LRC-V. will dieses Papier, die Erinnerung an Dr. Adriel D. Johnson, ein wunderbarer Professor, dessen Priorität Nummer eins war immer die Ausbildung der Studierenden zu widmen. Wir vermissen Dich, Adriel. Wir sind dankbar, dass Jacqueline Moreno für ihre Hilfe bei der Durchführung der Experimente in dieser Studie beschrieben. Diese Studie wurde durch einen Zuschuss zur Verfügung gestellt von der National Science Foundation, MCB-0615390 CY unterstützt und durch eine Anschubfinanzierung zur Verfügung gestellt, um LRC-V. von der University of Alabama in Huntsville.

1. Zellfreie Extrakt Vorbereitung. <ol><li> Zwei Gramm eines trockenen Escherichia coli Bakterien-Pellet aus der mittleren logarithmischen Phase Kulturen gewaschen, zweimal, mit einem halben Liter Puffer erhalten A mit 10 mM Tris-Acetat, pH 8,0, 14 mM Magnesium-Acetat, 60 mM Kaliumacetat und 50 ug / mL phenylmethanesulphonylfluoride (PMSF) durch Zentrifugation bei 5000 X g für 5 min bei 4 ° C. Nach dem Waschen wird das Bakterienpellet in 40 ml Puffer A resuspendiert </li><li> Die Bakterienzellen werden unterbrochen mit einem Französisch Presse, Anwendung 6000 psi Druck. Dieser Druck entspricht 600 Einheiten mit einem Ein-Zoll-Kolben. Die gestört Suspension wird in ein sauberes Glasröhrchen (50 ml) gesammelt. </li><li> Die gestört Suspension wird mit 1 mM Dithiothreitol (DTT) behandelt und bei 30.000 xg für 30 min zentrifugiert. Die Zentrifugation Vorgang wird solange wiederholt, wobei die resultierende Überstand. Der letzte Überstand wird verzichtet (1 mL) in Röhrchen. Schließlich werden die Aliquots eingefroren mit einem Trockeneis-Ethanol-Gemisch oder flüssigem Stickstoff, und bei -60 ° C gelagert oder -80 ° C. </li></ol> 2. Vorbereitung von zellfreien Extrakten von RF2 Depleted. <ol><li> 4,5 ml Protein A-Sepharose 4B Gülle Perlen werden mit 5 ml eines Anti-RF2 anti-Serum mit einem rotierenden Rad bei Raumtemperatur für eine Stunde gemischt. Die Mischung wird bei 2500 xg zentrifugiert, um die Perlen aus dem Antiserum zu trennen. Nach Verwerfen des Überstandes werden diese Kügelchen, die anti-RF2 Antikörper (anti-RF2 Perlen) später durch Resuspendieren in 1 ml Puffer B mit 35 mM Tris-Acetat pH 7,8, 10 mM Magnesium-Acetat, 30 mM Ammoniumacetat, 60 mM Kalium-Glutamat und 5 ug / ml Leupeptin Proteinase-Inhibitor. Die Anti-RF2 Kügelchen werden dann aus dem Puffer B durch Zentrifugation mit den gleichen oben angegebenen Bedingungen getrennt. Der Waschvorgang wird zweimal wiederholt. </li><li> Ein ml der zellfreien Extrakt wird mit 150 ul Anti-RF2 Perlen mit einem sich drehenden Rad, bei 4 ° C gemischt, für zwei Stunden. Die Mischung wird bei 10.000 xg zentrifugiert, um den zellfreien Extrakt aus den Perlen zu trennen. Der Überstand wird entfernt und behandelt erneut mit einem anderen 150 ul Anti-RF2 Perlen. Dieses Verfahren wird noch einmal mit den daraus resultierenden zellfreien Extrakt-Lösung wiederholt. Die endgültige zellfreien Extrakt-Lösung verzichtet wird (100 ul) in Röhrchen. Die Aliquots eingefroren mit einem Trockeneis-Ethanol-Gemisch oder flüssigem Stickstoff, und bei -60 ° C gelagert oder -80 ° C. </li></ol> 3. Erstellung eines DNA-Vorlage. <ol><li> Bereiten Sie eine 1 mL PCR-Reaktion durch Mischen 600 Femtomol der Plasmid-Vorlage mit den Sequenzen übersetzt werden (Abb. 1), mit 0,4 Nanomol jedes der Oligodesoxynukleotide in Abb. 1, 0,2 Mikromol je dNTP und 50 U angegeben Taq- DNA-Polymerase in den Puffer durch Stratagene Co. geliefert Führen Sie die Amplifikationsreaktion unter folgenden Bedingungen: 94 ° C für 2 min, (94 ° C für 30 s, 55 ° C für 30 s, 72 ° C für 1 min; für 30 Zyklen) und 72 ° C für 12 min. </li><li> Purify der PCR-Produkte durch Fällung der DNA durch Zugabe von 1 / 10 Volumen 3 M Natriumacetat, pH 5,2 und 2 Volumen eiskaltem Ethanol. Wiederholen Sie die Niederschläge Verfahren noch einmal. Die DNA in 100 ul von Diethyl-(DEPC) behandelt-Wasser. Normalerweise liefert dieses Verfahren 100 ug eines 600 bp DNA-Produkt. </li><li> Überprüfen Sie die Integrität der PCR-Produkte durch Elektrophorese auf Agarosegelen. </li></ol> 4. Vorbereitung von Biotin markiert mRNA. <ol><li> Bereiten Sie eine 100 ul in vitro Transkriptions-Reaktion in DEPC behandeltem Wasser durch Mischen von 5 ug des PCR-generierten DNA-Fragment mit 0,5 Mikromol ATP, CTP, GTP, 0,3 Mikromol UTP, 50 Nanomol Biotin-16-UTP und 10 ul von T7 Enzym-Mix in der Puffer von Promega Co. geliefert Inkubieren der Reaktionsmischung bei 37 ° C für 3 Stunden. Zur Quantifizierung der Menge an mRNA erhalten, sollten die DNA-Matrize durch Zugabe von RNase-freier DNase beseitigt werden. Inkubieren Sie die Reaktion bei 37 ° C für 10 min. </li><li> Purify die mRNA-Produkte durch Fällung der RNA durch Zugabe von 1 / 10 Volumen 3 M Natriumacetat, pH 5,2, und 2 Volumina kaltem Ethanol. Wiederholen Sie die Niederschläge Verfahren noch einmal. Resuspendieren des mRNA in 100 ul DEPC-Wasser behandelt. In der Regel