortamını 6 kuyulu bir plakadan epire edin ve kuyu başına 2 mL taze serumsuz DMEM ekleyin.</li>
	<li>Hücreleri% 5 CO 2 ile bir atmosfer altında 37 ° C'de 2 saat boyunca nemlendirilmiş bir inkübatördeyenideninkübatör.</li>
	<li>2 saat sonra, ortamı 6 kuyulu plakadan aspire edin ve hücreleri PBS (pH 7.4) ile üç kez yıkayın.</li>
	<li>Kuyu başına 2 mL taze serumsuz DMEM ekleyin.</li>
	<li>Üç gazlı inkübatördeki hücreleri yeniden kuluçkaya yatırın. NOT: Eklenmemiş hücreleri ve kalıntıları kaldırmak için ortamı değiştirin.</li>
	<li>Kültür yemeklerini üç gazlı bir inkübatör yerleştirerek sıcaklığı hemen değiştirin.</li>
	<li>1 saat soğudktan sonra, ortamı 6 kuyulu plakadan hızlı bir şekilde aspire edin ve kuyu başına 2 mL taze şekersiz DMEM ekleyin.</li>
	<li>Hipoksiyi kurmak için 37 °C'de %95 N 2 ,%5CO 2 ve%0,1O2'den oluşan bir atmosfer altında üç gazlı inkübatördeki hücreleri kültüre edin.</li>
	<li>Sıcaklığı aşağıda açıklandığı gibi ayarlayın. NOT: Protokol, düşük sıcaklıklı bir tedavinin 10 h'si ile başlar, ardından 2 h ila 37 °C ve 24 saat normotermi (37 °C) için yeniden ısıtma aşaması ile başlar. Her zaman noktasında, analiz için üç Petri kabı çıkarılır.</li>
	<li>Düşük sıcaklık tedavisinden sonra, ortamı 6 kuyulu plakadan aspire edin ve PBS (pH 7.4) ile üç kez yıkayın.</li>
	<li>Kuyu başına 2 mL tam DMEM ekleyin.</li>
	<li>Hücreleri% 95 hava ve% 5 CO2ile bir atmosfer altında nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de koruyun.</li>
</ol>4. CCK-8 uygulanabilirlik tahlilleri
<ol><li>Kullanmadan önce %0,25 tripsin-etylenediaminetetraasetik asit (EDTA) çözeltisini ve PBS'yi 37 °C'ye ısıtın.</li>
	<li>Ortamı aspire edin, hücreleri 1 mL PBS ile durulayın ve ardından kuyunun duvarı boyunca% 0,25 tripsin 0,5 mL ekleyin. Hemen hemen tüm HCM'ler ayrılana kadar 37 °C'de kuluçkaya yaslanın (yaklaşık 1 dk).</li>
	<li>Tripsin nötralize etmek için kuyulara 1 mL DMEM komple orta ekleyin.</li>
	<li>Hücre süspansiyonunu 15 mL santrifüj tüpüne aktarın ve HCM'leri 3 dakika boyunca 500 × g'da santrifüjleme ile pelet edin. Peletin rahatsız etmeden süpernatantı aspire edin.</li>
	<li>Hücre süspansiyonunun 100 μL'lik aliquotlarını (5000 hücre/kuyu) 96 kuyu plakasına dağıtın. Plakayı nemlendirilmiş bir inkübatörde (37 °C'de) 24 saat önceden kesin.</li>
	<li>Farklı tedavi grupları oluşturmak için 96 kuyu plakalarındaki kültürlü hücreleri kullanın.</li>
	<li>Plakayı bir inkübatörde uygun bir süre (16 saat) kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Plakanın her kuyusuna 10 μL CCK-8 çözeltisi ekleyin.</li>
	<li>Plakayı inkübatörde 1 saat kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Bir mikro plaka okuyucu kullanarak emiciliği 450 nm'de ölçün. DİkKAT: OD okuma ölçümlerine müdahale ettikleri için kuyulara kabarcık sokmamaya dikkat edin.</li>
</ol>5. Apoptoz analizi için akış sitometrisi
<ol><li>4.2-4.4 adımlarını izleyerek trypsinization ve santrifüjleme adımlarını gerçekleştirin. NOT: Hücreler EDTA olmadan tripsin ile toplanır. Apoptrozu değerlendirmek için hem yüzen hem de yapışan hücreler toplanır.</li>
	<li>Hücreleri 1000 × g'da 5 dakika santrifüj edin. Süpernatant atın ve peleti 1 mL PBS'de yeniden atın.</li>
	<li>Hemositometre kullanarak hücreleri sayın. Bir pipet kullanarak, 100 μL Trypan Mavi işlem görmüş hücre süspansiyonu hemositometreye aktarın. Bir el çetele sayacı kullanarak, canlı, lekelenmemiş hücreleri 16 karelik bir kümede sayın ve sonra PBS'yi kullanarak 1×107 hücre/ml'de bir hücre süspansiyonu oluşturun.</li>
	<li>Hücre süspansiyonunun 200 μL'× elde edin (5 ×10 5 -1 × 106 hücre).</li>
	<li>1000 g'da 5 dakika santrifüj × ve peletin Ek V-FITC bağlama çözeltisinde yeniden kullanın.</li>
	<li>Hücreleri boyamak için 5 μL Annexin V-FITC ekleyin.</li>
	<li>Hücre süspansiyonuna 10 μL propidium iyodür ekleyin.</li>
	<li>Hücreleri hafifçe karıştırın ve karanlıkta oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya yatırın. NOT: Lekelenmeyi iyileştirmek için hücreler kuluçka sırasında 2-3 kez yeniden biriktirilir.</li>
	<li>Akış sitometresini başlatın ve yazılımın uygun şekilde çalıştığından emin olun.</li>
	<li>Akış sitometri yazılımında iki nokta çizim penceresi açın.</li>
	<li>Hücre kalıntılarını ve/veya kümeleri sırasıyla boyutları ve tanecikleri açısından dışlamak için X ekseninde öne dağılmış ışığı (FSC) ve Y eksenindeki yan dağınık ışığı (SSC) seçin.</li>
	<li>Hücrelerin floresan yoğunluğunu ölçmek için kullanılan PE (590 mm) algılama kanalını ve FITC'yi (530 mm) seçin.</li>
	<li>Boş (boyanmamış HCM'ler) numune tüpünü akış sitometresine yerleştirin.</li>
	<li>Boş örnek tüpteki süspansiyondan parçacık toplamak için Kaydet'i tıklatın ve sonra ilk nokta çiziminde daha fazla analiz için hücre popülasyonunun kapısını kapatın.</li>
	<li>Tek lekeli numuneleri tüp destek koluna yerleştirin. Süspansiyondan parçacık toplamak için Kaydet'i tıklatın ve sonra ilk nokta çiziminde daha fazla analiz için hücre popülasyonunun kapısını girin.</li>
	<li>Diğer numune tüplerindeki HCM'leri toplayın ve floresan kanallarının voltajlarını ayarlayarak ölçümü optimize edin. NOT: Deney sırasında kompanzasyon kontrolü olarak lekesiz ve tek lekeli numuneler kullanılır.</li>
	<li>Her numune tüpünün istatistiklerini görüntüleyin ve her numunenin kesme oranı hesaplayın.</li>
</ol>6. Mitokondriyal depolarizasyon değerlendirmesi
<ol><li>4.2-4.4 adımlarını izleyerek trypsinization ve santrifüjleme gerçekleştirin.</li>
	<li>Hücreleri 500 μL tam ortamda yeniden biriktirin ve ardından 1 × 105 - 6 × 106 hücreye ayarlanmış hücre yoğunluğunu ayarlayın</li>
	<li>Her tüpe 0,5 mL JC-1 çalışma çözümü ekleyin.</li>
	<li>Hücreleri 37 °C'de bir hücre inkübatöründe 20 dakika kuluçkaya yatırın. NOT: Kuluçka süresi boyunca, JC-1 boyama tamponunu hazırlamak için 4 mL damıtılmış suya 1 mL 5× JC-1 boyama tamponu ekleyin.</li>
	<li>Kuluçkadan sonra, hücreleri 600 × g'da 4 °C'de 3 dakika santrifüj edin.</li>
	<li>Süpernatant atın ve peletin 1 mL JC-1 boyama tamponunda yeniden süzülür.</li>
	<li>6,5 ile 6,6 olan adımları üç kez yineleyin.</li>
	<li>HCM'leri 1,5 mL santrifüj tüpünde 1 mL buz gibi boyama tamponunda yeniden kullanın ve hücreleri 30 dakika içinde analiz için kullanın.</li>
	<li>Hücrelerdeki JC-1 boyasının floresan yoğunluğunu ölçmek için PE (590 nm) algılama kanalını ve FITC'yi (530 nm) seçin. NOT: 5.10-5.17 adımlarını izleyerek akış sitometresini ayarlayın.</li>
</ol>7. Reaktif oksijen türleri tahlili
<ol><li>4.2-4.4 adımlarını izleyerek trypsinization ve santrifüjleme gerçekleştirin.</li>
	<li>Kültür ortamındaki hücreleri 10 μM DCFDA ile lekelenin ve hücre yoğunluğunu 1 × 10 6 -1 × 107 hücreye ayarlayın</li>
	<li>37 °C'de 30 dakika kuluçkaya yaslanın.</li>
	<li>Hücreleri her 3-5 dakikada bir yavaşça yukarı / aşağı borulayın.</li>
	<li>Kuluçkadan sonra hücreleri serumsuz hücre kültürü ortamı ile üç kez yıkayın.</li>
	<li>5.10-5.17 adımlarını izleyerek akış sitometresti üzerindeki hücreleri analiz edin. NOT: DCF 488 nm'de heyecanlanır ve emisyon yoğunluğu 530 nm olarak ölçülür.</li>
</ol>8. Caspase Ölçümü 3/ Caspase 8 Aktivitesi
<ol><li>4.2-4.4 adımlarını izleyerek trypsinization gerçekleştirin.</li>
	<li>Hücreleri 5 dakika boyunca 4 °C'de 600 × g'da santrifüjleme ile toplayın.</li>
	<li>2 × 106 hücre başına 100 μL lysate tampon ekleyin.</li>
	<li>Hücreleri buzda 15 dakika boyunca yalım.</li>
	<li>Bir buz banyosunda 15 dakika kuluçkaya yatırtıktan sonra, numuneyi 15 dakika boyunca 4 °C'de1,6 × 10 4 x g'da santrifüjleyin.</li>
	<li>Süpernatantı kullanmak için buz gibi bir santrifüj tüpüne aktarın. NOT: Numunedeki protein konsantrasyonu en az 1-3 mg/mL olmalıdır.</li>
	<li>Ac-DEVD-pNA'yı (2 mM) çıkarın ve kullanmak için bir buz banyosuna yerleştirin.</li>
	<li>Enzim etiketli plakaya doğru bir şekilde 40 μL tampon çözeltisi ekleyin, numunenin 80 μL'sini ekleyin ve son olarak 10 μL Ac-DEVD-pNA (2 mM) ekleyin.</li>
	<li>Numuneyi 37 °C'de 120 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Üreticinin talimatlarına göre bir mikro plaka okuyucusunda A405 değeri ölçüldü. NOT: Caspase-3/caspase-8 tarafından üretilen pNA tarafından üretilen absorbans, boş kontrolün A405 değeri numuneninkinden çıkarılarak hesaplanır.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Kim, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+Ischemia+Induces+SDF-1alpha+Release+in+Cardiac+Surgery+Patients.">Myocardial Ischemia Induces SDF-1alpha Release in Cardiac Surgery Patients.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 9 (3), 230-238 (2016).</li><li>Klein, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Less+invasive+ventricular+reconstruction+for+ischaemic+heart+failure.">Less invasive ventricular reconstruction for ischaemic heart failure.</a> EUROPEAN JOURNAL OF HEART FAILURE. 21 (12), 1638-1650 (2019).</li><li>Otto, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+hypothermia+applicable+to+cardiac+surgery.">Therapeutic hypothermia applicable to cardiac surgery.</a> VETERINARY ANAESTHESIA AND ANALGESIA. 42 (6), 559-569 (2015).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+of+Hypothermic+Circulatory+Arrest+During+Unilateral+Antegrade+Cerebral+Perfusion+for+Aortic+Arch+Surgery.">Safety of Hypothermic Circulatory Arrest During Unilateral Antegrade Cerebral Perfusion for Aortic Arch Surgery.</a> CANADIAN JOURNAL OF CARDIOLOGY. 35 (11), 1483-1490 (2019).</li><li>Leshnower, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderate+Versus+Deep+Hypothermia+With+Unilateral+Selective+Antegrade+Cerebral+Perfusion+for+Acute+Type+A+Dissection.">Moderate Versus Deep Hypothermia With Unilateral Selective Antegrade Cerebral Perfusion for Acute Type A Dissection.</a> ANNALS OF THORACIC SURGERY. 100 (5), 1563-1568 (2015).