Organoide sind eine leistungsstarke In-vitro-Technologie, die für das Screening von Medikamenten und das Verständnis biologischer Prozesse verwendet wird. Daher ist die Erzeugung von Organoiden, die die Zunge modellieren, entscheidend für die Untersuchung der Entwicklung und Regeneration von Geschmackszellen. Traditionelle In-vivo-Geschmacksstudien können teuer und zeitaufwendig sein.
Dieses Organoidprotokoll bietet eine standardisierte, reproduzierbare Alternative, die diese Herausforderungen minimiert und gleichzeitig Experimente mit höherem Durchsatz ermöglicht. Nachdem Sie eine erwachsene Maus eingeschläfert haben, verwenden Sie eine große sterile Dissektionsschere, um die Wangen zu schneiden und den Kiefer zu brechen. Heben Sie dann die Zunge an und schneiden Sie das linguale Frenulum, um die Zunge vom Boden der Mundhöhle zu trennen.
Schneiden Sie die Zunge aus und sammeln Sie sie in sterilen eiskalten dPBS mit Kalzium und Magnesium. Entfernen und entsorgen Sie unter einem Seziermikroskop die vordere Zunge, indem Sie nur die vordere der intermalaren Eminenz mit einer Rasierklinge schneiden. Dann verwenden Sie ein zartes Aufgabentuch, um Haare und überschüssige Flüssigkeit von der hinteren Zunge zu entfernen.
Als nächstes füllen Sie eine Ein-Milliliter-Spritze mit 200 bis 300 Mikrolitern Injektionsenzymlösung und führen Sie eine 30-Gauge-Halbzollnadel direkt über der Intermalar-Eminenz ein, bis sie nur vor den zirkumvallaten Papillen oder CVP liegt. Injizieren Sie die Enzymlösung unter und an den seitlichen Rändern des CVP zwischen dem Epithel und den darunter liegenden Geweben. Ziehen Sie die Spritze langsam und kontinuierlich aus der Zunge, während die Lösung injiziert wird.
Inkubieren Sie die Zunge und steriles calciummagnesiumfreies dPBS bei Raumtemperatur für genau 33 Minuten. Machen Sie mit einer extrafeinen Dissektionsschere kleine Schnitte im Epithel bilateral und nur vor dem CVP. Dann schälen Sie das Epithel vorsichtig, indem Sie es mit einer feinen Zette anheben.
Sobald das Grabenepithel frei vom darunter liegenden Bindegewebe ist, legen Sie es in zwei Milliliter Mikrozentrifugenröhrchen, die mit FBS vorbeschichtet sind. Fügen Sie den Dissoziationsenzymcocktail zu den Röhrchen hinzu, die das geschälte CVP-Epithel enthalten, und inkubieren Sie sie in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad für 45 Minuten mit einem kurzen Wirbel alle 15 Minuten. Während der letzten 15 Minuten der Inkubation 0,25% Trypsin-EDTA im Wasserbad vorwärmen.
Nach der Inkubation die Rohre in Triturate mit einer Glas-Pasteur-Pipette für eine Minute vortexen. Nachdem sich die Gewebestücke absetzen, pipetieren Sie den Überstand, der die erste Sammlung dissoziierter Zellen enthält, in neue FBS-beschichtete 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Drehen Sie den Überstand fünf Minuten lang bei 370 mal G und vier Grad Celsius, um die Zellen zu pelletieren.
Entfernen Sie den resultierenden Überstand, schalten Sie das Zellpellet im FACS-Puffer wieder auf und halten Sie es auf Eis. Um die verbleibenden Gewebestücke in den ursprünglichen zwei Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen zu dissoziieren, fügen Sie vorgewärmte 0,25% Trypsin-EDTA hinzu und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten mit kurzem Wirbeln alle 10 Minuten. Dann triturieren Sie die Gewebestücke mit einer Pasteur-Pipette aus Glas für eine Minute.
Nachdem sich die Gewebestücke absetzen, pipetieren Sie den Überstand in die 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhrchen, die die zuvor gesammelten dissoziierten Zellen im FACS-Puffer enthalten. Drehen Sie die Röhrchen mit den dissoziierten Zellen. Nachdem Sie den Überstand entfernt haben, resuspendieren Sie die Zellpellets im FACS-Puffer und halten Sie sie auf Eis.