bezeichnet dieses Verfahren Renditen zwischen 1-2 mg eines 600 nt Biotin mRNA Produkt. </li><li> Überprüfen Sie die Integrität der Biotin-markierten mRNA-Produkte durch Elektrophorese auf Agarosegelen. </li></ol> 5. Isolierung von Ribosomen übersetzen enthaltend ein Peptidyl-tRNA. <ol><li> Bereiten Sie 500 mL einer in vitro Translation Reaktionsgemisch in DEPC behandeltem Wasser durch Mischen 10-15 pg Biotin-markierten mRNA mit 75 Nanomol jedes der neunzehn Aminosäuren-alle außer die Aminosäure, die von einer radioaktiven Aminosäure ersetzt werden , 50 uCi einer radioaktiven Aminosäure (37MBq), und 20-5<html> 0 ul von RF2-abgereicherten zellfreien Extrakt, in einer gepufferten Reaktionsgemisch mit 40 mM Tris-Acetat, pH 8,0, 10 mM Magnesium-Acetat, 175 mM Kaliumacetat, 10 mM Ammoniumacetat, 2 mM DTT, 2 mM ATP, 0,5 mM GTP, 30 mM Phosphoenolpyruvat (PEP), 0,3 U / ml Pyruvatkinase (PK), 3,5% Polyethylenglykol 8000, 1 mM Spermidin, 20 pg / mL Folinsäure und 250 ug / ml tRNA aus E. coli. Inkubieren der Reaktionsmischung bei 37 ° C für 10 Minuten. Die Reihenfolge der Zugabe der Reaktionspartner ist sehr wichtig. Der zellfreie Extrakt muss zuerst mit der Pufferlösung mit den Aminosäuren und die endgültige Mischung für 5 min bei Raumtemperatur inkubiert, um die Aktivierung der Ribosomen können gemischt werden. Später werden die Biotin-markierten mRNAs aufgenommen. Für strukturelle Analysen mit chemischen Modifikation Verfahren ist die Zugabe eines radioaktiven Aminosäure nicht erforderlich. </li><li> Hinzufügen, um die Übersetzung Reaktionsgemisch - 3 ml Streptavidin paramagnetischen Kügelchen (SMB) in Puffer C suspendiert, das 35 mM Tris-Acetat, pH 8,0, 10 mM Magnesium-Acetat, 175 mM Kaliumacetat, 10 mM Ammoniumacetat und 1 mM DTT. Inkubieren Sie die neue Suspension bei Raumtemperatur für 10 min. </li><li> Trennen Sie die SMB aus dem Gemisch durch Anlegen eines Magnetfeldes (MF) mit magnetischen Trennung steht. </li><li> Resuspendieren SMB in Puffer C und trennen Sie die Perlen wieder mit dem MF. Wiederholen Sie diesen Waschvorgang zweimal. Resuspendieren der Beads in 500 ul Puffer C, speichern Sie die Suspension auf Eis, und führen Sie das nächste Verfahren sofort. </li></ol> 6. Analyse der isolierten Ribosomen enthaltend die Peptidyl-tRNA. Für Peptidyl-tRNA <ol><li> Mix 10 ul des SMB (suspendiert in Puffer C) mit 10 ul einer Be-Puffer mit 50 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2,5% (v / v) Glycerin, 4% Natriumdodecylsulfat, 2 mM DTT und 0,2 mg / mL Bromphenolblau. Lösen Sie die Komponenten an die Perlen, indem Sie die Proben in 10% Tris-Tricin Polyacrylamidgelen. </li><li> Trocknen Sie die Gele mit Hilfe eines Vakuum-Gel-Trockner. </li><li> Überprüfen Sie die Integrität und die Reinigung der Peptidyl-tRNA, indem die getrockneten Gel ein Röntgenfilm. </li></ol> Für die ribosomale RNA <ol start="4"><li> Add 190 &amp;mgr; l 2 mM Ethylendiamintetraacetat (EDTA)-Lösung mit DEPC-behandeltem Wasser hergestellt, und 200 ul Phenol equilibriert mit Wasser auf 10 mL einer Bead-Suspension. Mix der Suspension durch kräftiges Vortexen und trennen Sie die anorganische Phase von der organischen Phase durch Zentrifugation bei 10.000 xg für 3 min bei Raumtemperatur. Sammeln Sie die Top-Wasserschicht in einem neuen Mikroröhrchen. </li><li> Fällung der RNA aus dem Wasser-Schicht, indem 1 / 10 Volumen 3 M Natriumacetat, pH 5,2, 1 ul 20 mg / ml Glykogen-Lösung und 2 Volumen eiskaltem Ethanol. Die RNA in 10 ul DEPC-behandeltem Wasser. </li><li> Überprüfen Sie die Integrität der ribosomalen RNAs durch Elektrophorese auf Agarosegelen. Normalerweise liefert 50 ul Perlen Aufhängung 1 g der ribosomalen RNA. </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse: Abbildung 2 zeigt die Ergebnisse einer Reihe von Analysen der Bewertung der Qualität und Funktionalität der Übersetzung Ribosomen isoliert unter Verwendung des Verfahrens beschrieben. Die Beobachtung einer einzigartigen Band in Polyacrylamidgelen gelöst weist auf das Vorhandensein von Polypeptiden gebunden an die Biotin-markierten mRNAs an der SMB (Abbildung 2A). Die Reinigung der ribosomalen RNAs mit diesem Verfahren stellt die Anwesenheit von Ribosomen gebunden, diese Biotin-markierten mRNAs, sowie (Abbildung 2B). Die Zugabe von Puromycin, ein Antibiotikum, das die Peptidyl-Transferase-Aktivität des Ribosoms induziert, führt zu Spaltung der entstehenden Peptidyl-tRNAs 1. Dies wird als eine Verschiebung der Migration Muster des isolierten Polypeptids in Polyacrylamidgelen (Abb. 2C) beobachtet. Zusammen zeigen diese Daten, die Biotin-markierten mRNAs an der SMB funktionellen Ribosomen enthalten, mit Peptidyl-tRNAs. Die Isolierung des Übersetzens Ribosomen mit spezifischen Peptidyl-tRNAs ermöglicht die Untersuchung der Auswirkungen der Peptidyl-tRNAs, Antibiotika und anderen Molekülen, auf ribosomalen Funktion (Abbildung 3A), und am Ribosom Struktur (Abbildung 3B). In der hier vorgestellten