정형 난치 운동은 외부 힘과 연동 조직과 하드 조직의 리모델링을 포함하는 복잡한 생물학적 과정입니다. 이러한 프로세스를 이해하기 위해서는 3D 컨텍스트 내에서 치아및 치주 조직을 연구하는 것이 중요합니다. Murine 모델은 크기, 높은 신진 대사 속도 및 우리가 가지고있는 광대 한 유전 정보로 인해 이러한 연구를위한 좋은 후보입니다.
그러나, 마우스에서 치열 교정 치아 운동을 만드는 것은 그들의 작은 크기 때문에 쉽지 않다. 추가적으로, 구조 분석 방법은 일반적으로 조직의 3D 구조 및 맥락을 방해하는 단면을 관련시킵니다. PDL과 같은 균일하지 않은 조직의 경우 3D 구조와 컨텍스트를 유지하는 것이 매우 중요합니다.
이 두 장애물을 해결하기 위해, 우리는 마우스에서 첫 번째 하골 형 어금니의 메소알 치열 교정 치아 운동을 생성하고 조직을 단면화하지 않고 치주 인대의 3D 시각화를 가능하게하는 두 가지 방법을 설명하는 프로토콜을 제공합니다. 교정 장치 삽입을 위해 마취 된 마우스를 배치하려면 상단 절개를 종이 클립 루프에 연결합니다. 전원 체인을 사용하여 하부 절개를 고정하고 미니 대장균 마우스 리트랙터로 입을 더 엽니다.
각막 탈수를 방지하기 위해 각 눈에 작은 식염수를 적용합니다. 이들은 장치 삽입에 사용되는 도구입니다. 알루미늄 와이어 조각을 길이1센티미터로 자른다.
미세 수술 바늘 홀더를 사용하여, 첫 번째와 두 번째 어금니 사이의 접점 아래의 상호 영역에서 구형 측에서 와이어를 슬링합니다. 언어 측에서 어금니의 매혹적인 쪽으로 와이어를 당깁니다. 와이어의 자유 끝을 2~3회 비틀어 고정합니다.
니켈 티타늄 또는 NiTi 코일 스프링의 조각을 길이7~9개의 스레드를 잘라냅니다. 하부 첫 번째 어어와 절개 사이에 코일을 삽입하고 코일의 두 스레드를 통해 와이어의 자유 끝을 통과한 다음 와이어의 양쪽 끝을 단단히 비틀어 코일을 어금니로 고정시합니다. 핀셋 한 쌍을 사용하여 전원 체인을 제거합니다.
코일을 절개하기 위해 코일의 2~3개의 스레드를 절개시 위에 반복합니다. 첫 번째 어금니와 절개 사이에 정확히 세 개의 활성 스레드를 둡니다. 위협을 절개 없는 치지발 마진으로 밀어 내십시오.
코일의 절개 테두리에 흐르는 복합 수지층을 놓고 치과 경화 빛으로 치료하십시오. 수지를 경화한 후 전원 체인을 교체합니다. 부상을 피하기 위해 어금니 와이어 주위에 과도한 와이어를 다듬습니다.
동일한 경화 광을 사용하여 NiTi 코일을 20초 동안 가열합니다. 이것은 코일을 조여, 완성 된 배치는 다음과 같아야합니다. 해부 된 헤미 하악의 연약한 조직은 보풀이없는 닦아 제거 할 수 있습니다.
두 손가락 사이에 샘플을 사용하여 대부분의 연조직이 제거될 때까지 외부를 원형 운동으로 문지릅니다. 나머지는 한 쌍의 가위를 사용하여 잘라 낼 수 있습니다. 청소 된 하악골은 오른쪽에 표시됩니다.
마이크로 CT 스캔에서 샘플 챔버에 해부 된 헤미 하악을 장착하려면 쌀 곡물 크기의 포장 가능한 치과 수지를 로그에 형성합니다. 그런 다음 스테이지의 샘플 슬롯에 배치합니다. 헤미 하악을 복합재료에 놓습니다.
첫 번째 어금니가 미드라인 홈을 중심으로 하 고 오클루물 표면이 수평될 때까지 위치를 조정합니다. 포지셔닝에 만족하면 복합체를 치료합니다. 이것은 적절한 위치에 있는 하악의 예입니다.
포장 가능한 치과 수지의 작은 공을 가져 가라. 직경은 어금니의 폭 주위에 있어야합니다. 수지를 첫 번째 어금니의 폐색 표면에 놓습니다.
물로 보풀이없는 닦아. 감쇠된 닦은 닦기를 샘플 스테이지에 습도 풀 내부에 놓습니다. 샘플 챔버를 닫고 나사로 마이크로 CT에 부착합니다.