</li><li>Vallabhajosyula, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderate+versus+deep+hypothermic+circulatory+arrest+for+elective+aortic+transverse+hemiarch+reconstruction.">Moderate versus deep hypothermic circulatory arrest for elective aortic transverse hemiarch reconstruction.</a> ANNALS OF THORACIC SURGERY. 99 (5), 1511-1517 (2015).</li><li>Keeling, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+of+Moderate+Hypothermia+With+Antegrade+Cerebral+Perfusion+in+Total+Aortic+Arch+Replacement.">Safety of Moderate Hypothermia With Antegrade Cerebral Perfusion in Total Aortic Arch Replacement.</a> ANNALS OF THORACIC SURGERY. 105 (1), 54-61 (2018).</li><li>Yan, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+on+hypothermia+in+aortic+arch+surgery.">Consensus on hypothermia in aortic arch surgery.</a> Annals of Cardiothoracic Surgery. 2 (2), 163-168 (2013).</li><li>Zhou, J., Empey, P. E., Bies, R. R., Kochanek, P. M., Poloyac, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+arrest+and+therapeutic+hypothermia+decrease+isoform-specific+cytochrome+P450+drug+metabolism.">Cardiac arrest and therapeutic hypothermia decrease isoform-specific cytochrome P450 drug metabolism.</a> DRUG METABOLISM AND DISPOSITION. 39 (12), 2209-2218 (2011).</li><li>Sharp, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+the+mitochondrial+fission+protein+dynamin-related+protein+1+improves+survival+in+a+murine+cardiac+arrest+model.">Inhibition of the mitochondrial fission protein dynamin-related protein 1 improves survival in a murine cardiac arrest model.</a> CRITICAL CARE MEDICINE. 43 (2), 38-47 (2015).</li><li>Zhu, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp90aa1:+a+novel+target+gene+of+miR-1+in+cardiac+ischemia/reperfusion+injury.">Hsp90aa1: a novel target gene of miR-1 in cardiac ischemia/reperfusion injury.</a> Sci Rep. 6, 24498 (2016).</li><li>Castedo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+hypothermia+on+right+atrial+cardiomyocyte+apoptosis+in+patients+undergoing+aortic+valve+replacement.">Influence of hypothermia on right atrial cardiomyocyte apoptosis in patients undergoing aortic valve replacement.</a> Journal of Cardiothoracic Surgery. 2, 7 (2007).</li><li>Krech, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderate+therapeutic+hypothermia+induces+multimodal+protective+effects+in+oxygen-glucose+deprivation/reperfusion+injured+cardiomyocytes.">Moderate therapeutic hypothermia induces multimodal protective effects in oxygen-glucose deprivation/reperfusion injured cardiomyocytes.</a> Mitochondrion. 35, 1-10 (2017).</li><li>Cooper, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothermic+circulatory+arrest+causes+multisystem+vascular+endothelial+dysfunction+and+apoptosis.">Hypothermic circulatory arrest causes multisystem vascular endothelial dysfunction and apoptosis.</a> ANNALS OF THORACIC SURGERY. 69 (3), 696-702 (2000).</li><li>Kajimoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+cerebral+perfusion+prevents+abnormalities+in+glutamate+cycling+and+neuronal+apoptosis+in+a+model+of+infant+deep+hypothermic+circulatory+arrest+and+reperfusion.">Selective cerebral perfusion prevents abnormalities in glutamate cycling and neuronal apoptosis in a model of infant deep hypothermic circulatory arrest and reperfusion.</a> JOURNAL OF CEREBRAL BLOOD FLOW AND METABOLISM. 36 (11), 1992-2004 (2016).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+Hypothermic+Circulatory+Arrest+Does+Not+Show+Better+Protection+for+Vital+Organs+Compared+with+Moderate+Hypothermic+Circulatory+Arrest+in+Pig+Model.">Deep Hypothermic Circulatory Arrest Does Not Show Better Protection for Vital Organs Compared with Moderate Hypothermic Circulatory Arrest in Pig Model.</a> Biomed Research International. 2019, 1420216 (2019).</li><li>Davidson, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+cell+lines+derived+from+adult+human+ventricular+cardiomyocytes.">Novel cell lines derived from adult human ventricular cardiomyocytes.</a> JOURNAL OF MOLECULAR AND CELLULAR CARDIOLOGY. 39 (1), 133-147 (2005).</li><li>Khan, K., Makhoul, G., Yu, B., Schwertani, A., Cecere, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytoprotective+impact+of+yes-associated+protein+1+after+ischemia-reperfusion+injury+in+AC16+human+cardiomyocytes.">The cytoprotective impact of yes-associated protein 1 after ischemia-reperfusion injury in AC16 human cardiomyocytes.</a> EXPERIMENTAL BIOLOGY AND MEDICINE. 244 (10), 802-812 (2019).</li><li>Pan, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-146a+attenuates+apoptosis+and+modulates+autophagy+by+targeting+TAF9b/P53+pathway+in+doxorubicin-induced+cardiotoxicity.">miR-146a attenuates apoptosis and modulates autophagy by targeting TAF9b/P53 pathway in doxorubicin-induced cardiotoxicity.</a> Cell Death Discovery. 10 (9), 668 (2019).</li><li>Schmitt, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S100B+modulates+IL-6+release+and+cytotoxicity+from+hypothermic+brain+cells+and+inhibits+hypothermia-induced+axonal+outgrowth.">S100B modulates IL-6 release and cytotoxicity from hypothermic brain cells and inhibits hypothermia-induced axonal outgrowth.</a> NEUROSCIENCE RESEARCH. 59 (1), 68-73 (2007).</li><li>Tong, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+hypothermia+therapy+attenuates+LPS-induced+microglia+neuroinflammation+via+the+STAT3+pathway.">Deep hypothermia therapy attenuates LPS-induced microglia neuroinflammation via the STAT3 pathway.</a> Neuroscience. 358, 201-210 (2017).</li><li>Yu, Z. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Troxerutin+attenuates+oxygenglucose+deprivation+and+reoxygenationinduced+oxidative+stress+and+inflammation+by+enhancing+the+PI3K/AKT/HIF1alpha+signaling+pathway+in+H9C2+cardiomyocytes.">Troxerutin attenuates oxygenglucose deprivation and reoxygenationinduced oxidative stress and inflammation by enhancing the PI3K/AKT/HIF1alpha signaling pathway in H9C2 cardiomyocytes.</a> Molecular Medicine Reports. 22 (2), 1351-1361 (2020).</li><li>Drescher, C., Diestel, A., Wollersheim, S., Berger, F., Schmitt, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+does+hypothermia+protect+cardiomyocytes+during+cardioplegic+ischemia.">How does hypothermia protect cardiomyocytes during cardioplegic ischemia.</a> European journal of cardiothoracic surgery. 40 (2), 352-359 (2011).</li><li>Diestel, A., Drescher, C., Miera, O., Berger, F., Schmitt, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothermia+protects+H9c2+cardiomyocytes+from+H2O2+induced+apoptosis.">Hypothermia protects H9c2 cardiomyocytes from H2O2 induced apoptosis.</a> Cryobiology. 62 (1), 53-61 (2011).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIF-1alpha/BNIP3+signaling+pathway-induced-autophagy+plays+protective+role+during+myocardial+ischemia-reperfusion+injury.">HIF-1alpha/BNIP3 signaling pathway-induced-autophagy plays protective role during myocardial ischemia-reperfusion injury.</a> BIOMEDICINE &amp; PHARMACOTHERAPY. 120, 109464 (2019).</li><li>An, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exogenous+IL-19+attenuates+acute+ischaemic+injury+and+improves+survival+in+male+mice+with+myocardial+infarction.">Exogenous IL-19 attenuates acute ischaemic injury and improves survival in male mice with myocardial infarction.</a> BRITISH JOURNAL OF PHARMACOLOGY. 176 (5), 699-710 (2019).</li><li>Han, Y. S., Schaible, N., Tveita, T., Sieck, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discontinued+stimulation+of+cardiomyocytes+provides+protection+against+hypothermia-rewarming-induced+disruption+of+excitation-contraction+coupling.">Discontinued stimulation of cardiomyocytes provides protection against hypothermia-rewarming-induced disruption of excitation-contraction coupling.</a> EXPERIMENTAL PHYSIOLOGY. 103 (6), 819-826 (2018).</li><li>Yarbrough, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase+inhibition+attenuates+contractile+dysfunction+following+cardioplegic+arrest+and+rewarming+in+the+setting+of+left+ventricular+failure.">Caspase inhibition attenuates contractile dysfunction following cardioplegic arrest and rewarming in the setting of left ventricular failure.</a> Journal of cardiovascular pharmacology. 44 (6), 645-650 (2004).</li><li>Egorov, Y. V., Glukhov, A. V., Efimov, I. R., Rosenshtraukh, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothermia-induced+spatially+discordant+action+potential+duration+alternans+and+arrhythmogenesis+in+nonhibernating+versus+hibernating+mammals.">Hypothermia-induced spatially discordant action potential duration alternans and arrhythmogenesis in nonhibernating versus hibernating mammals.</a> AMERICAN JOURNAL OF PHYSIOLOGY-HEART AND CIRCULATORY PHYSIOLOGY. 303 (8), 1035-1046 (2012).</li><li>Bobi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderate+Hypothermia+Modifies+Coronary+Hemodynamics+and+Endothelium-Dependent+Vasodilation+in+a+Porcine+Model+of+Temperature+Management.">Moderate Hypothermia Modifies Coronary Hemodynamics and Endothelium-Dependent Vasodilation in a Porcine Model of Temperature Management.</a> Journal of the American Heart Association. 9 (3), 014035 (2020).</li><li>Dietrichs, E. S., Tveita, T., Myles, R., Smith, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+ECG-biomarker+for+cardiac+arrest+during+hypothermia.">A novel ECG-biomarker for cardiac arrest during hypothermia.</a> Scandinavian Journal of Trauma Resuscitation &amp; Emergency Medicine. 28 (1), 27 (2020).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Farklı hücre türleri arasındaki etkileşimler de dahil olmak üzere sağlam hayvanların karmaşıklıkları, genellikle I /R yaralanmasının belirli bileşenlerinin ayrıntılı çalışmalarını önler. Bu nedenle, in vivo iskemi sonrası moleküler değişiklikleri doğru bir şekilde yansıtabilecek bir in vitro hücre modeli oluşturmak gerekir. OGD modelleri üzerinde yapılan araştırmalar daha önce13,22ve birçok sofistike yöntem oluşturulmuştu...

