Diese Arbeit wird durch Zuschüsse aus kanadischen Institutes of Health Research (CIHR) und Morbus Crohn und Colitis Foundation von Kanada (CCFC) unterstützt.

1. Mausmodell der DSS-induzierten akuten Colitis <ol><li> Add Dextransulfat-Natrium (DSS) auf autoklaviert Trinkwasser, um die gewünschte Endkonzentration (1-5%) (wt / vol) (dh zu einer 5% DSS-Lösung zu machen, fügen Sie 25 mg DSS Pulver auf 500 ml Wasser autoklaviert) . Stammlösung kann bei Raumtemperatur stehen gelassen werden für bis zu 1 Woche oder bei 4 ° C bis zur Verwendung. </li><li> In einem Biosicherheit Kapuze, pour Lager DSS-Lösung in 50 mL Falcon-Röhrchen (eine pro Käfig erforderlich). Halten Sie die Stammlösung zu Nachfüllrohr, wenn nötig. </li><li> Ersetzen Sie Trinkwasser in jeder Maus Käfig mit dem DSS-Lösung (in der 50 ml Falcon-Röhrchen) (Die Dauer hängt von der DSS Regime, das verwendet wird ab. Zum Beispiel mit 6-8 Wochen alten männlichen C57BL / 6 Mäusen, wir verwalten 5% DSS-Lösung für insgesamt fünf Tage). Mäuse sollten keinen Zugang zu einer anderen Wasserquelle. Control-Mäuse sind autoklaviert Trinkwasser ohne DSS gegeben. </li><li> Wiegen Mäusen täglich und den Betrag der DSS pro Tag verbraucht. Top jedesFlasche zu 50 ml nach der Aufnahme DSS Ebenen. Dies ist die ungefähre Volumen des DSS pro Käfig pro Maus während der gesamten Dauer des Experiments konsumiert zu messen. In unseren Untersuchungen verwenden wir eine 5% DSS-Lösung für 5 Tage mit männlichen C57BL / 6 Mäusen. Deutlicher Gewichtsverlust, veränderte Stuhlkonsistenz und Anzeichen von Blut im Stuhl sind so früh wie Tag 3 mit diesem speziellen DSS Regime gesehen. Während der DSS Verwaltung, zeigen Mäuse ausgeprägter Gewichtsverlust (ca. 5-10% ihres ursprünglichen Gewichts an Tag 5) mit Gewichtsverlust von mehr als 20% des ursprünglichen Gewichts mit Austrocknung und Durchfall auf die wesentlichen physiologischen Indikator dafür, dass ein Tier an oder ist in der Nähe Endpunkt. Wenn das Tier ist der Zugang zu normalem Wasser nach dem 5 Tage 5% DSS gegeben, wird es innerhalb von 7 Tagen zu erholen. Alle Versuche sollten durch die Institution Tier Ethikkommission genehmigt werden und werden in Übereinstimmung mit dem genehmigten Tier Utilization Protocol (AUP). </li><li> Während der Dauer des Experiments, ein Disease Activity Index (DAI)Gäste können bewertet, um die klinische Progression der Colitis bewerten. Das DAI ist der kombinierte Score von Gewichtsverlust im Vergleich zu ursprünglichen Gewichts, Stuhlkonsistenz und Blutungen. Scores sind wie folgt definiert: Gewichtsverlust: 0 (kein Verlust), 1 (1-5%), 2 (5-10%), 3 (10-20%) und 4 (&gt; 20%); Stuhlkonsistenz: 0 (normal), 2 (lose Stuhl) und 4 (Durchfall) und Blutungen: 0 (kein Blut), 1 (Hemoccult positiv), 2 (Hemoccult positive und visuelle Pellet Blutungen) und 4 (Brutto-Blutungen, Blut um Anus). DAI können täglich während der Dauer der DSS-Behandlung erzielt werden. </li><li> Zum Zeitpunkt der Wahl, zu wiegen und zu opfern Mäusen. Mäuse können durch Genickbruch nach Inhalation von Isofluran oder durch eine andere Methode, mit der Institution Tierhaltung genehmigt eingeschläfert werden. </li></ol> 2. Sammeln colonic Gewebeproben <ol><li> Expose der Bauchseite des Tieres und nassen Bauch-Bereich mit 70% Ethanol-Lösung. An dieser Stelle finden Sie in Tabelle 1 beziehen, und notieren Sie einesny Anzeichen von rektalen Blutungen (Blut vorhanden an der Afteröffnung) oder Rektumprolaps in jedem Tier. </li><li> Verwenden Sie Standard-Präparierscheren auf den Bauch, indem sie einen ventralen Medianschnitt incise. </li><li> Suchen Sie den Doppelpunkt und Transekt den Doppelpunkt als der Darmkrebs-Marge nahe wie möglich am distalen Kolon frei. </li><li> Vorsichtig und langsam herausziehen die ganze Dickdarm, da er vom umgebenden Mesenterium. </li><li> Transect den Doppelpunkt am colonocecal Marge auf das proximale Ende des Dickdarms frei. Kot kann durch Spülen Doppelpunkt mit sterilem PBS mit einem Magensonde Nadel ein 3 oder 5 ml-Spritze oder durch vorsichtiges Quetschen es aus mit einem Paar von gebogenen Pinzette / Zange entfernt werden. Mit den ganzen Dickdarm, für Schäden zu beurteilen (siehe Abschnitt 3.1) </li><li> Gewebeentnahme zur histologischen Untersuchung und andere Tests können durch Schneiden 0,5 cm bis 1,0 cm langen Colon-Fragmente Nennung welchem ​​Bereich wird die Probe aus durchgeführt werden (dh proximalen, mittleren oder distalen). </li><li> Gewebeprobenverwendet für die Tests können einzeln in 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen platziert werden und in flüssigem Stickstoff eingefroren und bis zur Verwendung gelagert bei -70 ° C werden </li></ol> 3. Beurteilung der Schwere Colitis <ol><li> Makroskopische oder Schwere der Erkrankung Score ist unheilbar von einem unvoreingenommenen Beobachter mit einem zuvor veröffentlichten Scoring-System (Tabelle 1) beurteilt. 