Beispiele das Antibiotikum Sparsomycin und der Aminosäure Tryptophan (Trp) hemmen die hydrolytische Spaltung der entstehenden tnaC-tRNA Peptidyl-tRNA induziert durch RF2 in den isolierten Ribosomen (Abb. 3A). Das Zusammenspiel von Sparsomycin oder Trp mit dem Ribosom induziert auch strukturelle Veränderungen in einigen Nukleotiden, dass die 23S rRNA der Ribosomen übersetzen (Abb. 3B) darstellen. Zusammenfassend beschrieb das biologische Material unter Verwendung des Verfahrens hier sind nützlich bei der Beschaffung von zusätzlichen Verständnis der strukturellen Kontakte zu einer Hemmung der ribosomalen Funktion auf ihre Wechselwirkung mit verschiedenen molekularen Faktoren beteiligt. ove_content &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/2498/2498fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Vorgehensweise zur Herstellung und Reinigung der Übersetzung Ribosomen mit Peptidyl-tRNAs. DNA-Fragmente ca. 650 bp in der Länge, mit der tnaC Gens und seiner angrenzenden Region, in der Abbildung dargestellt, werden als Vorlagen bei der Vorbereitung mRNAs mit Biotin, [(bio) UMP] mRNA verwendet. Diese DNA-Fragmente werden durch PCR-Verfahren unter Verwendung der Oligodesoxynukleotide an der Spitze der Figur angegeben hergestellt. Die unterstrichenen Buchstaben kennzeichnen die Lage des T7-Promotors in der Nukleotid-Primer kodiert. Bold Buchstaben geben die Shine-Dalgarno Sequenz, in der Übersetzung der tnaC mRNA-Sequenzen verwendet wird. Der T7-Promotor in das DNA-Fragment wird durch T7-RNA-Polymerase, die zur Transkription (Pfeil) der tnaC Sequenz und die nicht-kodierenden Sequenz stromabwärts erkannt wird. Die Transkription ist beendet, wenn RNA-Polymerase erreicht das 3&#39;-Ende des DNA-Fragments, nach dem rpoBC Terminator-Sequenzen (rpoBC &quot;t&quot;). Die Stamm-Schleife-Struktur der rpoBC Terminator schützt die mRNA aus dem 3&#39;-5 &#39;exoribonuclease Aktivität im zellfreien Extrakten in der in vitro Translation Reaktionen eingesetzt. Die isolierte [(bio) UMP] mRNAs werden verwendet, um ins Stocken geraten, Übersetzung Ribosomen erzeugen, mit der in vitro Translation-Assays. Die tnaC Sequenz in der [(bio) UMP] mRNA wird von einem Ribosom, die bei der letzten Aminosäure eingebaut wird Ständen, wegen der Abwesenheit der Release Factor (RF2) aus dem Reaktionsgemisch übersetzt. Das Ribosom-[(bio) UMP] mRNA-Komplexe werden von der gesamten Reaktionsmischung mit Streptavidin-Magnetic-Beads (SMB), die die Biotin-markierte Nukleotide in die mRNA eingebaut binden isoliert. Der kleine und mittelständische Unternehmen gebunden Ribosom-[(bio) UMP] mRNA-Komplexe sind aus der gesamten Reaktionsmischung durch ein Magnetfeld (MF) extrahiert. <img src="/files/ftp_upload/2498/2498fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Strukturelle und funktionelle Analysen der isolierten Komplexe. A) In-vitro-Translation-Reaktionen wurden mit durchgeführt [(bio) UMP] mRNAs, in denen das Startcodon des tnaC Gen durch ein Stop-Codon ersetzt wurde. Die Endprodukte wurden isoliert mittels Streptavidin-Beads, wie in Abb. 1 zu ersehen. Reaktionsprodukte und isolierten Moleküle wurden dann durch Elektrophorese auf Polyacrylamidgelen analysiert. Die tnaC-tRNA und tnaC Peptid-Bands sind markiert. B) Gesamt-RNA wurde aus den festgefahrenen Komplexe mit Phenol-Extraktion Verfahren isoliert. Jeder isolierte RNA wurde durch Elektrophorese in Agarosegelen aufgelöst. Ribosomalen RNAs (rRNA) sind angegeben. C) isolierten Komplexen mit tnaC-tRNAs wurden inkubiert mit (+) oder ohne (-) 0,02 mM Puromycin (Puro) bei Raumtemperatur für 10 min. Die tnaC Peptid wurden während der Übersetzung mit [35S]-Methionin (A) oder [3H]-Prolin (B) gekennzeichnet. <img src="/files/ftp_upload/2498/2498fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Strukturelle und funktionelle Analysen von Ribosomen mit tnaC-tRNA, die gegen das Antibiotikum Sparsomycin oder die Aminosäure Tryptophan gebunden sind. A) isolierten Komplexen mit tnaC-tRNAs wurden mit (+) oder ohne (inkubiert -) Sparsomycin (Spar) oder Tryptophan (Trp) bei Raumtemperatur für 5 min. Später wurden die Mischungen mit RF2 gemischt und bei 37 ° C für 20 min. B) Analyse der Methylierung Veränderungen in 23S rRNA-Moleküle durch Bindung innerhalb des Ribosoms induziert. Isolierte Komplexe wurden mit (+) oder ohne vorinkubiert (-) 2 mM Trp oder Spar für 5 min bei 37 ° C. Dann wurde ein Alkylierungsmittel Dimethylsulfat, zugegeben und die Mischungen bei Raumtemperatur für weitere 20 min inkubiert. Gesamt-RNA wurde extrahiert und Primer-Extension-Assays wurden mit [32P]-markierten Oligodesoxynukleotids komplementär zu den Nukleotiden der 23S rRNA, die 100 Nukleotide beabstandet sind, hinter das modifizierte Nukleotid durchgeführt. Die Endprodukte der Erweiterung Assays wurden durch Elektrophorese in Polyacrylamidgelen aufgelöst. Die 23S rRNA Nukleotide durch die Anwesenheit von Trp oder Spar betroffen sind angegeben.

