Das Ziel dieses Protokolls war es, ein In-vitro-Modell zur Untersuchung der mechanischen Eigenschaften von Gelenkknorpel während des Beginns und des Fortschreitens von Arthrose zu erstellen. Der Hauptvorteil der vorliegenden Technik besteht darin, dass die Knorpelexplantate leicht zu erzeugen sind und in hohem Maße repräsentativ für den Knorpel des nativen Alters sind. Mit diesem Modell können verschiedene Arthrose-, Diagnose- und Therapieansätze auf biomechanischer Ebene analysiert und überwacht werden.
Zu Beginn schneidest du den Knorpel mit einem Skalpell vom Knochen weg. Erzeugen Sie mit einer Biopsiestanze Scheiben mit einem Durchmesser von vier Millimetern. Legen Sie die Scheibe auf ein speziell angefertigtes Schneidegerät.
Fixieren und stabilisieren Sie die Knorpelscheibe mit einem Spatel. Schneiden Sie die Knorpelscheibe mit einer Rasierklinge auf. Sammeln Sie die Scheibe mit einem Spatel und legen Sie sie in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen.
Um in den Knorpelproben zu bleiben, geben Sie 130 Mikroliter zellpermeablen Fluoreszenzfarbstoff in jede Vertiefung der 96-Well-Platte und verteilen Sie die Scheibe auf der Platte als eine Scheibe pro Well. Platzieren Sie die 96-Well-Platte auf dem Plattenhalter des Fluoreszenzmikroskops. Wählen Sie den passenden Fluoreszenzfilter und das Objektiv aus.
Positionieren Sie das Objektiv unter der vorausgewählten Vertiefung, die den einzelnen Knorpel enthält. Fokussieren Sie sich auf die Scheibe, um das Zellmuster zu erkennen. Wählen Sie die Navigator-Funktion, um einen Überblick über das gesamte Well zu erhalten.
Verwenden Sie die linke Maustaste und ziehen Sie sie, um zu einer anderen Bühnenposition zu navigieren. Wählen Sie ein Quadrat aus, das den zu scannenden Interessenbereich umfasst. Wählen Sie die Fokus-Map-Option der Software aus und wählen Sie dann jede einzelne Kachel aus, indem Sie mit der linken Maustaste in die Mitte klicken.
Wählen Sie im angezeigten Fenster die Option Fokuskarte mit allen zuvor ausgewählten Kacheln aus. Doppelklicken Sie auf eine Kachel, um sie anzuzeigen und in den richtigen Fokus zu bringen. Klicken Sie anschließend auf Z festlegen, um den Fokusplan zu speichern und mit der nächsten Kachel fortzufahren.
Nachdem Sie den Fokusplan für jede einzelne Kachel angepasst haben, starten Sie die Bildaufnahme, indem Sie auf Scan starten drücken. Fixieren Sie jede vorausgewählte Knorpelscheibe mit einem Zellmuster in Petrischale, indem Sie ausreichend biokompatiblen Kleber auf die obere, untere, linke und rechte Seite der Scheibe auftragen. Bedecken Sie die Scheiben mit 2,5 Milliliter Leibovitz-Medium ohne L-Glutamin.
Positionieren Sie die Petrischale im Probenhalter des AFM-Geräts. Um den AFM-Cantilever zu kalibrieren, platzieren Sie ihn auf der Oberfläche des Glasbaustein-Cantilevers, so dass er auf der polierten optischen Ebene in der Mitte des Glasblocks aufliegt. Senken Sie den Ausleger mit der Schrittmotorfunktion in 100-Mikrometer-Schritten ab, bis er vollständig in das Medium eingetaucht ist.
Um die gewünschte Knorpelmessstelle zu identifizieren, starten Sie einen Scanneransatz mit dem Cantilever auf einem sauberen, probenfreien Bereich der Petrischale. Ziehen Sie dann den Ausleger 1,5 Millimeter vom Boden der Platte entfernt ein. Wechseln Sie von der Hellfeld- zur Fluoreszenzansicht und identifizieren Sie visuell die Oberseite der Scheibe.