9 Stuhlkonsistenz kann durch die Verwendung einer Pinzette und Drücken auf dem Stuhl, um die Konsistenz zu bestimmen beurteilt werden. Um zu bestimmen, eine Partitur für Blut im Stuhl, beachten Sie die Farbe des Kots (dh schwarzen Stuhl gegenüber hellbraunen Stuhl) und eine weitere Bestätigung mit einer Hemoccult testen. Mit dem Scoring-System, bestimmen eine Punktzahl für jede der Bedingungen. Die endgültige makroskopische Score für jedes Tier ist die Summe der einzelnen Gastes. </li><li> Zur Beurteilung histologischen Schadens von Colitis Schwere, schneiden Sie ein kleines Fragment (0,5 cm) des Dickdarms, in einem Gewebekassette und tauchen in gepufferter 10% Formalin-Lösung. Bereiten Sie 5um in Paraffin eingebettete Schnitte und Flecken Abschnitte mit Hämatoxylin / eoxin (H &amp; E) mit den entsprechenden Verfahren. Colon-Fragmente aus dem proximalen, mittleren Doppelpunkt oder distalen Abschnitt des Dickdarms genommen werden. </li><li> H &amp; E gefärbten Kolon Abschnitte sind durch eine verblindete Beobachter mit einem zuvor veröffentlichten System für folgende Maßnahmen erzielt: (- schwere Krypta Verzerrung mit dem Verlust der gesamten Krypten, 3 normal, 0), dem Grad der entzündlichen Zellinfiltration (normal, 0 Krypta Architektur - dichten entzündlichen Infiltrat, 3), Muskel-Verdickung (Basis Krypta sitzt auf der muscularis mucosae, 0 - markiert Muskel Verdickung vorhanden ist, 3), Kelch-Zell-Depletion (fehlende, 0 - vorhanden ist, 1) und die Krypta Abszess (abwesend, 0 - Gegenwart , 1). 7 Die histologischen Schadens-Score ist die Summe der einzelnen Gastes. Es ist anzumerken, dass im Gegensatz zu menschlichen UC, Kryptenabszesse nicht charakteristisch für dieses Modell und sind selten zu sehen; mikroskopische Ulzerationen sind ebenfalls selten. Wenn mehrere Doppelpunkt Schnitte wurdengebeizt, histologischen Scores zwischen ähnlichen Abschnitten sollten verwendet werden, um das Endergebnis für den jeweiligen Bereich (dh histologische Ergebnis in proximalen Kolon im Vergleich zu histologischen Score in distalen Kolon) zu bestimmen. </li></ol> 4. Stammlösungen von Reagenzien für die Tests <ol><li> Bereiten Sie eine 50 mM Lösung von Kaliumphosphat-Puffer, indem Lösung B (K 2 HPO 4, 8,7 g zweibasische Kaliumphosphat in 1 l dH 2 O) zu Lösung A (KH 2 PO 4, 6,8 g einbasiges Kaliumphosphat in 1L von dH 2 O) bis zu einem pH von 6,0 erreicht ist. Verbleibende Lösungen können im Kühlschrank (2-8 ° C) bis zum späteren Gebrauch gespeichert werden. </li><li> Bereiten Hexadecyltrimethylammoniumbromid (HTAB) Puffer durch Zugabe von 5 g HTAB in 1 l Kaliumphosphatpuffer (50 mM, pH = 6,0). Gently Hitze sich auflösen und bei 2-8 ° C lagern bis zum Gebrauch. Bei Bedarf Wärme wieder auflösen. </li><li> Bereiten Lysepuffer für Tissue Homogenisierung für Protein-AnalyseZugabe von 10 ml 1 M Tris-Salzsäure (pH = 8,0), 6 ml 5M Natriumchlorid und 2 ml Triton X-100 bis 182 ml sterilisiertem destilliertem Wasser. Triton X-100 ist sehr zähflüssig bei Raumtemperatur und sollte daher vorsichtig erwärmt, vor der Verwendung. Die vorbereiteten Lysepuffer kann bei -20 ° C bis zur Verwendung gelagert werden. </li></ol> 5. Probenvorbereitung für Tests <ol><li> Probenvorbereitung für MPO-Analyse. <ol><li> Nehmen Sie Proben von -70 ° C und auf Eis stellen. Das Gewicht jeder Probe nach dem Entfernen keine sichtbaren Rückstände oder Fett mit einem gebogenen ForceP / Pinzette und in einen 2 ml Eppendorf Safe-Lock Mikrozentrifugenröhrchen (oder Rohr, das mit einem Homogenisator verwendet werden können). Die Proben sollten auf Eis zu allen Zeiten gehalten werden. Es ist wichtig zu beachten, dass ähnliche Doppelpunkt Fragmente aus jeder biologischen replizieren (dh distalen Abschnitte nur oder proximalen Abschnitte nur) verwendet werden. </li><li> Add Homogenisator Wulst zu jedem Probenröhrchen. </li><li> Fügen Sie die entsprechende Menge an HTAB buffer nach Gewebe Gewicht. Wenn Gewebe Gewicht beträgt weniger als 25 mg, fügen Sie den Puffer bei einem Verhältnis