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Diese Isolation Verfahren in diesem Bericht beschrieben wird, in hohem Maße reproduzierbar. Leider kann das Vorhandensein von kurzen Peptidyl-tRNAs aus dem gleichen translatierten Sequenzen produziert nicht bequem vermieden werden, wie Peptidyl-tRNAs kann auf 15-20% der gesamten isolierten Materials (Abbildung 2C) entsprechen. Diese Verunreinigungen können in der Konzentration zu erhöhen, wenn höhere Konzentrationen von Biotin-markierten mRNA verwendet wurden oder wenn die zellfreie Extrakte eingesetzt alt sind oder wurden mehrmals wieder verwendet werden. Daher ist es sehr wichtig, um die Qualität und Konzentration der Komponenten der in-vitro-Translation Reaktionen zu kontrollieren. Alternativ rekonstituierte kommerziellen hohen Wirkungsgrad zellfreie Extrakte zur Verfügung, die für die gleichen Zwecke (PURE-System) 18 verwendet werden. Mit dieser Methode ist Biotin-16-UMP zufällig entlang der Länge der Ziel-mRNA eingearbeitet. Es besteht die Möglichkeit, dass einige ORFs mit Uridin Verträge eingearbeitet haben diese modifizierte Nukleotid, in ihren Sequenzen die ihre Übersetzung. Variable relativen Konzentrationen von biotin-16-UTP/UTP müssen während der Synthese der mRNA getestet werden, um die effizienteste Übersetzung zu erhalten. Alternative Methoden der Biotin-Markierung verwendet werden, gezielt das 5&#39;-Ende, das stabilste Ende der mRNAs. (I) Biotin kann das 5&#39;-Ende der mRNA mit 3&#39;-NH2ATP (3&#39;-Amino-, 3&#39;-desoxy-Triphosphat) und T4 RNA-Ligase 19 befestigt werden. (Ii) 5&#39;-Ende mit Biotin markierte Oligonukleotid kann das 5&#39;-Ende der mRNA mit Hilfe der T4-RNA-Ligase sowie 20 befestigt werden. (Iii) 3&#39;-Ende Biotin-markierten Oligodesoxynukleotide die an die komplementäre Sequenz am 5&#39;-Ende der mRNA entsprechen könnten auch verwendet werden, um die Übersetzung von Komplexen zu isolieren. Diese Biotin markiert Oligodesoxynukleotide konnte die SMB befestigt werden, bevor die Isolation. Später wurde der SMB, die Biotin-markierten Oligodesoxynukleotide befestigt konnte mit der Übersetzung Reaktionsgemisch, um die Interaktion mit ihren komplementären mRNA-Sequenzen ermöglichen gemischt werden. Nach der Isolierung der Hybrid-RNA-DNA-Region - Hybridisierung und den Bereich zwischen dem Biotin-markierten Oligodesoxynukleotids und die mRNA-Sequenz - konnten abgebaut werden mittels RNAse H, trennt die festgefahrenen Komplexe aus der Streptavidinbeads. Diese alternative Methode können der Komplexe in Zukunft strukturelle Analysen mit höherer Auflösung Methoden eingesetzt werden.

