Die Methode ist relativ einfach und ermöglicht eine effiziente Gen-Editierung von Rhesusaffen-B-Zellen. Die Methode ermöglicht die Testung von geneditierten B-Zellen zu therapeutischen Zwecken bei Rhesusaffen. Es eignet sich auch für die präklinische B-Zelltherapie-Forschung.
Das allgemeine Verfahren kann für andere Zelltypen angepasst werden. Wenn das Verfahren korrekt befolgt wird, sollte man keine Kämpfe erwarten. Da jedoch die gRNA-Schneideeffizienz und eine qualitativ hochwertige Charge einer rekombinanten AAV6-liefernden Vorlage von entscheidender Bedeutung sind.
Zunächst werden die B-Zellkulturmedien in einem 37 Grad Celsius heißen Wasserbad vorgewärmt. Tauen Sie die B-Zell-Stimulanzien auf Eis auf. Bereiten Sie ein Röhrchen mit geeigneter Größe vor, das ein vorgewärmtes Auftaumedium enthält.
Tauen Sie ein bis zwei Fläschchen mit primären Rhesusaffen-Splenozyten oder PBMCs in einem 37-Grad-Celsius-Wasserbad auf. Die Splenozyten werden in das vorbereitete Röhrchen mit einem vorgewärmten Auftaumedium dekantiert. Spülen Sie die Kryoröhren, um alle Zellen zu sammeln.
Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 G für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen zum Waschen in 10 Milliliter Auftaumedium. Wiederholen Sie die Zentrifugationen dreimal, um das Gefriermedium zu entfernen.
Nach der letzten Zentrifugation resuspendieren die Zellen schätzungsweise fünf mal 10 bis sechs Zellen pro Milliliter in einem B-Zellkulturmedium. Kombinieren Sie 10 Mikroliter Zellsuspension mit 10 Mikrolitern 0,4% Trypanblau und zählen Sie die Zellen auf einem Hämozytometer. Stellen Sie die Zellkonzentration auf dreimal 10 auf die sechs Zellen pro Milliliter mit B-Zellkulturmedium entsprechend der Zellzahl ein.
Fügen Sie dann die B-Zell-Stimulanzien zu ihren endgültigen Konzentrationen hinzu und mischen Sie. Die Zellen werden in eine Zellkulturschale gegeben und bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid 48 Stunden lang inkubiert. Nach dem Absetzen sollten die Zellen eine dichte Monoschicht bilden und kleine Zellhaufen können bereits sichtbar sein.
Nach etwa zwei Tagen sollten die Zellen gesund und unregelmäßig sein und sichtbar größere Cluster gebildet haben. Bereiten Sie nach der Aktivierung der B-Zellen die Reagenzien für die Elektroporation und Transduktion vor. DMSO-Nuklease-freier Duplexpuffer, Puffer T und Puffer E oder E2 aus dem Elektroporationskit auf Raumtemperatur vorwärmen.
Tauen Sie die rAAV6-Homologie-gerichtete Reparaturschablone (HDRT) und die B-Zell-Stimulanzien auf Eis auf. Resuspendieren Sie die CRISPR-Cas9-Single-Guide-RNA oder sgRNA bei 100 Mikromolaren im Duplexpuffer. 10 Minuten bei Raumtemperatur rekonstituieren und durch Vortexen und Schnippen mischen.
Legen Sie die rekonstituierte sgRNA bis zur Verwendung auf Eis. Bereiten Sie für die 10-Mikroliter-Elektroporation 550 Mikroliter B-Zellkulturmedium mit Stimulanzien und 1% DMSO vor. Geben Sie 50 Mikroliter dieses Mediums mit oder ohne Antibiotika in eine 48-Well-Zellkulturplatte.
Fügen Sie dann dem Medium in den Vertiefungen rAAV6 HDRT hinzu, bis zu 20% des Volumens des Vertiefungs. Das zubereitete Gericht und das restliche Medium in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlensäure vorwärmen. Als nächstes bereiten Sie für die 10-Mikroliter-Elektroporation 1,15 Mikroliter Ribonukleoprotein oder RNP vor, indem 0,4 Mikroliter 61-mikromolares Cas9 mit 0,75 Mikrolitern 100-mikromolarer sgRNA in Duplexpuffer gemischt werden.
Inkubieren Sie das RNP 15 Minuten lang bei Raumtemperatur, bevor Sie es mit den Zellen mischen. Nach der Inkubation können mehrere RNPs kombiniert werden, wenn mehr als ein Locus gleichzeitig anvisiert werden soll. Als nächstes bereiten Sie die Zellen für die Elektroporation vor.
Lassen Sie die Zellen bei Raumtemperatur, um Temperaturschocks zu vermeiden. Ernten Sie die Zellen nach der Inkubation in ein geeignetes Gefäß. Spülen Sie die Schale mit DPBS aus, um die maximale Anzahl von Zellen zu sammeln.
Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 G für 10 Minuten. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in DPBS mit etwa zwei mal 10 zu den sechs Zellen pro Milliliter, basierend auf der Anzahl der Zellen, die in die Kultur gegeben werden. Kombinieren Sie gleiche Volumina Zellsuspension und 0,4% Trypanblau und zählen Sie mit einem Hämozytometer.
Nachdem Sie den Überstand zentrifugiert und verworfen haben, resuspendieren Sie die Zellen in vorgewärmtem Puffer T mit 5,55 mal 10 auf die sieben Zellen pro Milliliter, basierend auf der Zellzahl. Richten Sie das Transfektionssystem ein, indem Sie das Gerät einschalten und auf 1.350 Volt, 15 Millisekunden und einen Impuls einstellen. Platzieren Sie die Pipettenstation in der Laminar-Flow-Haube.
Bereiten Sie für jeden Satz von 10 Elektroporationen ein Transfektionsröhrchen mit drei Millilitern Puffer E vor.Führen Sie das Röhrchen in die Pipettenstation ein. Kombinieren Sie 1,15 Mikroliter RNP mit neun Mikrolitern Zellen pro Elektroporation. Bereiten Sie mindestens 20% mehr vor, um Blasen zu vermeiden, und inkubieren Sie vor der Elektroporation eine Minute lang bei Raumtemperatur.
Saugen Sie 10 Mikroliter RNP und Zellmischung in die Elektroporationsspitze einer Elektroporationspipette ein. Setzen Sie die geladene Pipette in die Pipettenstation ein und starten Sie die Elektroporation. Stellen Sie sicher, dass die Spitzen vollständig frei von Luftblasen sind, um Lichtbögen zu vermeiden.
Werfen Sie die elektroporierten Zellen sofort in das vorbereitete vorgewärmte kleine Volumen des Mediums, mit oder ohne rAAV6, innerhalb der 48-Well-Vertiefung aus. Kontrollproben ohne Transfektion in die Kulturvertiefungen geben. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für vier bis sechs Stunden.
Am Ende der Inkubation geben Sie 450 Mikroliter vorgewärmtes B-Zellkulturmedium, das Stimulanzien, DMSO und mit oder ohne Antibiotika enthält, in die Platte. Führen Sie nach 24 Stunden eine genomische DNA-Analyse durch. Quantifizieren Sie die Bearbeitungseffizienz mit der digitalen Tröpfchen-Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung eines Primers außerhalb des Homologiearms und eines Primers innerhalb des Inserts.
Führen Sie eine PCR durch, um die Insertionsstelle zu amplifizieren, und eine Sanger-Sequenzierung, um die korrekte Bearbeitung zu überprüfen. Um die Proteingehalte zu analysieren, kultivieren Sie die Zellen 40 bis 48 Stunden nach der Elektroporation, um Änderungen der Proteinexpression zu ermöglichen, und führen Sie eine Analyse mittels Durchflusszytometrie durch. Die Produktion von rAAV6 unter Verwendung eines Tetracyclin-fähigen, selbststummschaltenden adenoviralen Helfers führte zu einer Produktion von viermal 10 bis 10 GC pro Milliliter Zellkulturmedium und übertraf damit die Produktion mit einer helferfreien Dreifachtransfektion um das 30- bis 40-fache.
Die optionale Aufreinigung führte zur Eliminierung der Mehrheit der CD3+T-Zellen und CD14+- und CD16+myeloischen Zellen, wobei routinemäßig Reinheiten von 80 bis 95% CD20+B-Zellen erhalten wurden. Die Gen-Editierung von primären Rhesusaffen-B-Zellen wird hier gezeigt. Diese Studie behielt eine hohe Zellviabilität bei, während gleichzeitig die Leichtkettenexpression in 80% B-Zellen gelöscht wurde.
Die Mehrzahl der B-Zellen exprimierte immer noch den Isotyp IgM. Die Zugabe von rAAV6, das für den Antikörper 1485 HDRT kodiert, führte in 16 bis 21% der B-Zellen zu Gen-Editierung und Antikörper-1485-Oberflächenexpression, wenn auch mit einer geringeren Fluoreszenzintensität für Antikörperketten als für uneditierte B-Zellen. Die Zugabe von 1% DMSO und ausgedehnte, konzentrierte Inkubationen mit dem rAAV6 HDRT erhöhten im Allgemeinen die Bearbeitungseffizienz.
Mit dieser Methode wurden typischerweise fünf bis 20 % und bis zu 40 % Bearbeitungseffizienz erreicht, abhängig vom einzelnen Rhesusaffen und der Qualität der rAAV6-HDRT-Charge. Stellen Sie während der Elektroporation sicher, dass genügend Mischung für die Transfektion vorhanden ist und sich keine Blasen in der Spitze befinden. Die Zellen können mit jeder gewünschten Methode analysiert oder ein autologer Transfer in den Spender-Rhesusaffen durchgeführt werden.