von 12.5mg/mL, wenn Gewebe Gewicht liegt zwischen 25-50, bei einem Verhältnis von 25mg/ml hinzuzufügen. Wenn Gewebe Gewicht größer als 50, add-Puffer bei einem Verhältnis von 50mg/ml. </li><li> Homogenisieren mit einem Gewebe-Homogenisator für 4 min bei 30 Hz. Wiederholen Sie, wenn Gewebe nicht vollständig homogenisiert. </li><li> Entfernen Homogenisator Wulst und Zentrifuge für 6 min (13400 xg, 4 ° C). </li><li> Sammeln Überstand und entsorgen Sie die resultierende Pellet. Überstand kann bei -70 ° C bis zur Verwendung gelagert werden. </li></ol></li><li> Probenvorbereitung für die Zytokin-Analyse. <ol><li> Wiederholen Sie die Schritte 5.1.1. auf 5.1.2. </li><li> Dann werden 50 ul von Protease-Inhibitor-Cocktail (PIC) zu 10 mL der vorbereiteten Lysepuffer. </li><li> 1 ml der PIC und Lysepuffer Lösung für jede Probe, unabhängig von Gewicht. </li><li> Homogenisieren für 5 min bei 30 Hz. Wiederholen Sie, wenn Gewebe nicht vollständig homogenisiert. </li><li> Entfernen Homogenisator Wulst und Zentrifuge Löfür 5 min bei 3300 x g. </li><li> Sammeln Überstand und entsorgen Sie die resultierende Pellet. Überstand kann bei -70 ° C bis zur Verwendung gelagert werden. </li></ol></li></ol> 6. Die Quantifizierung der Entzündungsmarker <ol><li> MPO-Aktivitätstest <ol><li> Bereiten o-Dianisidin dihydrochlorid (o-Dianisidin)-Lösung durch die Kombination von 16,7 mg o-Dianisidin Dihydrochlorid, 90 ml dH 2 O und 10 ml Kaliumphosphatpuffer. Diese Lösung sollte bereit für jeden Test frisch angesetzt werden. </li><li> Add 7 ul der Gewebehomogenat (hergestellt in Abschnitt 5.1) in dreifacher Ausfertigung in einer 96-Well-Platte. </li><li> Dann werden 50 ul der verdünnten H 2 O 2 (4 ul von 30% H 2 O 2 in 96 ul dH 2 O verdünnt) auf die o-Dianisidin Mischung. </li><li> Verwenden Sie einen Multi-Kanal-Pipette auf 200 ul des o-Dianisidin Gemisch aus H 2 O 2 für jede der Vertiefungen hinzu. </li><li> Messen Sie die Absorption bei 450 nm mit einem Spektrophotometertometer. Nehmen Sie drei Lesungen in 30 Sekunden Intervallen. </li><li> Berechnen MPO-Aktivität. MPO-Aktivität wird in Einheiten (U) des MPO / mg Gewebe, wobei eine Einheit von MPO als die benötigte Menge an 1 mol H 2 O 2 pro Minute bei Raumtemperatur zersetzen definiert wird gemessen. Man bedenkt, dass eine Einheit (U) der MPO = 1 mol H 2 O 2 gespalten und die 1 umol von H 2 O 2 eine Änderung der Absorption von 1,13 x 10 -2 nm / min liefert, ist Einheiten der MPO in jeder Probe bestimmt als Änderung der Absorption [&amp;Dgr; (t 2-t 1)] / Δmin x (1,13 x 10 -2). Um Einheiten pro mg Gewebe, die Gewebe: Puffer-Verhältnis. Zum Beispiel, wenn ein Gewebe: Puffer-Verhältnis von 50 mg / mL eingesetzt wurde, in 7 ul Homogenat, gibt es 0,35 mg Gewebe. Deshalb, um Einheiten pro mg Gewebe zu bekommen, teilen sich die Einheiten der MPO von 0,35. Ein Rechenbeispiel mit Extinktionswerte (nm) ist unten (unter der Annahme, dass die Probe in dreifacher Ausfertigung hinzugefügt wurde) enthalten: </li></ol></li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Probe </td><td colspan="3"> Zeit 0 Sek. </td><td colspan="3"> 30 sec. </td><td colspan="3"> 60 Sekunden </td></tr><tr><td> A </td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 1 &#39; </td><td> 2 &#39; </td><td> 3 &#39; </td><td> 1 &quot; </td><td> 2&#39;&#39; </td><td> 3 &quot; </td></tr><tr><td></td><td> 0,048 </td><td> 0,048 </td><td> 0,051 </td><td> 0,061 </td><td> 0,061 </td><td> 0,065 </td><td> 0,074 </td><td> 0,073 </td><td> 0,078 </td></tr></tbody></table><ol class="lroman"><li> Durchschnittliche Zeitpunkt 0 sec = (0,048 + 0,048 + 0,051) / 3 = 0,049 nm </li><li> Durchschnittliche bei Time 30 sec = 0.0623 nm </li><li> Durchschnittliche bei Time 60 sec = 0,075 nm </li><li> Änderung der Absorption (&amp;Dgr;) 0 bis 30 Sek. / mg Gewebe (vorausgesetzt, 50 mg / ml Gewebe: Puffer-Verhältnis) = [(0,0623 bis 0,049) / (1,13 x 10 -2)] / 0,35 = 3,363 </li><li> Ändern Sie in absorbierenversicherung (&amp;Dgr;) 30 bis 60 Sek. / mg Gewebe = 3,211 </li><li> * MPO-Aktivität (U / mg Gewebe) = Durchschnitt der &amp;Dgr; (0-30) und &amp;Dgr; (30-60) = 3,287 </li></ol><ol start="2"><li> Die Quantifizierung der pro-inflammatorischen Zytokinen durch ELISA <ol><li> Cytokine (IL-1β, IL-6 und TNF-α) bestimmt werden können mit handelsüblichen enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)-Kit (Quantikine Murine; R &amp; D Systems). </li><li> Extinktionswerte voneinander ELISA ist