Bewegen Sie den AFM-Probenhalter genau zwei Millimeter in Richtung Mitte der Scheibe. Führen Sie einen Scanneransatz durch, um die Oberfläche der Knorpelscheibe zu erreichen, und ziehen Sie den Ausleger um 100 Mikrometer zurück. Um eine Kraft-Weg-Kurve zu erzeugen, konzentrieren Sie sich auf die Zellen, die sich an der gewünschten Messstelle befinden.
Klicken Sie auf die Schaltfläche "Ausführen", um die Messungen zu starten und fünf Kraft-Abstands-Kurven an jeder Messstelle zu erfassen. Speichern Sie die Kurven, sobald sie inspiziert wurden. Um die Elastizitätsmodule von Young zu schätzen, öffnen Sie mit der Option "Stapel von Spektroskopiekurven öffnen" die generierten Kraft-Weg-Kurven, die analysiert werden sollen.
Wählen Sie das Hertz-Fit-Modell und anschließend die Elastizitätsanpassungsoption. Visualisieren und dokumentieren Sie dann den Elastizitätsmodul. Passen Sie sich mit dem Poisson-Verhältnis von 0,5 und dem entsprechenden Auslegerspitzenradius an.
Überprüfen Sie dann visuell die Passung der Kraft-Weg-Kurve, um die Richtigkeit sicherzustellen. Für die Bestimmung der Eindringtiefe öffnen Sie jede der generierten Kraft-Weg-Kurven in der Datenanalysesoftware und wählen das Hertz-Fit-Modell als Analyseprozess aus. Wenden Sie die Option Basislinienversatz subtrahieren an, um die vertikale Durchbiegungsachse auf Null zu setzen, und wählen Sie die Funktion Versatz plus Neigung aus.
Verwenden Sie die Funktion "Kontaktpunkt suchen", um die Kontaktstelle automatisch zu identifizieren. Subtrahieren Sie mit der Funktion "Vertikale Spitzenposition" den Abstand, wobei nur die Auslenkung des Auslegers von der rohen Piezohöhe während des Eindrucks berücksichtigt wird. Wählen Sie die Option Elastizitätsanpassung aus, um die verarbeitete Kraft-Abstands-Kurve anzuzeigen.
Wählen Sie dann den Bereich des Diagramms so aus, dass er mit dem negativsten Wert auf der vertikalen Spitzenpositionsachse übereinstimmt. Lesen und dokumentieren Sie auf der Registerkarte Parameter im Feld XMIN den Einzug. Die Bandscheiben mit den einzelnen Saiten wiesen mit einem Median von 2,6 Kilopascal höhere Steifigkeitswerte auf, was repräsentativ für unbeeinträchtigte, gesunde Knorpelbereiche ist.
Mit Beginn und Fortschreiten der Arthrose zeigten die AFM-Messungen eine starke schrittweise Abnahme der Steifigkeit um 42 % bei Doppelsaiten, 77 % bei kleinen Clustern und schließlich 88 % in fortgeschrittenen Stadien, die durch große Cluster dargestellt werden. Die Scheiben, die ein diffuses Muster enthielten, zeigten eine erhöhte Elastizität mit einer signifikanten Variation der Einzelwerte des Elastizitätsmoduls. Für alle Knorpelscheiben mit zugeordneter vorherrschender zellulärer Musterorganisation wurde festgestellt, dass die mit dem verwendeten Sollwert assoziierte Eindringtiefe umgekehrt proportional zur Steifigkeit ist.
Die Artefakte in den generierten Kraft-Distanz-Kurven deuten entweder auf einen suboptimalen Kontakt zwischen dem AFM-Cantilever und der Knorpeloberfläche oder auf eine unsachgemäße Fixierung der Probe an der Petrischale hin. Unsere Knorpelexplantate können mit einer Vielzahl molekularbiologischer Techniken weiterverarbeitet und analysiert werden, wie z.B. Proteinanalyse mittels Eliza, Immuno-Labeling, Western Moding oder Genanalyse mittels PCR. Diese Methode kann verwendet werden, um die direkten Auswirkungen neuer Therapien auf den Gelenkknorpel zu untersuchen und den Forschern zu helfen, wichtige Einblicke in die Potommechanismen der Arthrose zu gewinnen.
