Das Verständnis der Wirksamkeit von Medikamenten in Tiermodellen ist kosten- und arbeitsintensiv. Unser Protokoll, das ein Ex-vivo-Gewebe-Explant-Modell verwendet, ist sowohl in Bezug auf die Kosten als auch auf das wissenschaftliche Personal, das für die Durchführung der Studie erforderlich ist, signifikant niedriger. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Verwendung von Schweineaugen, deren Anatomie und Physiologie den menschlichen Augen im Gegensatz zu einigen anderen Kleintiermodellen sehr ähnlich ist.
Wenn wir Medikamente in vitro testen, können sie eine Wirksamkeit zeigen, die in Tier- oder Humanmodellen fehlen könnte. Ex-vivo-Gewebesysteme sind der beste Weg, um zu verstehen, ob unsere In-vitro-Systeme in Tier- und Humanversuche übersetzt werden können oder nicht. Das Hornhautsystem der Schweine, obwohl weniger arbeitsintensiv, erfordert trainierbare Fähigkeiten, um die Medikamente zu isolieren, zu pflegen, zu infizieren und zu behandeln, insbesondere der Prozess der Isolierung der Hornhaut vom gesamten Schweineauge ist schwierig in Worten auszudrücken, erfordert aber eine visuelle Demonstration.
Nachdem Sie Schweineaugen von einem geeigneten Anbieter erhalten haben, lagern Sie die Taschentücher bis zur Verarbeitung auf Eis und legen Sie die entsprechende persönliche Schutzausrüstung an. Desinfizieren Sie den Arbeitsbereich mit 70% Ethanol und befestigen Sie eine Tischabdeckung auf dem Arbeitsplatz. Wenn der Arbeitsbereich fertig ist, legen Sie die Augen auf ein 50-Millimeter-Stück Gaze und greifen Sie mit der Gaze den hinteren Abschnitt mit einer Hand.
Machen Sie mit einer 30-Gauge-Nadel vorsichtig eine einzige Punktion in etwa der Mitte der Epitheloberfläche des Auges, achten Sie darauf, das Stroma nicht zu beschädigen, und verwenden Sie eine scharfe sterilisierte Klinge, um einen kleinen Schnitt an der Sklera in einem Millimeter Abstand von der Hornhaut zu machen. Mit einer schnellen und sanften Rotierenden Aktion der Hand und unter Berücksichtigung der Achtelpatschung, dass der Glaskörper nicht ausläuft, schneiden Sie den Rand der Hornhaut und halten Sie die Hornhaut an der Hornhaut-Sklera-Kante mit einer flachen Pinzette, verwenden Sie die Klinge, um die verbleibenden Bindemembranen abzuschneiden. Wenn jede Hornhaut isoliert ist, legen Sie das Gewebe nach oben in einzelne Vertiefungen einer 12-Well-Platte, die zwei Milliliter Hornhautmedium pro Vertiefung enthält, und fügen Sie fünf Mikroliter von fünf mal 10 zur fünften plaquebildenden Einheit von 17 GFP-Viruslösung an die debrided Stelle auf jeder Hornhautoberfläche hinzu.
Wenn alle Hornhäute gesammelt sind, legen Sie die Platte bei 37 Grad Celsius, 5% Kohlendioxid-Inkubator für 72 Stunden und sprühen Sie alle zusätzlichen Augen, die im Experiment nicht verwendet wurden, mit 10% Bleichmittel für ihre sichere Entsorgung in Biohazard-Beuteln. Legen Sie jeden Tag vor der Zugabe von Medikamenten die Hornhautplatte unter ein Stereomikroskop und wählen Sie den GFP-Filter und eine Belichtungszeit von 500 Mikrosekunden. Nehmen Sie die Bilder mit der niedrigsten Vergrößerung auf, bevor Sie die Hornhäute mit einer Reihe von zunehmenden Vergrößerungen abbilden, bis die gesamte Virusausbreitung und Dendritenbildung klar visualisiert werden kann.
Wenn alle Hornhäute abgebildet sind, bringen Sie die Platte in den Gewebekultur-Inkubator zurück. Waschen Sie am Tag vor der Infektion zweimal eine konfluente Vero-Zellkultur mit 10 Milliliter PBS pro Waschgang und behandeln Sie die Zellen mit einem Milliliter 0,05% Trypsin pro Vertiefung für fünf bis 10 Minuten bei 37 Grad Celsius. Wenn sich die Zellen gelöst haben, verwenden Sie neun Milliliter des gesamten Mediums, um sicherzustellen, dass sich die Zellen vollständig von der Kolbenoberfläche lösen und die resultierende Zellsuspension in ein 15-Milliliter-Zentrifugenrohr übertragen.