normiert mit einem Bradford-Protein-Assay jeweiligen jeder Probe und wird in Einheiten von pg / mg Protein ausgedrückt. </li></ol></li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse Die Verwaltung der entsprechenden DSS Regime wird akuter Kolitis in Mäusen zu induzieren. Während der Dauer der DSS-Behandlung kann DAI dient der Beurteilung und Bewertung der klinischen Progression der Krankheit sein. Tiere mit DSS behandelt wird zeigen signifikanten Gewichtsverlust im Vergleich zu ihrer ursprünglichen Gewichte, weicher Stuhl und fäkaleBlutungen (Abbildung 1). Bei Opfer und Untersuchung des Dickdarms ist die Schwere der Colitis makroskopisch basierend auf Verkürzung der Doppelpunkt Länge, Kolon-Blutungen, fäkale Blutungen, Lockerung der Stuhlkonsistenz erzielte, und Anzeichen einer rektalen Blutungen, die Kontrollen nur mit Wasser behandelt wurden, verglichen (Abbildung 2 und Tabelle 1). Querschnitte von Kolon-Gewebeproben mit H &amp; E gefärbten haben höhere histologischen Scores für DSS-behandelte Doppelpunkte im Vergleich zu Wasser-behandelten Kontrollen (Abbildung 3). Zur weiteren Charakterisierung der Ausdehnung der Entzündung in DSS-behandelten Mäusen, können MPO-Aktivität aus homogenisierten colonic Gewebeproben beurteilt werden. DSS-behandelte Doppelpunkte haben höhere MPO-Aktivität im Vergleich zur Kontrollgruppe (Abbildung 4). Darüber hinaus ist dies mit erhöhten Konzentrationen von pro-inflammatorischen Zytokine (IL-1β, IL-6, TNF-α) (Abbildung 5) verbunden ist. <img alt="Abbildung 1." src="/files/ftp_upload/3678/3678fig1.jpg" /><br/&gt; Abbildung 1. Männlich, wurden C57BL / 6 Mäusen 5% DSS im Trinkwasser über 5 Tage. DAI Scores wurden täglich für jedes Tier untersucht und waren pro Tag für jede Gruppe im Durchschnitt (Mittelwert ± SEM, n = 4 Mäuse / Gruppe). <img alt="Abbildung 2." src="/files/ftp_upload/3678/3678fig2.jpg" /> Abbildung 2. C57BL / 6 Mäuse wurden 5% DSS im Trinkwasser über 5 Tage. Kontrollmäuse erhielten Wasser ohne DSS. Makroskopische Schaden des Gastes / der Schwere der Erkrankung Scores wurden blind auf Tag 5 nach der DSS-induzierter Kolitis beurteilt. Doppelpunkte von Mäusen, die DSS erhalten isoliert haben höhere makroskopische Schädigung Scores (rektale Blutungen, Rektumprolaps, Durchfall, Blutungen Kolon), was größer ist die Schwere der Erkrankung (Mittelwert ± SEM, n = 4 Mäuse / Gruppe). <img src="/files/ftp_upload/3678/3678fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. C57BL / 6 Mäuse wurden 5% DSS-Lösung im Trinkwasser gegeben, um Kolitis induzieren. Kontrollmäuse<html> erhielt Wasser ohne DSS. (A) Histologische Scores wurden blind ausgewertet H &amp; E gefärbten Kolon Gewebeschnitten am Tag 5 post-DSS Verwaltung gesammelt. (B) DSS-behandelten Proben zeigen mehr histologischen Schäden (mehr zellulärer Infiltration, mehr Becherzellen Zell-Depletion, größere Verzerrungen / Beschädigung Krypta Architektur) im Vergleich zu (C) Kontrollen (Mittelwert ± SEM, n = 4 Mäuse / Gruppe). In (B) und (C), zeigt Stern (*) Bereich der Kelch Zell-Depletion und Verzerrung der Krypta Architektur; Nummernzeichen (#) gibt zelluläre Infiltration. <img alt="Abbildung 4." src="/files/ftp_upload/3678/3678fig4.jpg" /> Abbildung 4. Alle Mäuse wurden am Tag 5 nach der Verabreichung von DSS und Kolon Gewebeproben geopfert wurden gesammelt, um MPO-Aktivität zu bewerten. Der Schweregrad der DSS-induzierte Colitis ist mit einem höheren MPO-Aktivität im Vergleich zur Kontrollgruppe (Mittelwert ± SEM, n = 4 Mäuse / Gruppe) verbunden sind. _upload/3678/3678fig5.jpg &quot;/&gt; Abbildung 5. Neben höheren MPO Ebenen, die Schwere der DSS-induzierte Colitis ist ebenso mit einem erhöhten Maß an pro-Entzündung Zytokine wie IL-1β, IL-6, TNF-α (Mittelwert ± SEM, n = 4 Mäusen assoziiert / Gruppe). <table border="1"><tbody><tr><td> Partitur </td><td> Rektale Blutungen </td><td> Rektumprolaps </td><td> Stuhlkonsistenz </td><td> Blut </td></tr><tr><td> 0 </td><td> Keiner </td><td> Keiner </td><td> Normal </td><td> Normal </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Rot </td><td> Signs of Prolaps </td><td> Weich </td><td> Rot </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Dark Red </td><td> Klare Prolaps </td><td> Sehr weich </td><td> Dunkelrot </td></tr><tr><td> 3 </td><td> Gross Blutungen </td><td> Umfangreiche Prolaps </td><td> Durchfall </td><td> Schwarz </td></tr></tbody></tLage&gt; Tabelle 1. Makroskopische / Disease Severity Score