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<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Magnesium acetate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>63049</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Potassium glutamate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G1501</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ammonium acetate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>09688</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PMSF</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P7626</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Protein A sepharose 4B slurry beads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P9424</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Leupeptin inhibitor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>L9783</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Taq-DNA polymerase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stratagene</td>
<td>201223</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T7 Maxiprep kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>P1300</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SMB</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>Z5482</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Biotin-16-UTP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>1388908</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ATP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A7699</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GTP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G8877</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PEP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P7002</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PK</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P7768</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Polyethylenglycol 8000</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>81268</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Folinic acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>47612</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Spermidine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>85558</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>tRNA from E. coli</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>R1753</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DEPC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D5758</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tricine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T5816</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-amino acids</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>LAA21</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DTT</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>43815</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>magnetic separation stands</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>Z5342</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

isolation of translating ribosomes containing peptidyl-trnas for functional and structural analyses

Vor kurzem haben strukturelle und biochemische Studien viele der molekularen Ereignisse, die in den Ribosomen treten bei der Hemmung der Proteinsynthese durch Antibiotika und während entstehenden Polypeptidsynthese detailliert. Einige dieser Antibiotika und regulatorischen entstehenden Polypeptide meist in Form von Peptidyl-tRNAs, hemmen entweder die Bildung der Peptidbindung oder Übersetzung Beendigung 1-7. Diese hemmenden Ereignisse kann die Bewegung des Ribosoms zu stoppen, bezeichnet ein Phänomen der &quot;translationalen verhaften&quot;. Übersetzung Verhaftung durch entweder ein Antibiotikum oder einer entstehenden Polypeptid induziert wurde gezeigt, dass die Expression von Genen in verschiedenen zellulären Funktionen wie Zellwachstum, Antibiotika-Resistenz, Protein-Translokation und Zellstoffwechsel 8-13 beteiligt zu regulieren. Wissen, wie Antibiotika und regulatorischen entstehenden Polypeptide verändern ribosomalen Funktion ist unerlässlich, wenn wir die komplette Rolle des Ribosoms in der Übersetzung, in jedem Organismus zu verstehen. Hier beschreiben wir eine einfache Methode, die verwendet werden, um zu reinigen, ausschließlich für die Analyse, der Umsetzung dieser Ribosomen eine spezifische mRNA und mit einer spezifischen Peptidyl-tRNA 14 kann. Dieses Verfahren beruht auf selektiven Isolierung des Übersetzens Ribosomen gebunden an ein Biotin-markierten mRNA basieren. Diese translationale Komplexe sind aus anderen Ribosomen in der gleichen Mischung getrennt, mit Streptavidin paramagnetischen Kügelchen (SMB) und ein Magnetfeld (MF). Biotin-markierten mRNAs werden von run-off-Transkription Tests unter Verwendung als Vorlagen PCR-generierten DNA-Fragmente, die T7 Transkriptions-Promotoren enthalten synthetisiert. T7-RNA-Polymerase enthält Biotin-16-UMP aus Biotin-UTP; unter unseren Bedingungen etwa zehn Biotin-16-UMP-Moleküle sind in einem 600 nt mRNA mit einem 25% UMP Inhalte integriert. Diese Biotin-markierten mRNAs werden dann isoliert und in ein in vitro-Translation-Assays mit dem Release Faktor 2 (RF2) durchgeführt abgereicherte zellfreien Extrakten von Escherichia coli-Stämme, die Wildtyp-oder mutierte Ribosomen erhalten. Ribosomen übersetzen die Biotin-markierten mRNA-Sequenzen sind in der Stop-Codon Region ins Stocken geraten, wegen der Abwesenheit der RF2-Protein, das normalerweise erreicht Übersetzung Kündigung. Stalled Ribosomen mit den neu synthetisierten Peptidyl-tRNA isoliert und entfernt von der Übersetzung Reaktionen mit SMB und ein MF. Diese Kügelchen binden nur Biotin-haltigen Nachrichten. Die isolierte, translationale Komplexe können verwendet werden, um die strukturellen und funktionellen Eigenschaften von Wildtyp-oder mutierte ribosomale Komponenten oder Peptidyl-tRNA-Sequenzen, sowie die Bestimmung Ribosom Interaktion mit Antibiotika oder anderen molekularen Faktoren 1,14-16 zu analysieren. Um zu untersuchen, die Funktion dieser isolierten Ribosomen-Komplexe können Peptidyl-Transferase-Assays in Anwesenheit des Antibiotikums Puromycin 1 durchgeführt werden. Zur Untersuchung struktureller Veränderungen in der translationalen Komplexe können etablierte Verfahren eingesetzt, wie i sein) Vernetzung auf bestimmte Aminosäuren 14 und / oder ii) Alkylierung Schutz Assays 1,14,17.

