Ортодонтическое движение зубов – это сложный биологический процесс, который включает в себя внешние силы и ремоделирование как мягких, так и твердых тканей. Чтобы понять эти процессы, важно изучить зуб и ткани пародонта в 3D-контексте. Мышиная модель является хорошим кандидатом для таких исследований из-за ее размера, высокой скорости метаболизма и обширной генетической информации, которую мы имеем.
Однако создать ортодонтическое движение зубов у мышей непросто из-за их небольших размеров. Кроме того, методы структурного анализа обычно включают секционирование, которое нарушает 3D-структуру и контекст ткани. Для неоднородной ткани, такой как PDL, сохранение 3D-структуры и контекста имеет решающее значение.
Чтобы устранить эти два препятствия, мы предоставляем протокол для генерации мезиального ортодонтического движения зуба первого нижнечелюстного моляра у мышей и описываем два метода, которые позволяют 3D-визуализацию периодонтальной связки без сечения ткани. Чтобы расположить анестезируемую мышь для установки ортодонтического устройства, зацепите верхний резец за петлю скрепки. Обездвижьте нижние резцы с помощью силовой цепи И откройте рот дальше с помощью мини-колибри мышиного втягивающего средства.
Нанесите небольшую каплю физиологического раствора на каждый глаз, чтобы предотвратить обезвоживание роговицы. Это инструменты, используемые при установке устройства. Вырежьте кусок алюминиевой проволоки до одного сантиметра в длину.
Используя микрохирургический игольчатый держатель, сдвиньте проволоку с щечной стороны на лингвально в межпроксимальную область ниже точки контакта между первым и вторым моляром. Потяните проволоку с лингвальной стороны в сторону мезевой стороны моляра. Скручивание свободных концов проволоки два-три раза для закрепления.
Вырежьте кусок никелевого титана или катушки NiTi, пружинит длиной от семи до девяти нитей. Вставьте катушку между нижним первым моляром и резцем, пропустите один свободный конец проволоки через две нити катушки, затем плотно закрутите оба конца проволоки, чтобы закрепить катушку к моляру. Снимите цепь питания с помощью пинцетей.
Петля двумя-тремя нитями катушки над резцем для закрепления катушки. Оставьте ровно три активные нити между первым моляром и резцей. Сдвиньте угрозы вниз к свободному от резцов краю еской кисы.
Поместите слой текучих композитных смол на резцевую границу катушки и отвержите ее зубным отверждающим светом. Замените силовую цепь после отверждения смолы. Обрежьте лишнюю проволоку вокруг моляра, чтобы избежать травм.
Используя тот же свет отверждения, нагрейте катушку NiTi в течение 20 секунд. Это позволит затянуть катушку, готовое размещение должно выглядеть так. Мягкие ткани на рассеченной геми-мандибуле можно удалить безворсовой салфеткой.
С образцом между двумя пальцами втирайте внешнюю часть круговыми движениями, пока большая часть мягких тканей не будет удалена. Остальное можно отрезать ножницами. Очищенная мандибля показана здесь справа.
Чтобы установить рассеченную геми-мандиму в камеру для образцов с помощью микроКТ, сформируйте упакованную зубную смолу размером с рисовое зерно в бревно. Затем поместите его в пробную прорезь сцены. Поместите геми-мандиму на композит.
Отрегулируйте положение до тех пор, пока первый моляр не будет центрирован в канавке средней линии, а окклюзионная поверхность не будет горизонтальной. Отверждите композит, когда удовлетворены позиционированием. Это пример того, как мандибля находится в правильном положении.
Возьмите небольшой шарик упаковываемой зубной смолы. Его диаметр должен быть около ширины моляра. Поместите смолу на окклюзионную поверхность первого моляра.
Увлажняйте безворса протирайте водой. Поместите смочененную салфетку внутрь влагоемких бассейнов на стадии отбора проб. Закройте камеру для образцов и прикрепите ее к микро-КТ винтами.