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

DSS Kolitis ist eine weit verbreitete chemisch induzierten Modell der Darmentzündung. In diesem Modell Mäuse sind Trinkwasser mit DSS, die dachten, dass sie giftig ist, Epithelzellen Darm und stören die Integrität der mukosalen Barriere ergänzt gegeben. 10 Administration von DSS induziert eine akute Kolitis, die von weichem Stuhl, Kot Blutungen gekennzeichnet ist, und Infiltration mit Granulozyten. 10 Während DSS Verwaltung ist ulcerosa in der Regel mit erheblichen Gewichtsverlust und Anwesen...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz / Ausstattung: </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Eppendorf Safe-Lock Mikrozentrifugenröhrchen (2 mL) </td><td> eppendorf </td><td> 0030 120.094 </td><td></td></tr><tr><td> Biotek EL808 Absorption Plattenlesegerät </td><td> Biotek </td><td> EL808 </td><td></td></tr><tr><td> Dextransulfat Natriumsalz analysenreines (Molekulargewicht 36,000-50,000 Da) </td><td> MP Biomedicals </td><td> 160110 </td><td></td></tr><tr><td> Gen5 (Software) </td><td> Biotek </td><td> Version 1.10.8 </td><td></td></tr><tr><td> Hexadecyltrimethylammoniumbromid (HTAB) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H5882-100G </td><td></td></tr><tr><td> Wasserstoffperoxid, 30 Gew..% Ige Lösung in Wasser </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 216763 </td><td> Lagerung bei 2-8 ° C </td></tr><tr><td> Microtest plaß 96-well Flachboden </td><td> Sarstedt </td><td> 82,1581 </td><td> Nur zum einmaligen Gebrauch </td></tr><tr><td> o-Dianisidin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D-3252 </td><td> Lichtempfindlich. Lagerung bei 2-8 ° C </td></tr><tr><td> Kaliumphosphat, zweibasische </td><td> Caledon </td><td> 6620-1 </td><td></td></tr><tr><td> Kaliumphosphat, einbasischen </td><td> EMD Chemicals </td><td> PX1565-1 </td><td></td></tr><tr><td> Protease-Inhibitor-Cocktail </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P8340 </td><td> Lagerung bei -20 ° C </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T8787 </td><td></td></tr><tr><td> Hartmetall-Kugeln für Tissue Lyser II </td><td> QUIAGEN </td><td> 69997 </td><td></td></tr></tbody></table>

investigating intestinal inflammation in dss-induced model of ibd

Entzündliche Darmerkrankungen (IBD) umfasst eine Reihe von Darm-Erkrankungen, die häufigste die Colitis ulcerosa (UC) und Morbus Crohn (CD) sind. Beide UC und CD, wenn sie in den Dickdarm, erzeugen ein ähnliches Symptom Profil, Durchfall, rektale Blutungen, Bauchschmerzen und Gewichtsverlust umfassen kann. 1 Obwohl die Pathogenese der CED ist nicht bekannt, wird es als eine multifaktorielle Erkrankung, die sowohl beinhaltet beschrieben genetische und umweltbedingte Komponenten. 2 Es gibt zahlreiche und variable Tiermodellen der Kolon-Entzündung, die mehrere Funktionen von IBD ähneln. Tiermodelle der Kolitis reichen von denjenigen, die sich spontan in empfindliche Stämme bestimmter Arten auf diese erfordern Gabe von bestimmten Konzentrationen von Colitis-induzierende Chemikalien wie Natrium-Dextransulfat (DSS). Chemisch-induzierte Modelle Darmentzündungen sind die am häufigsten verwendete und am besten beschriebenen Modelle der IBD. AdminiStration der DSS im Trinkwasser produziert akute oder chronische Kolitis in Abhängigkeit von der Verwaltung Protokoll. 3 Tiere gegeben DSS zeigen Gewichtsverlust und Zeichen von weichem Stuhl oder Durchfall, manchmal mit Anzeichen von rektale Blutungen. 4,5 Hier beschreiben wir die Methoden, mit denen Colitis Entwicklung und die daraus resultierenden entzündlichen Reaktion kann nach der Verabreichung von DSS charakterisiert werden. Zu diesen Methoden zählen die histologische Analyse der Hämatoxylin / Eosin gefärbt Doppelpunkt Abschnitte, die Messung des pro-inflammatorischen Zytokinen, und die Bestimmung von Myeloperoxidase (MPO)-Aktivität, die als Surrogat-Marker für Entzündungen verwendet werden kann. 6 Das Ausmaß der entzündlichen Reaktion in Krankheit Zustand kann durch das Vorhandensein von klinischen Symptomen oder durch Veränderung in der Histologie in Schleimhautgewebe bewertet werden. Colonic histologischen Schadens wird durch die Verwendung eines Scoring-System, dass der Verlust der Krypta Architektur-, Entzündungs-Zell-Infiltration, Muskel-t hält bewertethickening, Pokal-Zell-Depletion, und die Krypta Abszess. 7 Quantitativ lässt Ebenen des pro-inflammatorischen Zytokinen mit akuten entzündlichen Eigenschaften, wie z. B. Interleukin (IL)-1β, IL-6 und Tumor Nekrose Faktor (TNF)-α, ermittelt werden konventionellen ELISA-Verfahren. Darüber hinaus kann der MPO-Aktivität gemessen mit einem kolorimetrischen Assay werden und als ein Index der Entzündung. 8 In experimenteller Colitis, ist die Schwere der Erkrankung oft mit einem Anstieg der MPO-Aktivität und ein höheres Niveau von pro-inflammatorischen Zytokine korreliert. Colitis Schwere und Entzündungen-assoziierten Schäden können durch die Untersuchung Stuhlkonsistenz und Blutungen, die neben der Beurteilung der histopathologischen Zustand des Darms mit Hämatoxylin / Eosin gefärbt Kolon Abschnitte beurteilt werden. Kolon-Fragmente können verwendet werden, um MPO-Aktivität und Zytokin-Produktion zu bestimmen. Zusammengenommen können diese Maßnahmen verwendet werden, um die intestinale Entzündungsreaktion in auszuwertenTiermodellen der experimentellen Kolitis.