이제 모루 끝이 합성으로 둘러싸여 될 때까지 모루를 수직으로 낮추면서 2D 이미지를 가져 가라. X선 소스를 안전하게 끄고 마이크로 CT 챔버를 열고 투명 플렉시 유리 창을 통해 복합체를 치료합니다. 이제 샘플이 제대로 장착되고 필요에 따라 이미지를 이미지화할 수 있습니다.
광학적으로 지워진 헤미 하악샘플을 생성하려면 1.5mil 원심분리기 튜브에서 다음 솔루션을 준비하십시오. 4%파라포름알데히드, 50%와 70%에탄올을 산화된 물에 담는다. 100 % 에탄올과 에틸 신나메이트의 두 튜브.
4%의 파라포름알데히드에 해부 된 헤미 하악을 배치하십시오. 알루미늄 호일로 튜브를 덮고 실온에서 6 시간 동안 부드러운 설정에 로커에 배치합니다. 6시간 후 샘플을 50%에탄올로 옮길 수 있습니다.
샘플은 빛에서 덮인 16시간 동안 로커에 다시 놓습니다. 16시간 동안 70%에탄올로 샘플로 이전 단계를 반복한 다음 매번 16시간 동안 100% 에탄올이 두 번 반복됩니다. 마지막으로 샘플을 최소 12시간 동안 에틸 신나메이트로 이동합니다.
신뢰할 수 있는 치열 교정 운동은 Murine 하악 제1 어어에서 NiTi 코일 장치에 의해 생성됩니다. 9주 된 수컷 마우스에서, 평균 상호 근간 공간은 7 일 후에 40 미크론입니다. 위상 향상 마이크로 CT는 PDL의 시각화를 허용합니다.
3일간의 치열 교정 운동 후 PDL 밀도가 감소합니다. 뼈 PDL 인터페이스는 골 세포 활성 및 뼈 흡수를 나타내는 뼈 표면에 분화구의 개발로 인해 거칠다. 거친 표면은 뿌리의 모든 수준에서 볼 수 있습니다.
이는 운동이 티핑 모션과는 달리 번역적임을 보여줍니다. 7일째에 PDL 공간은 3일째보다 좁고, 말단 뿌리 표면의 뼈 PDL 테두리는 치열 교정 치아 운동이 발생할 때 예상대로 뼈 반대의 징후인 것이 더 부드럽다. 긴 마이크로 CT 이미징 시간과 단계의 회전으로 인해 시료의 안전한 장착이 필수적입니다.
크라운 주위에서 실루엣을 볼 수 있는 흐릿한 스캔을 초래하는 불안정한 샘플과 PDL 섬유는 보이지 않습니다. 에틸 신나메이트를 이용한 광학 클리어링은 단면화 없이 PDL을 보는 또 다른 방법을 제공한다. 기판은 오른쪽에 표시된 적절하게 지워진 샘플의 ramus를 통해 볼 수 있습니다.
이 방법은 내인성 형광을 보존하고 화학적 고정없이 사용할 수 있습니다. 라이트시트 현미경 검사는 지워진 시료에 사용할 수 있습니다. 형질전환 마우스를 사용하면 형광 혈관 안대기를 관찰 할 수 있습니다.
뼈가 제대로 지워지지 않은 경우 PDL의 혈관은 패널 F.이 프로토콜에 표시된 바와 같이 보이지 않으며 뮤린 하변 어과 치아에서 치열 교정 치아 의 움직임을 생성하고 분석하는 데 있어 두 가지 주요 과제를 극복하는 방법을 설명했습니다. 치열 교정 치아 운동 기술이 마스터되면 15 분 안에 완료 할 수 있습니다. 이 과정은 마우스 치아의 작은 치수와 혀의 존재로 인해 도전적입니다.
그러나 이러한 과제를 극복하기 위해 필요한 모든 솔루션을 제공합니다. 마이크로 CT 이미징에는 위상 향상 기능이 필요합니다. 우리는 벤치탑 마이크로 CT를 사용하여 우리의 기술을 시연했다. 그러나 위상 향상을 생성할 수 있는 모든 설정은 예를 들어 싱크로트론과 같은 작업을 수행합니다.
ECi 클리어링 결과는 탈수 과정에 따라 달라집니다. 샘플이 충분히 투명하지 않은 경우, 우리의 제안은 탈수 단계의 시간을 증가하는 것입니다. 당사의 클리어링 방법은 고정되지 않은 샘플에서도 사용할 수 있습니다.
명확한 조직은 클리어링 프로세스가 조직의 광물 함량에 영향을 미치지 않기 때문에 마이크로 CT에서 스캔 될 수 있습니다. 따라서 당사의 방법은 완전한 3D 분석을 생성하기 위해 형광 및 구조 정보에 대한 상관 관계 접근 방식을 제공합니다.