İskemi/reperfüzyondan türetilmiş miyokard disfonksiyonu kalp cerrahisi sonrası hastalarda sık görülen bir klinik senaryodur1,2. Zengin olmayan düşük akış perfüzyonu ve toplam dolaşım durması dönemlerinde, her türlü kalp hücresini içeren hasarlar oluşmaya devam eder. Özellikle, kardiyomiyositlerin iskemik yaralanmaya duyarlılığı diğer hücre popülasyonlarından daha yüksektir. Şu anda, terapötik hipotermi (TH), kalp cerrahisi uygulanan hastalarda beklenen iskemik hakarete karşı önemli bir koruma sağlar3,4. TH, 14-34 ° C çekirdek vücut sıcaklığı olarak tanımlanır, ancak kalp cerrahisi sırasında soğutma tanımı ile ilgili bir fikir birliği yoktur5,6,7. 2013 yılında, uluslararası bir uzman paneli, sistemik hipotermik dolaşım tutuklamasının çeşitli sıcaklık aralıklarını sınıflandırmak için standartlaştırılmış bir raporlama sistemi önerdi8. Beynin elektroensefalografisi ve metabolizma çalışmalarına dayanarak hipotermiyi dört düzeye ayırdılar: derin hipotermi (≤ 14 °C), derin hipotermi (14.1-20 °C), orta hipotermi (20.1-28 °C) ve hafif hipotermi (28.1-34 °C). Uzman konsensüsü, açık ve düzgün bir sınıflandırma sağlayarak çalışmaların daha karşılaştırılabilir olmasını ve klinik olarak daha alakalı sonuçlar vermesini sağladı. TH tarafından sağlanan bu koruma, hücrelerin metabolik aktivitesini azaltma kapasitesine dayanır ve yüksek enerjili fosfat tüketim hızlarını daha da sınırlar9,10. Bununla birlikte, miyokard korumasında TH'nin rolü tartışmalıdır ve hipotermi dereceine bağlı olarak birden fazla etkiye sahip olabilir.
Miyokard I/R'ye artmış hücre apoptizisi11eşlik ettiği bilinmektedir. Son raporlar, programlanmış kardiyomiyosit ölümünün açık kalp ameliyatı sırasında arttığını ve nekrozla çakışabileceğini ve böylece ölü miyokard hücrelerinin sayısını artırdığını gözlemlemıştır12. Bu nedenle kardiyomiyosit apoptozun azaltılması klinik pratikte yararlı bir terapötik yaklaşımdır. Fare atriyal HL-1 kardiyomiyosit modelinde, terapötik hipotermi, reperfüzyon sırasında sitokrom c ve apoptoz indükleyici faktörün (AIF) mitokondriyal salınımını azalttığı gösterilmiştir13. Bununla birlikte, sıcaklığın apoptozu düzenlemedeki etkisi tartışmalıdır ve hipotermi derecesine bağlı olduğu görülmektedir. Cooper ve meslektaşları, normotermik kardiyopulmoner bypass kontrol grubuna kıyasla, derin hipotermik dolaşım durması olan domuzlardan gelen miyokard dokusunun apoptoz oranının14arttığını gözlemlediler. Ek olarak, bazı çalışmaların sonuçları derin hipotermi apoptoz yolunu aktive edebilirken, daha az agresif hipotermi12 , 15,16yolunu inhibe ediyor gibi görünmektedir. Bu sonucun nedeni, iskemik yaralanma ile ilişkili kafa karıştırıcı etkilerden ve sıcaklığın miyokard dokusunu etkilediği mekanizmaların anlaşılmamasından kaynaklanabilir. Bu nedenle, apoptozun artırıldığı veya zayıfladığı sıcaklık sınırları doğru bir şekilde tanımlanmalıdır.
Hipotermi etkinliği ile ilişkili mekanizmaların daha iyi anlaşılması ve insanlarda uygulanması için rasyonel bir temel sağlamak için, klinik durum için tekrarlanabilir bir şekilde gözlemlenene benzer hasar üretebilecek in vivo koşullara benzer bir kültür durumunun tanımlanması esastır. Bu hedefe ulaşmak için önemli bir adım, kardiyomiyosit apoptozun indüklene için en uygun koşulları belirlemektir. Bu nedenle, bu çalışmada, iskemi-reperfüzyonun bir facile in vitro modeli olan kültürlü hücrelerle yapılan oksijen-glikoz yoksunluğu deneyleri ile ilgili metodolojik ayrıntıları araştırdık. Ayrıca, farklı hipoksik-iskemik zamanların kardiyomiyosit apoptoz üzerindeki etkisini değerlendirdik ve farklı sıcaklık koşullarının hücreli apoptoz in vitro üzerindeki etkisine ilişkin hipotezimizi doğruladık.