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Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced Model of IBD

Experimentelle Modelle von chronisch entzündlichen Darmerkrankungen haben uns erlaubt, die komplexen angeborenen und adaptiven Immunantwort mit Pathogenese assoziiert zu untersuchen. Mit histologische Scoring, Quantifizierung von pro-inflammatorischen Zytokinen und Myeloperoxidase-Aktivität, kann man anfangen, diese Reaktionen in chronisch entzündlichen Darmerkrankungen gesehen zu beurteilen.

Untersuchung Darmentzündungen in DSS-induzierten Modell der IBD

Inflammatory bowel disease (IBD) encompasses a range of intestinal pathologies, the most common of which are ulcerative colitis (UC) and Crohn's Disease ...

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Research

JoVE Journal

Biology

66.7K Aufrufe.  McMaster University. Experimentelle Modelle von chronisch entzündlichen Darmerkrankungen haben uns erlaubt, die komplexen angeborenen und adaptiven Immunantwort mit Pathogenese assoziiert zu untersuchen. Mit histologische Scoring, Quantifizierung von pro-inflammatorischen Zytokinen und Myeloperoxidase-Aktivität, kann man anfangen, diese Reaktionen in chronisch entzündlichen Darmerkrankungen gesehen zu beurteilen.

Serie: Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced Model of IBD

Catheterization of Intestinal Loops in Ruminants

The intestine is a complex structure that is involved not only in absorption of nutrients, but also acts as a barrier between the individual and the outside world. As such, the intestine plays a pivotal role in immunosurveillance and protection from enteric pathogens. Investigating intestinal physiology and immunology commonly employs 'intestinal loops' as an experimental model. The majority of these loop models are non-recovery surgical procedures that study short-term (&lt;24 hr) changes in the intestine (1-3). We previously created a recovery intestinal loop model to specifically measure long-term (&lt;6 mo) immunological changes in the intestine of sheep following exposure to vaccines, adjuvants, and viruses (4). This procedure localized treatments to a specific 'loop', allowing us to sample this area of the intestine. A significant drawback of this method is the single window of opportunity to administer treatments (i.e. at the time of surgery). Furthermore, samples of both the intestinal mucosa and luminal contents can only be taken at the termination of the project. Other salient limitations of the above model are that the surgical manipulation and requisite post-operative measures (e.g. administration of antibiotics and analgesics) can directly affect the treatment itself and/or alter immune function, thereby confounding results. Therefore, we modified our intestinal loop model by inserting long-term catheters into the loops. Sheep recover fully from the procedure, and are unaffected by the exteriorized catheters. Notably, the establishment of catheters in loops allows us to introduce multiple treatments over an extended interval, following recovery from surgery and clearance of drugs administered during surgery and the post-operative period.

We describe a novel surgical method for catheterizing 'intestinal loops' within the ileum of sheep. Once animals have recovered from surgery and have cleared antibiotics and analgesics, multiple treatments can be deposited directly in loops via the catheters.

Katheterisierung der Darmschlingen bei Wiederkäuern

The intestine is a complex structure that is involved not only in absorption of nutrients, but also acts as a barrier between the individual and the ...

Forschung

Biologie

Rat Mesentery Exteriorization: A Model for Investigating the Cellular Dynamics Involved in Angiogenesis

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease conditions1, 2. Network growth is commonly attributed to angiogenesis, defined as the growth of new vessels from pre-existing vessels. The angiogenic process is also directly linked to arteriogenesis, defined as the capillary acquisition of a perivascular cell coating and vessel enlargement. Needless to say, angiogenesis is complex and involves multiple players at the cellular and molecular level3. Understanding how a microvascular network grows requires identifying the spatial and temporal dynamics along the hierarchy of a network over the time course of angiogenesis. This information is critical for the development of therapies aimed at manipulating vessel growth.
The exteriorization model described in this article represents a simple, reproducible model for stimulating angiogenesis in the rat mesentery. It was adapted from wound-healing models in the rat mesentery4-7, and is an alternative to stimulate angiogenesis in the mesentery via i.p. injections of pro-angiogenic agents8, 9. The exteriorization model is attractive because it requires minimal surgical intervention and produces dramatic, reproducible increases in capillary sprouts, vascular area and vascular density over a relatively short time course in a tissue that allows for the two-dimensional visualization of entire microvascular networks down to single cell level. The stimulated growth reflects natural angiogenic responses in a physiological environment without interference of foreign angiogenic molecules. Using immunohistochemical labeling methods, this model has been proven extremely useful in identifying novel cellular events involved in angiogenesis. Investigators can readily correlate the angiogenic metrics during the time course of remodeling with time specific dynamics, such as cellular phenotypic changes or cellular interactions4, 5, 7, 10, 11.

