Kieferorthopädische Zahnbewegung ist ein komplexer biologischer Prozess, der äußere Kräfte und den Umbau von Weich- und Hartgewebe beinhaltet. Um diese Prozesse zu verstehen, ist es wichtig, den Zahn und das Parodontalgewebe im 3D-Kontext zu untersuchen. Das Murinmodell ist aufgrund seiner Größe, der hohen Stoffwechselrate und der riesigen genetischen Information, die wir haben, ein guter Kandidat für solche Studien.
Die Herstellung kieferorthopädischer Zahnbewegungen bei Mäusen ist jedoch aufgrund ihrer geringen Größe nicht einfach. Darüber hinaus beinhalten Strukturanalysemethoden in der Regel Schnitte, die die 3D-Struktur und den Kontext des Gewebes stören. Für ein ungleichmäßiges Gewebe wie die PDL ist die Erhaltung der 3D-Struktur und des Kontexts von entscheidender Bedeutung.
Um diese beiden Hindernisse zu beseitigen, stellen wir ein Protokoll zur Verfügung, um die mesiale kieferorthopädische Zahnbewegung des ersten Unterkiefermolaren bei Mäusen zu erzeugen und zwei Methoden zu beschreiben, die eine 3D-Visualisierung des Parodontalbandes ermöglichen, ohne das Gewebe zu durchtrappen. Um die betäubte Maus für das Einsetzen des kieferorthopädischen Geräts zu positionieren, haken Sie den oberen Schneidezahn an die Büroklammerschlaufe an. Immobilisieren Sie die unteren Schneidezähne mit der Stromkette Und öffnen Sie den Mund weiter mit Mini-Colibri-Mausretraktor.
Tragen Sie einen kleinen Tropfen Kochsalzlösung auf jedes Auge auf, um eine Hornhautaustrocknung zu verhindern. Dies sind die Werkzeuge, die beim Einsetzen von Geräten verwendet werden. Schneiden Sie ein Stück Aluminiumdraht auf einen Zentimeter Länge.
Schieben Sie den Draht mit einem mikrochirurgischen Nadelhalter von der Wangenseite lingual in den interproximalen Bereich unterhalb des Kontaktpunkts zwischen dem ersten und zweiten Backenzähn. Ziehen Sie den Draht von der lingualen Seite zur mesialen Seite des Backenzahns. Drehen Sie die freien Enden des Drahtes zwei- bis dreimal, um sie zu sichern.
Schneiden Sie ein Stück Nickeltitan oder NiTi-Schraubenfeder in einer Länge von sieben bis neun Gewinden. Setzen Sie die Spule zwischen dem unteren ersten Backenzahn und dem Schneidezahn ein, führen Sie ein freies Ende des Drahtes durch zwei Gewinde der Spule und drehen Sie dann beide Enden des Drahtes fest, um die Spule am Backenzahn zu befestigen. Entfernen Sie die Stromkette mit einer Pinzette.
Schlingen Sie zwei bis drei Gewinde der Spule über den Schneidekreis, um die Spule zu verankern. Lassen Sie genau drei aktive Fäden zwischen dem ersten Backenzahn und dem Schneidezahn. Schieben Sie die Bedrohungen bis zum schneidebogenfreien Zahnfleischrand.
Legen Sie eine Schicht aus fließfähigem Kompositharz auf den Schneiderand der Spule und härten Sie sie mit Zahnhärtelicht aus. Ersetzen Sie die Stromkette nach dem Aushärten des Harzes. Trimmen Sie überschüssigen Draht um den Backenzahn, um Verletzungen zu vermeiden.
Erhitzen Sie die NiTi-Spule mit demselben Aushärtungslicht für 20 Sekunden. Dadurch wird die Spule festgezogen, die fertige Platzierung sollte so aussehen. Weichgewebe am sezierten Hemi-Unterkiefer kann mit einem fusselfreien Tuch entfernt werden.
Reiben Sie mit einer Probe zwischen zwei Fingern die Außenseite in kreisenden Bewegungen, bis der größte Teil des Weichgewebes entfernt ist. Der Rest kann mit einer Schere abgeschnitten werden. Gereinigter Unterkiefer ist hier rechts dargestellt.
Um den sezierten Hemi-Unterkiefer aus dem Mikro-CT-Scan in der Probenkammer zu montieren, formen Sie ein reiskorngroßes packbares Dentalharz zu einem Stamm. Legen Sie es dann in den Sample-Slot der Bühne. Legen Sie den Hemi-Unterkiefer auf den Verbund.
Stellen Sie die Position ein, bis der erste Backenzahn an der Mittellinienrille zentriert ist und die Okklusionsfläche horizontal ist. Härten Sie den Verbundwerkstoff aus, wenn Er mit der Positionierung zufrieden ist. Dies ist ein Beispiel für den Unterkiefer in der richtigen Position.
Nehmen Sie eine kleine Kugel packbares Zahnharz. Sein Durchmesser sollte etwa die Breite des Backenzahns liegen. Legen Sie das Harz auf die Okklusionsoberfläche des ersten Backenzahns.
Fusselfreies Wischen mit Wasser befeuchten. Legen Sie das gedämpfte Tuch in die Feuchtigkeitspools in der Probenstufe. Schließen Sie die Probenkammer und befestigen Sie sie mit Schrauben am Mikro-CT.