<table><tbody><tr><td>Annexin V-FITC cell apoptosis detection kit</td><td>Bio-Technology,China</td><td>C1062M</td><td></td></tr><tr><td>Cardiac myocyte growth supplement</td><td>Sciencell,USA</td><td>6252</td><td></td></tr><tr><td>Caspase 3 activity assay kit</td><td>Bio-Technology,China</td><td>C1115</td><td></td></tr><tr><td>Caspase 8 activity assay kit</td><td>Bio-Technology,China</td><td>C1151</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, no glucose</td><td>Gibco,USA</td><td>11966025</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s modified eagle medium</td><td>Gibco,USA</td><td>11960044</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Gibco,USA</td><td>16140071</td><td></td></tr><tr><td>Flow cytometry</td><td>CytoFLEX,USA</td><td>B49007AF</td><td></td></tr><tr><td>Human myocardial cells</td><td>BLUEFBIO,China</td><td>BFN60808678</td><td></td></tr><tr><td>Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1</td><td>Bio-Technology,China</td><td>C2006</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin solution</td><td>Gibco,USA</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>Reactive oxygen species assay kit</td><td>Bio-Technology,China</td><td>S0033S</td><td></td></tr><tr><td>Three-gas incubator</td><td>Memmert,Germany</td><td>ICO50</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td><td>Gibco,USA</td><td>25200056</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro assessment of myocardial protection following hypothermia-preconditioning in a human cardiac myocytes model

