Il movimento ortodontico dei denti è un complesso processo biologico che coinvolge forze esterne e rimodellamento di tessuti molli e duri. Per comprendere questi processi, è fondamentale studiare il dente e i tessuti parodontali all'interno del contesto 3D. Il modello murino è un buon candidato per tali studi a causa delle sue dimensioni, dell'alto tasso metabolico e delle vaste informazioni genetiche che abbiamo.
Tuttavia, creare movimento ortodontico dei denti nei topi non è facile a causa delle loro piccole dimensioni. Inoltre, i metodi di analisi strutturale di solito coinvolgono il sezionamento, che interrompe la struttura 3D e il contesto del tessuto. Per un tessuto non uniforme, come il PDL, preservare la struttura e il contesto 3D è di importanza critica.
Per affrontare questi due ostacoli, forniamo un protocollo per generare il movimento ortodontico mesiale dei denti del primo molare mandibolare nei topi e descriviamo due metodi che consentono la visualizzazione 3D del legamento parodontale senza separare il tessuto. Per posizionare il mouse anestetizzato per l'inserimento del dispositivo ortodontico, agganciare l'incisivo superiore al loop di graffetta. Immobilizzare gli incisivi inferiori utilizzando la catena di alimentazione E aprire ulteriormente la bocca con il retrattile del mouse mini-colibri.
Applicare una piccola goccia di soluzione salina su ogni occhio per prevenire la disidratazione corneale. Questi sono gli strumenti utilizzati nell'inserimento del dispositivo. Tagliare un pezzo di filo di alluminio a un centimetro di lunghezza.
Utilizzando il supporto dell'ago microchirurgico, far scorrere il filo dal lato buccale lingualmente nell'area interprossimale sotto il punto di contatto tra il primo e il secondo molare. Tirare il filo dal lato linguale verso il lato mesiale del molare. Ruotare le estremità libere del filo da due a tre volte per fissare.
Tagliare un pezzo di nichel titanio o niti bobina molla circa sette-nove fili di lunghezza. Inserire la bobina tra il primo molare inferiore e l'incisivo, passare un'estremità libera del filo attraverso due fili della bobina, quindi ruotare entrambe le estremità del filo saldamente per fissare la bobina al molare. Rimuovere la catena di alimentazione utilizzando un paio di pinzette.
Avvolgere da due a tre fili della bobina sopra l'incisivo per ancorare la bobina. Lasciare esattamente tre fili attivi tra il primo molare e l'incisivo. Far scorrere le minacce fino al margine gengivale libero incisore.
Posizionare uno strato di resina composita scorrevole sul bordo incisale della bobina e curarlo con luce di polimerizzazione dentale. Sostituire la catena di alimentazione dopo aver polimerizzato la resina. Tagliare il filo in eccesso intorno al molare per evitare lesioni.
Utilizzando la stessa luce di polimerizzazione, riscaldare la bobina NiTi per 20 secondi. Questo restringerà la bobina, il posizionamento finito dovrebbe essere simile a questo. I tessuti molli sull'emi-madibola sezionata possono essere rimossi con una salvietta priva di pelucchi.
Con un campione tra due dita, strofinare l'esterno in movimento circolare fino a quando la maggior parte del tessuto molle viene rimossa. Il resto può essere tagliato usando un paio di forbici. La mattiere pulita è mostrata qui sulla destra.
Per montare l'emi-mandibola sezionata nella camera campione dalla micro TAC, modellare una resina dentale comprimibile di grani di riso in un tronco. Quindi posizionarlo nello slot campione del palco. Posizionare l'emi-madibola sul composito.
Regolate la posizione fino a quando il primo molare non è centrato sulla scanalatura della linea mediana e la superficie occlusione è orizzontale. Curare il composito se soddisfatto del posizionamento. Questo è un esempio della mattiere in posizione corretta.
Prendi una piccola palla di resina dentale impacchettabile. Il suo diametro dovrebbe essere intorno alla larghezza del molare. Posizionare la resina sulla superficie occlusale del primo molare.
Pulire senza pelucchi con acqua. Posizionare la salvietta smorzata all'interno delle piscine di umidità nella fase del campione. Chiudere la camera campione e apporre sulla microTC con viti.