Isolieren Sie dann die Lgr5-GFP-positiven Zellen über FACS mit dem grün fluoreszierenden Proteinkanal, wie im Textmanuskript beschrieben. Übertragen Sie die gewünschte Anzahl von Lgr5-positiven suspendierten Zellen in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen. Drehen Sie das Röhrchen fünf Minuten lang bei 370 mal G und vier Grad Celsius, um die Zellen zu pelletieren.
Entfernen Sie den Überstand und legen Sie das Rohr auf Eis. Das Zellpellet in der entsprechenden Menge Matrixgel mit schonender Pipetierung vorsichtig wieder aufregen. Halten Sie dann das Mikrozentrifugenrohr in einem 50 Milliliter konischen Röhrchen auf Eis, um zu verhindern, dass das Matrixgel geliert.
Fügen Sie 15 Mikroliter des Matrixgels in Zellmischung in der Mitte jeder Vertiefung einer 48-Well-Platte hinzu. Um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen zu gewährleisten, mischen Sie das Matrixgel und die Zellmischung durch Pipettieren nach dem Galvanisieren alle drei Vertiefungen. Legen Sie die Platte für 10 Minuten in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius, 5% Kohlendioxid und 95% Luftfeuchtigkeit, um das Gelier des Matrixgels zu ermöglichen.
Dann fügen Sie 300 Mikroliter WENRAS-Medien bei Raumtemperatur, ergänzt mit dem Gesteinsinhibitor Y27632, zu jeder Vertiefung hinzu und geben Sie die Platte in den Inkubator zurück. Entfernen Sie das Medium zwei Tage nach dem Plattieren mit einer Ein-Milliliter-Pipette oder per Vakuumaspiration aus jeder Vertiefung, um sicherzustellen, dass keine Kreuzkontamination zwischen den Bedingungen erfolgt. Fügen Sie 300 Mikroliter WENRAS-Medien an der Seite des Brunnens hinzu, achten Sie darauf, das Matrixgel nicht zu stören und die Platte in den Inkubator zurückzusenden.
Wenn linguale Organoide mit WENR-Medien kultiviert werden, wachsen sie nicht effizient. Nach Zugabe von A 83-01, einem TGF-beta-Signalinhibitor, und SB202190, P-38-Map-Kinase-Signalinhibitor, wird jedoch ein robustes Wachstum beobachtet. Interessanterweise führt das Entfernen dieser Inhibitoren aus dem Medium nach sechs Tagen zu einer höheren Expression des allgemeinen Geschmacksrezeptorzellmarkers Kcnq1, was darauf hindeutet, dass A 83-01 und SB-202190 die Differenzierung von Geschmackszellen behindern.
So wird ein optimales Wachstum und eine optimale Differenzierung erreicht, indem Organoide in WENRAS-Medien von Tag Null bis Sechs und WENR-Medien von Tag sechs bis 12 Kultivierungen erhalten werden. Reife Organoide enthalten sowohl Geschmackszellen, die durch Keratin-8 gekennzeichnet sind, als auch Nicht-Geschmacksepithelzellen, die durch Keratin-13 gekennzeichnet sind. Darüber hinaus wird Keratin-13 in höheren Konzentrationen exprimiert als alle drei Geschmacksrezeptorzellmarker, was darauf hindeutet, dass Organoide überwiegend aus nicht schmeckenden Epithelzellen bestehen.
Die Organoide exprimiert alle Geschmacksrezeptorzelltypen. Typ-eins-Zellen, die durch Entpd2 gekennzeichnet sind, und bittere Typ-Zwei-Zellen, die durch Gnat3 gekennzeichnet sind, werden in Geschmacksorganoiden stark exprimiert, während sauer schmeckende Typ-Drei-Zellen, die durch Car4 markiert sind, seltener sind. Die Geschmacksrezeptorzellen sind zufällig in den Organoiden verteilt und nicht in diskreten Geschmacksknospenstrukturen, die in vivo beobachtet werden.
Stellen Sie sicher, dass Sie etwas Gewebe posterior in das CVP aufnehmen, wenn Sie die Zunge aus der Mundhöhle sezieren. Stellen Sie außerdem sicher, dass beide Gräben herausspringen und beim Schälen des Epithels erhalten werden.