İskemi/reperfüzyondan türetilmiş miyokard disfonksiyonu kalp cerrahisi sonrası hastalarda sık görülen bir klinik senaryodur. Özellikle, kardiyomiyositlerin iskemik yaralanmaya duyarlılığı diğer hücre popülasyonlarından daha yüksektir. Şu anda hipotermi, beklenen iskemik hakarete karşı önemli bir koruma sağlar. Bununla birlikte, karmaşık hipotermi kaynaklı moleküler değişikliklerle ilgili araştırmalar sınırlı kalmaktadır. Bu nedenle, klinik durumda gözlemlenene benzer hasarlara neden olabilecek in vivo durumlara benzer bir kültür durumunun tekrarlanabilir bir şekilde tanımlanması esastır. İn vitro iskemi benzeri durumları taklit etmek için, bu modellerdeki hücreler oksijen /glikoz yoksunluğu (OGD) ile tedavi edildi. Ayrıca kalp cerrahisi sırasında kullanılan standart bir zaman-sıcaklık protokolü uyguladık. Ayrıca, miyokard hasarının nicel analizi için basit ama kapsamlı bir yöntem kullanmak için bir yaklaşım öneriyoruz. Apoptoz ilişkili proteinlerin apoptoz ve ekspresyon düzeyleri akış sitometrisi ve ELISA kiti kullanılarak değerlendirildi. Bu modelde, farklı sıcaklık koşullarının kardiyomiyosit apoptoz in vitro üzerindeki etkileri ile ilgili bir hipotezi test ettik. Bu modelin güvenilirliği sıkı sıcaklık kontrolüne, kontrol edilebilir deneysel prosedürlere ve istikrarlı deneysel sonuçlara bağlıdır. Ek olarak, bu model hipotermik kardiyoproteksiyonun moleküler mekanizmasını incelemek için kullanılabilir, bu da hipotermi ile kullanılmak üzere tamamlayıcı tedavilerin geliştirilmesi için önemli etkileri olabilir.