Nehmen Sie nun 2D-Bilder auf, während Sie den Amboss vertikal absenken, bis die Spitze des Ambosses vom Komposit umgeben ist. Schalten Sie die Röntgenquelle sicher aus, öffnen Sie die Mikro-CT-Kammer und härten Sie das Komposit durch das klare Plexiglasfenster aus. Jetzt ist die Probe ordnungsgemäß montiert und kann bei Bedarf abgebildet werden.
Um optisch gereinigte Hemi-Unterkiefer-Probe zu erzeugen, bereiten Sie die folgenden Lösungen in 1,5 mil Zentrifugenröhrchen vor. 4% Paraformaldehyd, 50% und 70% Ethanol in entionisiertem Wasser. Zwei Röhrchen aus 100% Ethanol und Ethylzimt.
Sezierte Hemi-Unterkiefer in 4% Paraformaldehyd geben. Decken Sie das Rohr mit Aluminiumfolie ab und legen Sie es sechs Stunden lang bei Raumtemperatur auf eine Wippe. Nach sechs Stunden die Probe in 50% Ethanol überführen.
Legen Sie die Probe für 16 Stunden wieder auf die Wippe, die von Licht bedeckt ist. Wiederholen Sie den vorherigen Schritt mit einer Probe in 70% Ethanol für 16 Stunden, gefolgt von 100% Ethanol zweimal für jeweils 16 Stunden. Schließlich die Probe für mindestens 12 Stunden auf Ethylzimt bringen.
Zuverlässige kieferorthopädische Bewegung wird durch das NiTi-Spulengerät im murinen Unterkiefer-ersten Backenzahn erzeugt. Bei neun Wochen alten männlichen Mäusen beträgt der durchschnittliche interproximale Raum nach sieben Tagen 40 Mikrometer. Phasenverstärkungs-Mikro-CT ermöglicht die Visualisierung der PDL.
Nach drei Tagen kieferorthopädischer Bewegung ist die PDL-Dichte reduziert. Die Knochen-PDL-Grenzfläche ist aufgrund der Entwicklung von Kratern in der Knochenoberfläche, die auf osteoklastische Aktivität und Knochenresorption hinweisen, rauer. Raue Oberfläche ist auf allen Ebenen der Wurzeln zu sehen.
Dies zeigt, dass die Bewegung translational ist und nicht eine Kippbewegung. Am siebten Tag ist der PDL-Raum schmaler als am dritten Tag und der Knochen-PDL-Rand an der distalen Wurzeloberfläche ist glatter, was Anzeichen einer Knochenresposition sind, wie erwartet, wenn kieferorthopädische Zahnbewegungen auftreten. Aufgrund der langen Mikro-CT-Bildgebungszeit und der Rotation der Stufe ist eine sichere Montage der Probe unerlässlich.
Instabile Probe, bei der verschwommene Scans entstehen, bei denen eine Silhouette um die Krone herum zu sehen ist und die PDL-Fasern nicht zu sehen sind. Die optische Reinigung mit Ethylzimt bietet eine weitere Methode, um die PDL ohne Schnitte anzuzeigen. Das Substrat ist durch den Ramus einer ausreichend gereinigten Probe zu sehen, die hier rechts gezeigt wird.
Diese Methode bewahrt die endogene Fluoreszenz und kann ohne chemische Fixierung verwendet werden. Die Lightsheet-Mikroskopie kann an gereinigten Proben verwendet werden. Bei einer transgenen Maus können die fluoreszierenden Blutgefäßauskleidungen beobachtet werden.
Wenn der Knochen nicht richtig gereinigt wurde, sind Blutgefäße in der PDL nicht sichtbar, wie in Panel F gezeigt.Dieses Protokoll beschreibt, wie zwei große Herausforderungen bei der Erzeugung und Analyse kieferorthopädischer Zahnbewegungen in murinen Unterkiefermolarenzähnen überwunden werden können. Sobald die kieferorthopädische Zahnbewegungstechnik beherrscht ist, kann sie in 15 Minuten abgeschlossen werden. Dieser Prozess ist aufgrund der geringen Abmessungen der Mauszähne und der Anwesenheit der Zunge eine Herausforderung.
Wir bieten jedoch alle notwendigen Lösungen, um diese Herausforderungen zu meistern. Die Mikro-CT-Bildgebung erfordert eine Phasenverstärkungsfähigkeit. Wir demonstrierten unsere Technik mit einem Mikro-CT auf dem Tisch. Jedes Setup, das eine Phasenverstärkung erzeugen kann, führt jedoch beispielsweise ein Synchrotron durch.
Die ECi-Clearing-Ergebnisse hängen vom Dehydratisierungsprozess ab. Wenn die Probe nicht transparent genug ist, ist unser Vorschlag, die Zeit der Dehydratisierungsschritte zu erhöhen. Unsere Clearing-Methode kann auch bei nicht fixierten Proben angewendet werden.
Die klaren Gewebe können im Mikro-CT gescannt werden, da der Clearing-Prozess den Mineralstoffgehalt des Gewebes nicht beeinflusst. Daher bietet unsere Methode einen korrelativen Ansatz für Fluoreszenz- und Strukturinformationen, um eine vollständige 3D-Analyse zu erstellen.