Ora scatta immagini 2D mentre abbassa l'incudine verticalmente fino a quando la punta dell'incudine non è circondata dal composito. Spegnere in modo sicuro la sorgente di raggi X, aprire la camera micro CT e curare il composito attraverso la finestra in plexiglass trasparente. Ora il campione è montato correttamente e può essere immaginato in base alle esigenze.
Per generare un campione emi-madibola otticamente eliminato, preparare le seguenti soluzioni in tubi di centrifuga da 1,5 mil. 4% di paraformaldeide, 50% e 70% di etanolo in acqua deionizzata. Due tubi di etanolo al 100% ed etil cinnamato.
Posizionare l'emi-madibola sezionata in paraformaldeide al 4%. Coprire il tubo con un foglio di alluminio e posizionarlo su un rocker su un ambiente delicato per sei ore a temperatura ambiente. Dopo sei ore, trasferire il campione in 50% di etanolo.
Riposizionare il campione sul rocker per 16 ore coperto di luce. Ripetere il passaggio precedente con un campione in 70%etanolo per 16 ore seguito dal 100%etanolo due volte per 16 ore ogni volta. Infine spostare il campione in etile cinnamato per un minimo di 12 ore.
Il movimento ortodontico affidabile è generato dal dispositivo a bobina NiTi nel primo molare mandibolare murino. Nei topi maschi di nove settimane, lo spazio interprossimale medio è di 40 micron dopo sette giorni. Il micro CT di miglioramento della fase consente la visualizzazione del PDL.
Dopo tre giorni di movimento ortodontico mesiale, la densità PDL viene ridotta. L'interfaccia PDL ossea è più ruvida a causa dello sviluppo di crateri nella superficie ossea, che sono indicativi dell'attività osteoclastica e del riassorbimento osseo. La superficie ruvida può essere vista a tutti i livelli delle radici.
Ciò dimostra che il movimento è traslazionale rispetto a un movimento di ribaltamento. Al settimo giorno, lo spazio PDL è più stretto rispetto al terzo giorno e il bordo del PDL osseo sulla superficie della radice distale è più liscio, che sono segni di opposizione ossea come previsto quando si verifica il movimento ortodontico dei denti. A causa del lungo tempo di imaging micro CT e della rotazione dello stadio, è essenziale un montaggio sicuro del campione.
Campione instabile in cui si trae una scansione sfocata in cui una silhouette può essere vista intorno alla corona e le fibre PDL non sono viste. La compensazione ottica con cinnamato etilico fornisce un altro metodo per visualizzare il PDL senza sessatura. Il substrato può essere visto attraverso il ramus di un campione adeguatamente cancellato mostrato qui a destra.
Questo metodo, preserva la fluorescenza endogena e può essere utilizzato senza fissazione chimica. La microscopia a fogli leggeri può essere utilizzata su campioni cancellati. Con un topo transgenico, si possono osservare i rivestimenti fluorescenti dei vasi sanguigni.
Se l'osso non è stato correttamente eliminato, i vasi sanguigni nel PDL non sono visibili come mostrato nel pannello F.Questo protocollo ha descritto come superare due sfide principali nella generazione e nell'analisi del movimento ortodontico dei denti nei denti molare mandibolari murini. Una volta padroneggiata la tecnica di movimento ortodontico dei denti, può essere completata in 15 minuti. Questo processo è impegnativo a causa delle piccole dimensioni dei denti del mouse e della presenza della lingua.
Tuttavia, forniamo tutte le soluzioni necessarie per superare queste sfide. L'imaging micro CT richiede una capacità di miglioramento della fase. Abbiamo dimostrato la nostra tecnica utilizzando una micro CT da banco. Tuttavia, qualsiasi configurazione in grado di generare un miglioramento della fase farà, ad esempio, un sincrotrone.
I risultati della cancellazione dell'ICE dipendono dal processo di disidratazione. Se il campione non è abbastanza trasparente, il nostro suggerimento è quello di aumentare il tempo dei passaggi di disidratazione. Il nostro metodo di compensazione può essere utilizzato anche su campioni non con prefisso.
I tessuti chiari possono essere scansionati nella microTC poiché il processo di compensazione non influisce sul contenuto minerale del tessuto. Pertanto il nostro metodo fornisce un approccio correlativo per la fluorescenza e le informazioni strutturali per generare un'analisi 3D completa.