OGD maruziyetinin HCM'lerin canlılığı üzerindeki etkisi CCK-8 tahlili ile belirlendi. Kontrol grubunda gözlenenlerle karşılaştırıldığında, hücre canlılığı zamana bağlı olarak önemli ölçüde azaldı (Şekil 2A). Reperfüzyondan sonra farklı zamanlarda HCM'lerin apoptoz oranları, 0 ila 16 saat arasında, apoptoz oranlarının kademeli olarak arttığı ve 16 saat zaman noktasında maksimum orana ulaştığı belirli bir eğilim göstermiştir (Şe...

Watch this Scientific Journal Video about In vitro Assessment of Myocardial Protection following Hypothermia-Preconditioning in a Human Cardiac Myocytes Model at JoVE.com

In vitro Assessment of Myocardial Protection following Hypothermia-Preconditioning in a Human Cardiac Myocytes Model

Farklı hipotermi derecelerinin miyokard koruması üzerindeki belirgin etkileri ayrıntılı olarak değerlendirilmemiştir. Bu çalışmanın amacı, insan kardiyomiyosit tabanlı bir modelde farklı hipotermi tedavilerinin ardından hücre ölüm seviyelerini ölçmek ve gelecekteki derinlemesine moleküler araştırmaların temelini atmaktı.

İnsan Kardiyak Miyosit Modelinde Hipotermi-Önkoşullama Sonrası Miyokard Korumasının İn vitro Değerlendirmesi

Ischemia/reperfusion-derived myocardial dysfunction is a common clinical scenario in patients after cardiac surgery. In particular, the sensitivity of ...

in-vitro-assessment-myocardial-protection-following-hypothermia

Research

JoVE Journal

Medicine

3.0K Görüntüleme.  Children's Hospital of Nanjing Medical University. Farklı hipotermi derecelerinin miyokard koruması üzerindeki belirgin etkileri ayrıntılı olarak değerlendirilmemiştir. Bu çalışmanın amacı, insan kardiyomiyosit tabanlı bir modelde farklı hipotermi tedavilerinin ardından hücre ölüm seviyelerini ölçmek ve gelecekteki derinlemesine moleküler araştırmaların temelini atmaktı.

Video: In vitro Assessment of Myocardial Protection following Hypothermia-Preconditioning in a Human Cardiac Myocytes Model

A Murine Closed-chest Model of Myocardial Ischemia and Reperfusion

Surgical trauma by thoracotomy in open-chest models of coronary ligation induces an immune response which modifies different mechanisms involved in ischemia and reperfusion. Immune response includes cytokine expression and release or secretion of endogenous ligands of innate immune receptors. Activation of innate immunity can potentially modulate infarct size. We have modified an existing murine closed-chest model using hanging weights which could be useful for studying myocardial pre- and postconditioning and the role of innate immunity in myocardial ischemia and reperfusion. This model allows animals to recover from surgical trauma before onset of myocardial ischemia.
Volatile anesthetics have been intensely studied and their preconditioning effect for the ischemic heart is well known. However, this protective effect precludes its use in open chest models of coronary artery ligation. Thus, another advantage could be the use of the well controllable volatile anesthetics for instrumentation in a chronic closed-chest model, since their preconditioning effect lasts up to 72 hours. Chronic heart diseases with intermittent ischemia and multiple hit models are other possible applications of this model.
For the chronic closed-chest model, intubated and ventilated mice undergo a lateral blunt thoracotomy via the 4th intercostal space. Following identification of the left anterior descending a ligature is passed underneath the vessel and both suture ends are threaded through an occluder. Then, both suture ends are passed through the chest wall, knotted to form a loop and left in the subcutaneous tissue. After chest closure and recovery for 5 days, mice are anesthetized again, chest skin is reopened and hanging weights are hooked up to the loop under ECG control.
At the end of the ischemia/reperfusion protocol, hearts can be stained with TTC for infarct size assessment or undergo perfusion fixation to allow morphometric studies in addition to histology and immunohistochemistry.

Surgical trauma induces an inflammatory response. Cytokines and endogenous ligands are known to modulate myocardial infarct size following ischemia and reperfusion. We present a modified closed-chest model of murine ischemia and reperfusion using hanging weights to minimize effects of thoracotomy.

Miyokard İskemi ve Reperfüzyon bir Mürin Kapalı göğüs Modeli

Surgical trauma by thoracotomy in open-chest models of coronary ligation induces an immune response which modifies different mechanisms involved in ...

Tıp

Murine Isolated Heart Model of Myocardial Stunning Associated with Cardioplegic Arrest

The following protocol is of use to evaluate impaired cardiac function or myocardial stunning following moderate ischemic insults. The technique is useful for modeling ischemic injury associated with numerous clinically relevant phenomenon including cardiac surgery with cardioplegic arrest and cardiopulmonary bypass, off-pump CABG, transplant, angina, brief ischemia, etc. The protocol presents a general method to model hypothermic hyperkalemic cardioplegic arrest and reperfusion in rodent hearts focusing on measurement of myocardial contractile function. In brief, a mouse heart is perfused in langendorff mode, instrumented with an intraventricular balloon, and baseline cardiac functional parameters are recorded. Following stabilization, the heart is then subject to brief infusion of a cardioprotective hypothermic cardioplegia solution to initiate diastolic arrest. Cardioplegia is delivered intermittently over 2 hr. The heart is then reperfused and warmed to normothermic temperatures and recovery of myocardial function is monitored. Use of this protocol results in reliable depressed cardiac contractile function free from gross myocardial tissue damage in rodents.

The goal of this protocol to assess myocardial stunning following ischemic cardioplegic arrest in rodents.

Kardiyoplejik Tutuklanma ile Miyokard Çarpıcı İlişkili sıçan İzole Kalp Modeli

The following protocol is of use to evaluate impaired cardiac function or myocardial stunning following moderate ischemic insults. The technique is useful ...

Induction and Assessment of Ischemia-reperfusion Injury in Langendorff-perfused Rat Hearts

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for myocardial infarction and cardiac complications of thoracic surgery. The ability of certain drugs to precondition the myocardium against ischemia reperfusion injury has led to multiple clinical trials, with little success. The isolated heart model allows acute observation of the functional effects of ischemia reperfusion injury in real time, including the effects of various pharmacological interventions administered at any time-point before or within the ischemia-reperfusion injury window. Since brief periods of ischemia can precondition the heart against ischemic injury, in situ aortic cannulation is performed to allow for functional assessment of non-preconditioned myocardium. A saline filled balloon is placed into the left ventricle to allow for real-time measurement of pressure generation. Ischemic injury is simulated by the cessation of perfusion buffer flow, followed by reperfusion. The duration of both ischemia and reperfusion can be modulated to examine biochemical events at any given time-point. Although the Langendorff isolated heart model does not allow for the consideration of systemic events affecting ischemia and reperfusion, it is an excellent model for the examination of acute functional and biochemical events within the window of ischemia reperfusion injury as well as the effect of pharmacological intervention on cardiac pre- and postconditioning. The goal of this protocol is to demonstrate how to perform in situ aortic cannulation and heart excision followed by ischemia/reperfusion injury in the Langendorff model.