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Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses

Ein wesentliches Hindernis für biochemische Analysen von Ribosomen, die im Entstehen begriffenen Peptidyl-tRNAs hat das Vorhandensein von anderen Ribosomen in der gleichen Proben, Ribosomen nicht in der Übersetzung der spezifischen mRNA-Sequenz, die analysiert werden beteiligt. Wir entwickelten eine einfache Methode, um zu reinigen, ausschließlich, den Ribosomen, welche die entstehenden Peptidyl-tRNA von Interesse.

Isolierung von Ribosomen übersetzen enthaltend Peptidyl-tRNAs für funktionelle und strukturelle Analysen

Recently, structural and biochemical studies have detailed many of the molecular events that occur in the ribosome during inhibition of protein synthesis ...

isolation-translating-ribosomes-containing-peptidyl-trnas-for

Research

JoVE Journal

Biology

19.7K Aufrufe.  University of Alabama Huntsville. Ein wesentliches Hindernis für biochemische Analysen von Ribosomen, die im Entstehen begriffenen Peptidyl-tRNAs hat das Vorhandensein von anderen Ribosomen in der gleichen Proben, Ribosomen nicht in der Übersetzung der spezifischen mRNA-Sequenz, die analysiert werden beteiligt. Wir entwickelten eine einfache Methode, um zu reinigen, ausschließlich, den Ribosomen, welche die entstehenden Peptidyl-tRNA von Interesse.

Serie: Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the lipidic cubic phase or in meso method. The method has been shown to be quite versatile in that it has been used to solve X-ray crystallographic structures of prokaryotic and eukaryotic proteins, proteins that are monomeric, homo- and hetero-multimeric, chromophore-containing and chromophore-free, and alpha-helical and beta-barrel proteins. Recent successes using in meso crystallization are the human engineered beta2-adrenergic and adenosine A2a G protein-coupled receptors. Protocols are presented for reconstituting the membrane protein into the monoolein-based mesophase, and for setting up crystallizations in the manual mode. Additional steps in the overall process, such as crystal harvesting, are to be addressed in future video articles. The time required to prepare the protein-loaded mesophase and to set up a crystallization plate manually is about one hour.

Herein is described the procedure implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to set up manually crystallization trials of membrane proteins in lipidic mesophases.

Crystallizing Membranproteinen zur Strukturaufklärung mittels Lipidische Mesophasen

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Forschung

Biologie

Evisceration of Mouse Vitreous and Retina for Proteomic Analyses

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is a highly aqueous extracellular matrix overlying the retina where intraocular as well as extraocular proteins accumulate during disease.1-3 Abnormal interactions between vitreous and retina underlie several diseases such as retinal detachment, proliferative diabetic retinopathy, uveitis, and proliferative vitreoretinopathy.1,4 The relative mouse vitreous volume is significantly smaller than the human vitreous (Figure 1), since the mouse lens occupies nearly 75% of its eye.5 This has made biochemical studies of mouse vitreous challenging. In this video article, we present a technique to dissect and isolate the mouse vitreous from the retina, which will allow use of transgenic mouse models to more clearly define the role of this extracellular matrix in the development of vitreoretinal diseases.

The dissection technique illustrates evisceration of the vitreous, retina, and lens from the mouse eye, separation by centrifugation, and characterization with protein assays.

Ausweiden der Maus Glaskörper und Netzhaut für Proteomik-Analysen

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is ...

Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of endocytic origin were first proposed to function as a way for reticulocytes to eradicate the transferrin receptor while maturing into erythrocytes1, and were later named exosomes. Exosomes are formed by inward budding of late endosomes, producing multivesicular bodies (MVBs), and are released into the environment by fusion of the MVBs with the plasma membrane2. Since the first discovery of exosomes, a wide range of cells have been shown to release these vesicles. Exosomes have also been detected in several biological fluids, including plasma, nasal lavage fluid, saliva and breast milk3-6. Furthermore, it has been demonstrated that the content and function of exosomes depends on the originating cell and the conditions under which they are produced. A variety of functions have been demonstrated for exosomes, such as induction of tolerance against allergen7,8, eradication of established tumors in mice9, inhibition and activation of natural killer cells10-12, promotion of differentiation into T regulatory cells13, stimulation of T cell proliferation14 and induction of T cell apoptosis15. Year 2007 we demonstrated that exosomes released from mast cells contain messenger RNA (mRNA) and microRNA (miRNA), and that the RNA can be shuttled from one cell to another via exosomes. In the recipient cells, the mRNA shuttled by exosomes was shown to be translated into protein, suggesting a regulatory function of the transferred RNA16. Further, we have also shown that exosomes derived from cells grown under oxidative stress can induce tolerance against further stress in recipient cells and thus suggest a biological function of the exosomal shuttle RNA17. Cell culture media and biological fluids contain a mixture of vesicles and shed fragments. A high quality isolation method for exosomes, followed by characterization and identification of the exosomes and their content, is therefore crucial to distinguish exosomes from other vesicles and particles. Here, we present a method for the isolation of exosomes from both cell culture medium and body fluids. This isolation method is based on repeated centrifugation and filtration steps, followed by a final ultracentrifugation step in which the exosomes are pelleted. Important methods to identify the exosomes and characterize the exosomal morphology and protein content are highlighted, including electron microscopy, flow cytometry and Western blot. The purification of the total exosomal RNA is based on spin column chromatography and the exosomal RNA yield and size distribution is analyzed using a Bioanalyzer.

This paper demonstrates methods for the isolation, purification and detection of exosomes, as well as techniques for analysis of their molecular content. These methods are adaptable for exosome isolation from both cell culture media and biological fluids, and can beyond analysis of molecular content also be useful in functional studies.