Теперь делайте 2D-снимки, опуская наковальню вертикально, пока кончик наковальни не будет окружен композитом. Безопасно выключите источник рентгеновского излучения, откройте камеру микроКТ и отвержите композит через прозрачное окно из плексигласа. Теперь образец правильно смонтирован и может быть сфотирован по мере необходимости.
Для получения оптически очищенного образца гемичелибры готовят следующие растворы в центрифужных трубках по 1,5 млн. 4%параформальдегид, 50% и 70% этанол в деионизированной воде. Две пробирки со 100% этанолом и этилциннаматом.
Поместите рассеченную геми-мандиблю в 4%-ный параформальдегид. Накройте трубку алюминиевой фольгой и поместите на коромысилку на щадящую установку на шесть часов при комнатной температуре. Через шесть часов перенесите образец в 50% этанол.
Поместите образец обратно на коромысло в течение 16 часов, закрытых от света. Повторяйте предыдущий этап с образцом в 70% этаноле в течение 16 часов, а затем 100% этанолом дважды в течение 16 часов каждый раз. Наконец, переместите образец на этилциннамат в течение как минимум 12 часов.
Надежное ортодонтическое движение генерируется устройством катушки NiTi в первом моляре нижней части мыши. У девятинедельных самцов мышей среднее межпроксимальное пространство составляет 40 микрон через семь дней. МикроКТ с фазовым усилением позволяет визуализировать PDL.
После трех дней мезиального ортодонтического движения плотность PDL снижается. Интерфейс PDL кости более грубый из-за развития кратеров на поверхности кости, которые свидетельствуют об остеокластической активности и резорбции кости. Шероховатую поверхность можно увидеть на всех уровнях корней.
Это показывает, что движение является поступаемым, а не опрокидывающим движением. На седьмой день пространство PDL уже, чем на третий день, а граница костной PDL на поверхности дистального корня более гладкая, что является признаком костной оппозиции, как и ожидалось, когда происходит ортодонтическое движение зуба. Из-за длительного времени микроКТ-визуализации и вращения ступени, безопасный монтаж образца имеет важное значение.
Нестабильный образец, где приводит к размытому сканированию, где силуэт можно увидеть вокруг короны, а волокна PDL не видны. Оптическая очистка с использованием этилциннамата обеспечивает еще один метод просмотра PDL без секционирования. Субстрат можно увидеть через раму адекватно очищенного образца, показанного здесь справа.
Этот метод, сохраняет эндогенную флуоресценцию и может быть использован без химической фиксации. Микроскопия светового листа может быть использована на очищенных образцах. У трансгенной мыши можно наблюдать флуоресцентные слизистые кровеносные сосуды.
Если кость не была должным образом очищена, кровеносные сосуды в PDL не видны, как показано на панели F.В этом протоколе описано, как преодолеть две основные проблемы в генерации и анализе ортодонтического движения зубов в мышиных нижнечелюстных молярных зубах. Как только техника ортодонтического движения зубов освоена, ее можно завершить за 15 минут. Этот процесс является сложным из-за небольших размеров зубов мыши и наличия языка.
Тем не менее, мы предоставляем все необходимые решения для преодоления этих проблем. Микро-компьютерная томография требует возможности фазового усиления. Мы продемонстрировали нашу технику с помощью настольная микро КТ. Однако любая установка, которая может генерировать фазовое усиление, будет делать, например, синхротрон.
Результаты очистки ECi зависят от процесса обезвоживания. Если образец недостаточно прозрачен, мы предлагаем увеличить время этапов обезвоживания. Наш метод очистки может быть использован и на нефиксированных образцах.
Прозрачные ткани могут быть отсканированы на микро-КТ, так как процесс очистки не влияет на минеральное содержание ткани. Поэтому наш метод обеспечивает коррелятивный подход к флуоресценции и структурной информации для создания полного 3D-анализа.