The isolated rat heart is an enduring model for ischemia reperfusion injury. Here, we describe the process of harvesting the beating heart from a rat via in situ aortic cannulation, Langendorff perfusion of the heart, simulated ischemia-reperfusion injury, and infarct staining to confirm the extent of ischemic insult.

Langendorff-perfüze sıçan Hearts indüksiyon ve İskemi-reperfüzyon Hasarı Değerlendirilmesi

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for ...

A Recovery Cardiopulmonary Bypass Model Without Transfusion or Inotropic Agents in Rats

Cardiopulmonary bypass (CPB) is indispensable in cardiovascular surgery. Despite the dramatic refinement of CPB technique and devices, multi-organ complications related to prolonged CPB still compromise the outcome of cardiovascular surgeries, and may worsen postoperative morbidity and mortality. Animal models recapitulating the clinical usage of CPB enable the clarification of the pathophysiological processes that occur during CPB, and facilitate pre-clinical studies to develop strategies protecting against these complications. Rat CPB models are advantageous because of their greater cost-effectiveness, convenient experimental processes, abundant testing methods at the genetic or protein levels, and genetic consistency. They can be used for investigating the immune system activation and synthesis of proinflammatory cytokines, compliment activation, and production of oxygen free radicals. The rat models have been refined and have gradually taken the place of large-animal models. Here, we describe a simple CPB model without transfusion and/or inotropic agents in a rat. This recovery model allows the study of the long-term multiple organ sequelae of CPB.

Here, we present a protocol to describe a simple recovery cardiopulmonary bypass model without transfusion or inotropic agents in a rat. This model allows the study of the long-term multiple organ sequelae of cardiopulmonary bypass.

Kan nakli veya Sıçanlarda Inotropic ajanlar olmadan kurtarma Kardiyopulmoner Bypass modeli

Cardiopulmonary bypass (CPB) is indispensable in cardiovascular surgery. Despite the dramatic refinement of CPB technique and devices, multi-organ ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model Throughput of Engineered Cardiac Tissues

Heart failure remains the leading cause of death worldwide, creating a pressing need for better preclinical models of the human heart. Tissue engineering is crucial for basic science cardiac research; in vitro human cell culture eliminates the interspecies differences of animal models, while a more tissue-like 3D environment (e.g., with extracellular matrix and heterocellular coupling) simulates in vivo conditions to a greater extent than traditional two-dimensional culture on plastic Petri dishes. However, each model system requires specialized equipment, for example, custom-designed bioreactors and functional assessment devices. Additionally, these protocols are often complicated, labor-intensive, and plagued by the failure of the small, delicate tissues.
This paper describes a process for generating a robust human engineered cardiac tissue (hECT) model system using induced pluripotent stem-cell-derived cardiomyocytes for the longitudinal measurement of tissue function. Six hECTs with linear strip geometry are cultured in parallel, with each hECT&#160;suspended from a pair of force-sensing polydimethylsiloxane (PDMS) posts attached to PDMS racks. Each post is capped with a black PDMS stable post tracker (SPoT), a new feature that improves the ease of use, throughput, tissue retention, and data quality. The shape allows for the reliable optical tracking of post deflections, yielding improved twitch force tracings with absolute active and passive tension. The cap geometry eliminates tissue failure due to hECTs slipping off the posts, and as they involve a second step after PDMS rack fabrication, the SPoTs can be added to existing PDMS post-based designs without major changes to the bioreactor fabrication process.
The system is used to demonstrate the importance of measuring hECT function at physiological temperatures and shows stable tissue function during data acquisition. In summary, we describe a state-of-the-art model system that reproduces key physiological conditions to advance the biofidelity, efficiency, and rigor of engineered cardiac tissues for in vitro applications.

Three-dimensional cardiac tissues bioengineered using stem-cell-derived cardiomyocytes have emerged as promising models for studying healthy and diseased human myocardium in vitro while recapitulating key aspects of the native cardiac niche. This manuscript describes a protocol for fabricating and analyzing high-content engineered cardiac tissues generated from human induced pluripotent stem-cell-derived cardiomyocytes.

Tasarlanmış Kardiyak Dokuların Veri Toplamasını ve Model Verimini İyileştirmek için Bir Biyoreaktör Tasarlama

Heart failure remains the leading cause of death worldwide, creating a pressing need for better preclinical models of the human heart. Tissue engineering ...

Biyomühendislik

Pre-clinical Model of Cardiac Donation after Circulatory Death

Cardiac transplantation demand is on the rise; nevertheless, organ availability is limited due to a paucity of suitable donors. Organ donation after circulatory death (DCD) is a solution to address this limited availability, but due to a period of prolonged warm ischemia and the risk of tissue injury, its routine use in cardiac transplantation is seldom seen. In this manuscript we provide a detailed protocol closely mimicking current clinical practices in the context of DCD with continuous monitoring of heart function, allowing for the evaluation of novel cardioprotective strategies and interventions to decrease ischemia-reperfusion injury.
In this model, the DCD protocol is initiated in anesthetized Lewis rats by stopping ventilation to induce circulatory death. When systolic blood pressure drops below 30 mmHg, the warm ischemic time is initiated. After a pre-set warm ischemic period, hearts are flushed with a normothermic cardioplegic solution, procured, and mounted onto a Langendorff ex vivo heart perfusion system. Following 10 min of initial reperfusion and stabilization, cardiac reconditioning is continuously evaluated for 60 min using intraventricular pressure monitoring. A heart injury is assessed by measuring cardiac troponin T and the infarct size is quantified by histological staining. The warm ischemic time can be modulated and tailored to develop the desired amount of structural and functional damage. This simple protocol allows for the evaluation of different cardioprotective conditioning strategies introduced at the moment of cardioplegia, initial reperfusion and/or during ex vivo perfusion. Findings obtained from this protocol can be reproduced in large models, facilitating clinical translation.

This protocol shows a simple and flexible approach for the evaluation of new conditioning agents or strategies to increase the feasibility of cardiac donation after circulatory death.