Fügen Sie 300 Mikroliter Zellen zu jeder Vertiefung einer neuen Sechs-Well-Platte hinzu, gefolgt von der Zugabe von zwei Millilitern Medium zu jeder Vertiefung, und legen Sie die Platte dann über Nacht in den Zellkultur-Inkubator. Um das Virus am nächsten Morgen zur Quantifizierung von jeder Hornhaut zu sammeln, tränken Sie sterile Wattestäbchenspitzen in 500 Mikroliter serumfreiem Medium pro Tupfer in mehreren Mikrozentrifugenröhrchen in einer Biosicherheitswerkbank für mindestens fünf Minuten. Am Ende der Inkubation die infizierten Schweinehornhautkulturen vorsichtig in den Schrank legen.
Machen Sie mit den nassen Wattestäbchen drei Umdrehungen im Uhrzeigersinn und drei Umdrehungen gegen den Uhrzeigersinn fünf Millimeter von der Mitte jeder infizierten Schweinehornhaut entfernt, ohne übermäßigen Druck auszuüben. Drehen Sie am Ende der Umdrehungsserie jeden Tupfer in seinem serumfreien, mit medium gefüllten Mikrozentrifugenröhrchen fünfmal im Uhrzeigersinn und gegen den Uhrzeigersinn, bevor Sie die Tupfer schneiden, so dass die Spitzen bei geschlossenem Deckel in jedes Röhrchen passen. Wenn alle Hornhäute abgetupfte sind, wirbeln Sie die Rohre mit hoher Geschwindigkeit für eine Minute.
Um die Menge des von jeder Hornhaut gesammelten Virus zu quantifizieren, bereiten Sie eine log10-verdünnte Verdünnung des Virus in serumfreiem Medium in Mikrozentrifugenröhrchen vor, bis eine Verdünnung von einmal 10 auf die negativen acht erreicht ist. Nachdem Sie das Wachstumsmedium aus jeder Zellbohrung abgesaugt haben, übertragen Sie einen Milliliter jeder Virusverdünnung, beginnend bei einem Mal 10 auf die negativen drei auf die plattierten Zellmonoschichten und legen Sie die infizierten Zellen für zwei Stunden in den Zellkulturinkubator. Am Ende der Inkubation jede Vertiefung zweimal vorsichtig mit PBS waschen, bevor Sie zwei Milliliter methylcellulosebeladenes Medium zu jeder Vertiefung für eine 72-stündige Inkubation hinzufügen oder bis die Bildung von Plaques beobachtet werden kann.
Nach der Plaquebeobachtung langsam einen Milliliter Methanol in die Ecke jeder Vertiefung geben, um eine 15-minütige Inkubation bei Raumtemperatur zu erhalten. Am Ende der Inkubation saugen Sie langsam den Inhalt aus jeder Vertiefung ab, ohne die Zellmonoschicht zu stören. Als nächstes beschriften Sie jeden Brunnen mit einem Milliliter kristallvioletter Arbeitslösung und achten Sie darauf, dass alle Zellen für eine 30-minütige Inkubation vor Licht geschützt sind.
Am Ende der Inkubation entsorgen Sie die Lösung und trocknen Sie die Vertiefungen auf einem Blatt saugfähigem Papier, dann zählen Sie die Anzahl der Plaques an der höchsten Verdünnungsbohrung, um den Gesamtvirusgehalt in der Startlösung dreimal zu quantifizieren. Wie in dieser stereoskopischen Fluoreszenzbildgebungsanalyse beobachtet, ist die antivirale Wirksamkeit von BX795 ähnlich wie die von TFT bei der Kontrolle der Virusausbreitung, während Hornhäute, die mit Vehikel behandelt wurden, nur eine Ausbreitung des Virus von der zentralen Infektionszone in die Peripherie bis sechs Tage nach der ersten Virusimpfung zeigen. In ähnlicher Weise zeigen die Augenabstriche, die an den Tagen zwei und vier nach der Infektion entnommen wurden, eine vollständige Hemmung des Virus in der Positivkontrolle und BX795-behandelten Proben, während in den Negativkontrollproben ein starker Anstieg des infektiösen Virustiters beobachtet wird.
Die Isolierung der Schweinehornhaut vom gesamten Schweineauge ist der wichtigste Schritt. Die Schritte 2.3 bis 2.6 sind in diesem Prozess am wichtigsten. Unser Modell kann verwendet werden, um die dendritische Ausbreitung des Virus in Schweinehornhäuten zu verstehen.
Diese Methode kann auch auf bakterielle und Pilzinfektionen ausgedehnt werden. Diese Methode hat dazu beigetragen, die dendritische Ausbreitung des Virus in Hornhäuten außerhalb eines menschlichen Modells zu visualisieren. Dieses Modell ist hilfreich, um die Wirksamkeit von Medikamenten zu testen, bevor es zu Tier- und Humanversuchen übergeht.