This article describes a simple model for stimulating angiogenesis in the rat mesentery. The model produces dramatic increases in capillary sprouting, vascular area and vascular density over a relatively short time course in a tissue that allows en face visualization of entire microvascular networks down to the single cell level.

Rattengekröse Exteriorisation: Ein Modell für die Untersuchung der Zelluläre Dynamik an der Angiogenese beteiligt

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease ...

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth factors. Since organoids are highly similar to the original tissue in terms of homeostatic stem cell differentiation, cell polarity and presence of all terminally differentiated cell types known to the adult intestinal epithelium, they serve as an essential resource in experimental research on the epithelium. The possibility to express transgenes or interfering RNA using lentiviral or retroviral vectors in organoids has increased opportunities for functional analysis of the intestinal epithelium and intestinal stem cells, surpassing traditional mouse transgenics in speed and cost. In the current video protocol we show how to utilize transduction of small intestinal organoids with lentiviral vectors illustrated by use of doxycylin inducible transgenes, or IPTG inducible short hairpin RNA for overexpression or gene knockdown. Furthermore, considering organoid culture yields minute cell counts that may even be reduced by experimental treatment, we explain how to process organoids for downstream analysis aimed at quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry. Techniques that enable transgene expression and gene knock down in intestinal organoids contribute to the research potential that these intestinal epithelial structures hold, establishing organoid culture as a new standard in cell culture.

In this video protocol we give a step by step explanation of lentiviral transduction in organoids of primary intestinal epithelium and of processing and downstream analysis of these cultures by quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry.

Ein Protokoll für Lentivirale Transduktion und Downstream-Analyse der Darm Organoide

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

A Mouse Model of Intestinal Partial Obstruction

Intestinal obstructions, that impede or block peristaltic movement, can be caused by abdominal adhesions and most gastrointestinal (GI) diseases including tumorous growths. However, the cellular remodeling mechanisms involved in, and caused by, intestinal obstructions are poorly understood. Several animal models of intestinal obstructions have been developed, but the mouse model is the most cost/time effective. The mouse model uses the surgical implantation of an intestinal partial obstruction (PO) that has a high mortality rate if it is not performed correctly. In addition, mice receiving PO surgery fail to develop hypertrophy if an appropriate blockade is not used or not properly placed. Here, we describe a detailed protocol for PO surgery which produces reliable and reproducible intestinal obstructions with a very low mortality rate. This protocol utilizes a surgically placed silicone ring that surrounds the ileum which partially blocks digestive movement in the small intestine. The partial blockage makes the intestine become dilated due to the halt of digestive movement. The dilation of the intestine induces smooth muscle hypertrophy on the oral side of the ring that progressively develops over 2 weeks until it causes death. The surgical PO mouse model offers an in vivo model of hypertrophic intestinal tissue useful for studying pathological changes of intestinal cells including smooth muscle cells (SMC), interstitial cells of Cajal (ICC), PDGFR&#945;+, and neuronal cells during the development of intestinal obstruction.

Intestinal obstructions are a partial or complete blockage of the intestine that can cause severe abdominal pain, nausea, vomiting, and preventing the passage of stool. This procedure for creating intestinal partial obsructions in mice is reliable in studying the mechanisms underlying pathological cell growth and death in the intestine.

Ein Maus-Modell der teilweisen Darmverschluss

Intestinal obstructions, that impede or block peristaltic movement, can be caused by abdominal adhesions and most gastrointestinal (GI) diseases including ...

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A)

Studying the structure and the dynamics of kinetochores and centromeres is important in understanding chromosomal instability (CIN) and cancer progression. How the chromosomal location and function of a centromere (i.e., centromere identity) are determined and participate in accurate chromosome segregation is a fundamental question. CENP-A is proposed to be the non-DNA indicator (epigenetic mark) of centromere identity, and CENP-A ubiquitylation is required for CENP-A deposition at the centromere, inherited through dimerization between cell division, and indispensable to cell viability.
Here we describe mass spectrometry analysis to identify ubiquitylation of EYFP-CENP-A K124R mutant suggesting that ubiquitylation at a different lysine is induced because of the EYFP tagging in the CENP-A K124R mutant protein. Lysine 306 (K306) ubiquitylation in EYFP-CENP-A K124R was successfully identified, which corresponds to lysine 56 (K56) in CENP-A through mass spectrometry analysis. A caveat is discussed in the use of GFP/EYFP or the tagging of high molecular weight protein as a tool to analyze the function of a protein. Current technical limit is also discussed for the detection of ubiquitylated bands, identification of site-specific ubiquitylation(s), and visualization of ubiquitylation in living cells or a specific single cell during the whole cell cycle.
The method of mass spectrometry analysis presented here can be applied to human CENP-A protein with different tags and other centromere-kinetochore proteins. These combinatory methods consisting of several assays/analyses could be recommended for researchers who are interested in identifying functional roles of ubiquitylation.

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A EYFP-CENP-A

CENP-A ubiquitylation is an important requirement for CENP-A deposition at the centromere, inherited through dimerization between cell division, and indispensable to cell viability. Here we describe mass spectrometry analysis to identify ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A) protein.

Massenspektrometrieanalyse zur Identifizierung der Ubiquitylierung von EIFP-A mit EYFP-Tags (EYFP-CENP-A)

Studying the structure and the dynamics of kinetochores and centromeres is important in understanding chromosomal instability (CIN) and cancer ...