Dolaşım ölümünden sonra kardiyak bağış öncesi klinik model

Cardiac transplantation demand is on the rise; nevertheless, organ availability is limited due to a paucity of suitable donors. Organ donation after ...

A Cryoinjury Model to Study Myocardial Infarction in the Mouse

The use of animal models is essential for developing new therapeutic strategies for acute coronary syndrome and its complications. In this article, we demonstrate a murine cryoinjury infarct model that generates precise infarct sizes with high reproducibility and replicability. In brief, after intubation and sternotomy of the animal, the heart is lifted from the thorax. The probe of a handheld liquid nitrogen delivery system is applied onto the myocardial wall to induce cryoinjury. Impaired ventricular function and electrical conduction can be monitored with echocardiography or optical mapping. Transmural myocardial remodeling of the infarcted area is characterized by collagen deposition and loss of cardiomyocytes. Compared to other models (e.g., LAD-ligation), this model utilizes a handheld liquid nitrogen delivery system to generate more uniform infarct sizes.

This article demonstrates a model to study cardiac remodeling after myocardial cryoinjury in mice.

Farede Miyokard Enfarktüsü Çalışması İçin Kriyoyaralanma Modeli

The use of animal models is essential for developing new therapeutic strategies for acute coronary syndrome and its complications. In this article, we ...

In Vitro Assessment of Cardiac Function Using Skinned Cardiomyocytes

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring apparatus and a motor to perform functional studies. These studies will allow measurement of cardiomyocyte stiffness (passive force) and its activation with different calcium (Ca2+)-containing solutions to determine, amongst others: maximum force development, myofilament Ca2+-sensitivity (pCa50), cooperativity (nHill) and the rate of force redevelopment (ktr). This method also enables determination of the effects of drugs acting directly on myofilaments and of the expression of exogenous recombinant proteins on both active and passive properties of cardiomyocytes. Clinically, skinned cardiomyocyte studies highlight the pathophysiology of many myocardial diseases and allow in vitro assessment of the impact of therapeutic interventions targeting the myofilaments. Altogether, this technique enables the clarification of cardiac pathophysiology by investigating correlations between in vitro and in vivo parameters in animal models and human tissue obtained during open heart or transplant surgery.

This protocol aims to describe step-by-step the technique of extraction and assessment of cardiac function using skinned cardiomyocytes. This methodology allows measurement and acutemodulation of myofilament function using small frozen biopsies that can be collected from different cardiac locations, from mice to men.

Derili Kardiyomiyositler Kullanarak Kardiyak Fonksiyonun İn Vitro Değerlendirilmesi

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring ...

Assessment of Ex Vivo Murine Biventricular Function in a Langendorff Model

Primary graft dysfunction (PGD) remains the leading cause of early death following heart transplantation. Prolonged ischemic time during cold preservation is an important risk factor for PGD, and reliable evaluation of cardiac function is essential to study the functional responses of the donor heart after cold preservation. The accompanying video describes a technique to assess murine right and left ventricular function using ex vivo perfusion based in a Langendorff model after cold preservation for different durations. In brief, the heart is isolated and stored in a cold histidine-tryptophan-ketoglutarate (HTK) solution. Then, the heart is perfused with a Kreb buffer in a Langendorff model for 60 min. A silicone balloon is inserted into the left and right ventricle, and cardiac functional parameters are recorded (dP/dt, pressure-volume relationships). This protocol allows the reliable evaluation of cardiac function after different heart preservation protocols. Importantly, this technique allows the study of cardiac preservation responses specifically in native cardiac cells. The use of very small murine hearts allows access to an enormous array of transgenic mice to investigate the mechanisms of PGD.

Assessment of Ex Vivo Murine Biventricular Function in a Langendorff Model

Presented here is a protocol to reliably quantify the right and left ventricular function of donor hearts after cold preservation using an ex vivo perfusion system.

Ex Vivo Murin Biventriküler Fonksiyonunun Langendorff Modelinde Değerlendirilmesi

Primary graft dysfunction (PGD) remains the leading cause of early death following heart transplantation. Prolonged ischemic time during cold preservation ...

Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices

The isolation of ventricular cardiac myocytes from animal and human hearts is a fundamental method in cardiac research. Animal cardiomyocytes are commonly isolated by coronary perfusion with digestive enzymes. However, isolating human cardiomyocytes is challenging because human myocardial specimens usually do not allow for coronary perfusion, and alternative isolation protocols result in poor yields of viable cells. In addition, human myocardial specimens are rare and only regularly available at institutions with on-site cardiac surgery. This hampers the translation of findings from animal to human cardiomyocytes. Described here is a reliable protocol that enables efficient isolation of ventricular myocytes from human and animal myocardium. To increase the surface-to-volume ratio while minimizing cell damage, myocardial tissue slices 300 &#181;m thick are generated from myocardial specimens with a vibratome. Tissue slices are then digested with protease and collagenase. Rat myocardium was used to establish the protocol and quantify yields of viable, calcium-tolerant myocytes by flow-cytometric cell counting. Comparison with the commonly used tissue-chunk method showed significantly higher yields of rod-shaped cardiomyocytes (41.5 &#177; 11.9 vs. 7.89 &#177; 3.6%, p &#60; 0.05). The protocol was translated to failing and non-failing human myocardium, where yields were similar as in rat myocardium and, again, markedly higher than with the tissue-chunk method (45.0 &#177; 15.0 vs. 6.87 &#177; 5.23 cells/mg, p &#60; 0.05). Notably, with the protocol presented it is possible to isolate reasonable numbers of viable human cardiomyocytes (9&#8211;200 cells/mg) from minimal amounts of tissue (&#60;50 mg). Thus, the method is applicable to healthy and failing myocardium from both human and animal hearts. Furthermore, it is possible to isolate excitable and contractile myocytes from human tissue specimens stored for up to 36 h in cold cardioplegic solution, rendering the method particularly useful for laboratories at institutions without on-site cardiac surgery.

Presented is a protocol for the isolation of human and animal ventricular cardiomyocytes from vibratome-cut myocardial slices. High yields of calcium-tolerant cells (up to 200 cells/mg) can be obtained from small amounts of tissue (&#60;50 mg). The protocol is applicable to myocardium exposed to cold ischemia for up to 36 h.

Vibratome-Cut Miyokardiyal Dilimlerden İnsan Ventriküler Kardiyomiyositlerin İzolasyon

The isolation of ventricular cardiac myocytes from animal and human hearts is a fundamental method in cardiac research. Animal cardiomyocytes are commonly ...