Isolierung und Charakterisierung von RNA-haltigen Exosomen

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of ...

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers. Particularly troublesome is the fact that lysis of cells releases a large number of proteases and nucleases which can degrade ribosomes. Thus, it is important to separate ribosomes from these enzymes as quickly as possible. Unfortunately, conventional differential ultracentrifugation methods leaves ribosomes exposed to these enzymes for unacceptably long periods of time, impacting their structural integrity and functionality. To address this problem, we utilize a chromatographic method using a cysteine charged Sulfolink resin. This simple and rapid application significantly reduces co-purifying proteolytic and nucleolytic activities, producing high yields of intact, highly biochemically active yeast ribosomes. We suggest that this method should also be applicable to mammalian ribosomes. The simplicity of the method, and the enhanced purity and activity of chromatographically purified ribosome represents a significant technical advancement for the study of eukaryotic ribosomes.

Contamination of preparations of eukaryotic ribosomes purified by traditional methods by co-purifying nucleases and proteases negatively impacts on downstream biochemical and structural analyses. A rapid and simple chromatographic purification method is used to solve this problem using yeast ribosomes as a model system.

Chromatographische Reinigung von hoch aktiven Hefe Ribosomen

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers.  ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through macromolecular X-ray crystallography (MX). An essential ingredient of MX is a steady supply of ideally diffraction-quality crystals. The in meso or lipidic cubic phase (LCP) method for crystallizing membrane proteins is one of several methods available for crystallizing membrane proteins. It makes use of a bicontinuous mesophase in which to grow crystals. As a method, it has had some spectacular successes of late and has attracted much attention with many research groups now interested in using it. One of the challenges associated with the method is that the hosting mesophase is extremely viscous and sticky, reminiscent of a thick toothpaste. Thus, dispensing it manually in a reproducible manner in small volumes into crystallization wells requires skill, patience and a steady hand. A protocol for doing just that was developed in the Membrane Structural &amp; Functional Biology (MS&amp;FB) Group1-3. JoVE video articles describing the method are available1,4. 
The manual approach for setting up in meso trials has distinct advantages with specialty applications, such as crystal optimization and derivatization. It does however suffer from being a low throughput method. Here, we demonstrate a protocol for performing in meso crystallization trials robotically. A robot offers the advantages of speed, accuracy, precision, miniaturization and being able to work continuously for extended periods under what could be regarded as hostile conditions such as in the dark, in a reducing atmosphere or at low or high temperatures. An in meso robot, when used properly, can greatly improve the productivity of membrane protein structure and function research by facilitating crystallization which is one of the slow steps in the overall structure determination pipeline. 
In this video article, we demonstrate the use of three commercially available robots that can dispense the viscous and sticky mesophase integral to in meso crystallogenesis. The first robot was developed in the MS&amp;FB Group5,6. The other two have recently become available and are included here for completeness.	
An overview of the protocol covered in this article is presented in Figure 1. All manipulations were performed at room temperature (~20 &deg;C) under ambient conditions.

Herein is described a robotic approach to high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography. Three robots capable of handling the viscous and sticky protein-laden mesophase integral to the method are introduced.

Einsatz eines Roboters für High-Throughput-Kristallisation von Membranproteinen in Lipidische Mesophasen

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at atomic resolution. Presently, there is only one way to capture such information as applied to integral membrane proteins (Figure 1), and the complexes they form, and that method is macromolecular X-ray crystallography (MX). To do MX diffraction quality crystals are needed which, in the case of membrane proteins, do not form readily. A method for crystallizing membrane proteins that involves the use of lipidic mesophases, specifically the cubic and sponge phases1-5, has gained considerable attention of late due to the successes it has had in the G protein-coupled receptor field6-21 (<a href="http://www.mpdb.tcd.ie" target="_blank">www.mpdb.tcd.ie</a>). However, the method, henceforth referred to as the in meso or lipidic cubic phase method, comes with its own technical challenges. These arise, in part, due to the generally viscous and sticky nature of the lipidic mesophase in which the crystals, which are often micro-crystals, grow. Manipulating crystals becomes difficult as a result and particularly so during harvesting22,23. Problems arise too at the step that precedes harvesting which requires that the glass sandwich plates in which the crystals grow (Figure 2)24,25 are opened to expose the mesophase bolus, and the crystals therein, for harvesting, cryo-cooling and eventual X-ray diffraction data collection.
The cubic and sponge mesophase variants (Figure 3) from which crystals must be harvested have profoundly different rheologies4,26. The cubic phase is viscous and sticky akin to a thick toothpaste. By contrast, the sponge phase is more fluid with a distinct tendency to flow. Accordingly, different approaches for opening crystallization wells containing crystals growing in the cubic and the sponge phase are called for as indeed different methods are required for harvesting crystals from the two mesophase types. Protocols for doing just that have been refined and implemented in the Membrane Structural and Functional Biology (MS&amp;FB) Group, and are described in detail in this JoVE article (Figure 4). Examples are given of situations where crystals are successfully harvested and cryo-cooled. We also provide examples of cases where problems arise that lead to the irretrievable loss of crystals and describe how these problems can be avoided. In this article the Viewer is provided with step-by-step instructions for opening glass sandwich crystallization wells, for harvesting and for cryo-cooling crystals of membrane proteins growing in cubic and in sponge phases.

