Dieses automatisierte Protokoll ermöglicht die histopathologische Aufbereitung von murinen Geweben mit Robotersystemen, die routinemäßig für die Verarbeitung und Einbettung menschlicher Proben verwendet werden, was die Qualität der Proben erheblich erhöht. Die Hauptvorteile dieser Technik sind, dass sie die Anzahl der methodischen Variablen reduziert und die Standardisierung der Verfahrensschritte verbessert. Demonstrieren das Verfahren, wird Francesca Boggio sein.
Francesca Boggio ist Pathologin, die in meinem Labor arbeitet. Beginnen Sie mit einer kleinen Pinzette, um die festen murinen Dickdarmgewebeproben aus dem neutral gepufferten Formalin auf eine Schnittarbeitsplatte in einer Petrischale zu übertragen. Verwenden Sie ein steriles Skalpell, um den Dickdarm in 0,2 bis 0,3 Zentimeter Fragmente zu schneiden, und verwenden Sie die Pinzette, um ein Segment in jede der drei nicht benachbarten kunststoff-protrudierenden Spitzen einer orientierten Paraffin-Einbettungskassette zu platzieren.
Drücken Sie vorsichtig die vier Kanten, um die Kassette zu schließen und legen Sie das Gitter in einen Kunststoff-Stützrahmen. Beschriften Sie dann den stützenden Rahmen, um das Sample zu identifizieren, und übertragen Sie die Kassette in das Raster. Drehen Sie den automatisierten Prozessor eine Stunde vor der Verarbeitung.
Wenn das Gerät angibt, dass das Paraffin geschmolzen ist, legen Sie den Metallkorb manuell in den automatisierten Prozessor ein. Wenn alle Kassetten eingelegt wurden, schließen Sie den Korb und öffnen Sie den Deckel der Retorte. Setzen Sie den Korb in das spezielle Gehäuse des Prozessors ein und schließen Sie den Retortendeckel.
Verwenden Sie den Touchscreen auf dem Gerätecomputer, um das Arbeitsprotokoll zu definieren, das die Reihenfolge der Lösungen, des Timings und der Temperatur auswählt, die gemäß dem in der Tabelle angegebenen Schema implementiert werden sollen. Klicken Sie auf das Symbol für den dedizierten Computer, um das Protokoll der Retorte zuzuweisen, die den Kassettenkorb enthält, und klicken Sie auf die Startschaltfläche. Wenn das Gerät das Ende des Protokolls mit einem dedizierten Symbol und einem Alarmton bestätigt, öffnen Sie den Retortendeckel und entfernen Sie den Korb aus dem Prozessor.
Eine Stunde vor der Gewebeeinbettung, schalten Sie den automatischen Einbettungsmittel ein und warten Sie, bis das Paraffin vollständig geschmolzen ist, wie das Paraffin-Badethermometer am Gerät zeigt. Übertragen Sie bis zu 32 verarbeitete Kassetten manuell vom Prozessorkorb in das Einbettgestell und öffnen Sie den Haupteinbettdeckel. Verwenden Sie den Touchscreen, um dem Robotersystem zu signalisieren, dass ein Rack eingelegt wird, und öffnen Sie den Deckel des Einlassgehäuses.
Legen Sie bis zu vier Racks in das Einlassgehäuse ein und schließen Sie den Einlassgehäusedeckel. Verwenden Sie dann den Touchscreen, um die einbettende Prozedur wie in der Tabelle angegeben zu starten. Wenn das Gerät das Ende des Protokolls mit dem dedizierten Symbol bestätigt, entfernen Sie das Auslassgestell und schließen Sie den Haupteinbettdeckel.
Übertragen Sie dann die eingebetteten Blöcke aus dem Rack in eine Aufbewahrungsbox. Kolonverkürzung, und kolonische Expression von pro-entzündlichen Genen, sind weit verbreitete Parameter für die Bewertung der Anwesenheit von Dextran Natriumsulfat oder DSS induzierte Entzündung. Die Infiltration von Entzündungszellen in die Darmlamina Propria wird auch durch DSS-Behandlung erheblich verbessert.
Die H&E-Färbung von unbehandelten Proben, die durch Automatisierung verarbeitet werden, zeigt weniger infiltrierende Entzündliche Zellen, epitheliale Veränderungen und Veränderungen in der Schleimhautarchitektur im Vergleich zu Proben von DSS-behandelten Tieren. Die Qualität der murinen Gewebevorbereitung und -einbettung durch die automatisierten Instrumente kann zusätzlich durch immunhistochemische Färbung für CD20 und Mallory Trichrome Staining bestätigt werden. Insbesondere die automatisierte Probenverarbeitung ermöglicht durchgängig die Auswertung eines höheren Anteils histologischer Parameter als proben, die nach dem manuellen Verfahren verarbeitet werden.
Achten Sie darauf, das Gewebe korrekt in das Gitter einzufügen, um zu warten, bis der automatisierte Prozessor bereit ist, und darauf zu warten, dass das Paraffin vollständig geschmolzen ist. Diese Methode kann verwendet werden, um histologische Analyse von jedem murinen Gewebe durchzuführen, mit dem Qualitiv der menschlichen histologischen Proben, die in murinen Modellen von menschlichen Pathologen verwendet werden. Diese Technik wurde bereits erfolgreich Studie für die Untersuchung entzündlicher Gewebeentzündungen, und wird nützlich für das Studium Modelle der kolorektalen murinen Krebs.
Da einige Reagenzien, die in diesem Protokoll verwendet werden, gefährlich sind, denken Sie daran, bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Schutzhandschuhe, Schutzbrillen und einen Labormantel zu tragen.