Organoid-Derived Epithelial Monolayer: A Clinically Relevant In Vitro Model for Intestinal Barrier Function

In the past, intestinal epithelial model systems were limited to transformed cell lines and primary tissue. These model systems have inherent limitations as the former do not faithfully represent original tissue physiology, and the availability of the latter is limited. Hence, their application hampers fundamental and drug development research. Adult stem-cell-based organoids (henceforth referred to as organoids) are miniatures of normal or diseased epithelial tissue from which they are derived. They can be established very efficiently from different gastrointestinal (GI) tract regions, have long-term expandability, and simulate tissue- and patient-specific responses to treatments in vitro. Here, the establishment of intestinal organoid-derived epithelial monolayers has been demonstrated along with methods to measure epithelial barrier integrity, permeability and transport,&#160;antimicrobial protein secretion, as well as histology. Moreover, intestinal organoid-derived monolayers can be enriched with proliferating stem and transit-amplifying cells as well as with key differentiated epithelial cells. Therefore, they represent a model system that can be tailored to study the effects of compounds on target cells and their mode of action. Although organoid cultures are technically more demanding than cell lines, once established, they can reduce failures in the later stages of drug development as they truly represent in vivo epithelium complexity and interpatient heterogeneity.

Here, we describe the preparation of human organoid-derived intestinal epithelial monolayers for studying intestinal barrier function, permeability, and transport. As organoids represent original epithelial tissue response to external stimuli, these models combine the advantages of expandability of cell lines and the relevance and complexity of primary tissue.

Organoid-abgeleitete Epithel-Monolayer: Ein klinisch relevantes In-vitro-Modell für die Darmbarrierefunktion

In the past, intestinal epithelial model systems were limited to transformed cell lines and primary tissue. These model systems have inherent limitations ...

Intestinal Epithelial Regeneration in Response to Ionizing Irradiation

The intestinal epithelium consists of a single layer of cells yet contains multiple types of terminally differentiated cells, which are generated by the active proliferation of intestinal stem cells located at the bottom of intestinal crypts. However, during events of acute intestinal injury, these active intestinal stem cells undergo cell death. Gamma irradiation is a widely used colorectal cancer treatment, which, while therapeutically efficacious, has the side effect of depleting the active stem cell pool. Indeed, patients frequently experience gastrointestinal radiation syndrome while undergoing radiotherapy, in part due to active stem cell depletion. The loss of active intestinal stem cells in intestinal crypts activates a pool of typically quiescent reserve intestinal stem cells and induces dedifferentiation of secretory and enterocyte precursor cells. If not for these cells, the intestinal epithelium would lack the ability to recover from radiotherapy and other such major tissue insults. New advances in lineage-tracing technologies allow tracking of the activation, differentiation, and migration of cells during regeneration and have been successfully employed for studying this in the gut. This study aims to depict a method for the analysis of cells within the mouse intestinal epithelium following radiation injury.

The gastrointestinal tract is one of the most sensitive organs to injury upon radiotherapeutic cancer treatments. It is simultaneously an organ system with one of the highest regenerative capacities following such insults. The presented protocol describes an efficient method to study the regenerative capacity of the intestinal epithelium.

Regeneration des Darmepithels als Reaktion auf ionisierende Bestrahlung

The intestinal epithelium consists of a single layer of cells yet contains multiple types of terminally differentiated cells, which are generated by the ...

Epithelale Auswirkungen von Darmentzündungen auf etablierte murine Kolonoide

Studying the Epithelial Effects of Intestinal Inflammation In Vitro on Established Murine Colonoids

The intestinal epithelium plays an essential role in human health, providing a barrier between the host and the external environment. This highly dynamic cell layer provides the first line of defense between microbial and immune populations and helps to modulate the intestinal immune response. Disruption of the epithelial barrier is a hallmark of inflammatory bowel disease (IBD) and is of interest for therapeutic targeting. The 3-dimensional colonoid culture system is an extremely useful in vitro model for studying intestinal stem cell dynamics and epithelial cell physiology in IBD pathogenesis. Ideally, establishing colonoids from the inflamed epithelial tissue of animals would be most beneficial in assessing the genetic and molecular influences on disease. However, we have shown that in vivo epithelial changes are not necessarily retained in colonoids established from mice with acute inflammation. To address this limitation, we have developed a protocol to treat colonoids with a cocktail of inflammatory mediators that are typically elevated during IBD. While this system can be applied ubiquitously to various culture conditions, this protocol emphasizes treatment on both differentiated colonoids and 2-dimensional monolayers derived from established colonoids. In a traditional culture setting, colonoids are enriched with intestinal stem cells, providing an ideal environment to study the stem cell niche. However, this system does not allow for an analysis of the features of intestinal physiology, such as barrier function. Further, traditional colonoids do not offer the opportunity to study the cellular response of terminally differentiated epithelial cells to proinflammatory stimuli. The methods presented here provide an alternative experimental framework to address these limitations. The 2-dimensional monolayer culture system also offers an opportunity for therapeutic drug screening ex vivo. This polarized layer of cells can be treated with inflammatory mediators on the basal side of the cell and concomitantly with putative therapeutics apically to determine their utility in IBD treatment.

Autor im Rampenlicht: Untersuchung der epithelialen Auswirkungen von Darmentzündungen in vitro auf etablierte murine Kolonoide  

We describe a protocol detailing the isolation of murine colonic crypts for the development of 3-dimensional colonoids. The established colonoids can then be terminally differentiated to reflect the cellular composition of the host epithelium prior to receiving an inflammatory challenge or being directed to establish an epithelial monolayer.

Untersuchung der epithelialen Effekte von intestinalen Entzündungen in vitro auf etablierte murine Kolonoide

The intestinal epithelium plays an essential role in human health, providing a barrier between the host and the external environment. This highly dynamic ...