Herein is described procedures implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to harvest and cryo-cool membrane protein crystals grown in lipidic cubic and sponge phases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography.

Ernte-und Cryo-Kühlung Kristalle von Membranproteinen in Lipidische Mesophasen zur Strukturaufklärung von Makromolekulare Kristallographie Grown

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of heart disease. In particular, the ability to study ion homeostasis, ion channel function, cellular excitability and excitation-contraction coupling and their alterations in diseased conditions and by disease-causing mutations have led to significant insights into cardiac diseases. Furthermore, the lack of an adequate immortalized cell line to mimic adult CMs, and the limitations of neonatal CMs (which lack many of the structural and functional biomechanics characteristic of adult CMs) in culture have hampered our understanding of the complex interplay between signaling pathways, ion channels and contractile properties in the adult heart strengthening the importance of studying adult isolated cardiomyocytes. Here, we present methods for the isolation, culture, manipulation of gene expression by adenoviral-expressed proteins, and subsequent functional analysis of cardiomyocytes from the adult mouse. The use of these techniques will help to develop mechanistic insight into signaling pathways that regulate cellular excitability, Ca2+ dynamics and contractility and provide a much more physiologically relevant characterization of cardiovascular disease.

Here we describe the isolation of adult mouse cardiomyoctyes using a Langendorff perfusion system. The resulting cells are Ca2+-tolerant, electrically quiescent and can be cultured and transfected with adeno- or lentiviruses to manipulate gene expression. Their functionality can also be analyzed using the MMSYS system and patch clamp techniques.

Isolierung, Kultur, und funktionelle Charakterisierung der erwachsenen Maus Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined lipid composition. We are studying the lipid-dependent gating effects in a prototype voltage-gated potassium (Kv) channel, and have worked out detailed procedures to reconstitute the channels into different membrane systems. Our reconstitution procedures take consideration of both detergent-induced fusion of vesicles and the fusion of protein/detergent micelles with the lipid/detergent mixed micelles as well as the importance of reaching an equilibrium distribution of lipids among the protein/detergent/lipid and the detergent/lipid mixed micelles. Our data suggested that the insertion of the channels in the lipid vesicles is relatively random in orientations, and the reconstitution efficiency is so high that no detectable protein aggregates were seen in fractionation experiments. We have utilized the reconstituted channels to determine the conformational states of the channels in different lipids, record electrical activities of a small number of channels incorporated in planar lipid bilayers, screen for conformation-specific ligands from a phage-displayed peptide library, and support the growth of 2D crystals of the channels in membranes. The reconstitution procedures described here may be adapted for studying other membrane proteins in lipid bilayers, especially for the investigation of the lipid effects on the eukaryotic voltage-gated ion channels.

Procedures for complete reconstitution of a prototype voltage-gated potassium channel into lipid membranes are described. The reconstituted channels are suitable for biochemical assays, electrical recordings, ligand screening and electron crystallographic studies. These methods may have general applications to the structural and functional studies of other membrane proteins.

Rekonstitution eines Kv-Kanal in Lipidmembranen für Strukturelle und Funktionelle Studien

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of cell heath due to their role in both cell metabolism and energy production as well as control of apoptosis. Therefore, direct evaluation of isolated mitochondria and mitochondrial perturbation offers the ability to determine if organelle-specific (dys)function is occurring. The methods described in this protocol include isolation of intact, functional mitochondria from HEK cultured cells and mouse liver and spinal cord, but can be easily adapted for use with other cultured cells or animal tissues. Mitochondrial function assessed by TMRE and the use of common mitochondrial uncouplers and inhibitors in conjunction with a fluorescent plate reader allow this protocol not only to be versatile and accessible to most research laboratories, but also offers high throughput.

Comparison of mitochondrial membrane potential between samples yields valuable information about cellular status. Detailed steps for isolating mitochondria and assessing response to inhibitors and uncouplers using fluorescence are described. The method and utility of this protocol are illustrated by use of a cell culture and animal model of cellular stress.

Isolierung und funktionale Analyse von Mitochondrien aus kultivierten Zellen und Maus-Gewebe

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

A Rapid, Scalable Method for the Isolation, Functional Study, and Analysis of Cell-derived Extracellular Matrix

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and pathological processes. However, the isolation of ECM, from tissues or cell culture, is complicated by the insoluble and cross-linked nature of the assembled ECM and by the potential contamination of ECM extracts with cell surface and intracellular proteins. Here, we describe a method for use with cultured cells that is rapid and reliably removes cells to isolate a cell-derived ECM for downstream experimentation.
Through use of this method, the isolated ECM and its components can be visualized by in situ immunofluorescence microscopy. The dynamics of specific ECM proteins can be tracked by tracing the deposition of a tagged protein using fluorescence microscopy, both before and after the removal of cells. Alternatively, the isolated ECM can be extracted for biochemical analysis, such as sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoblotting. At larger scales, a full proteomics analysis of the isolated ECM by mass spectrometry can be conducted. By conducting ECM isolation under sterile conditions, sterile ECM layers can be obtained for functional or phenotypic studies with any cell of interest. The method can be applied to any adherent cell type, is relatively easy to perform, and can be linked to a wide repertoire of experimental designs.

The extracellular matrix plays a major role in defining the microenvironment of cells and in modulating cell behavior and phenotype. We describe a rapid method for the isolation of cell-derived extracellular matrix, which can be adapted to different scales for microscopic, biochemical, proteomic, or functional studies.