Länglich und polarisiert der Amelogenin-sezernierende Ameloblast in Kultur. Dies ist auch das erste Protokoll für das Züchten von Ameloblastenzellen in Schwerelosigkeit. Das Wachstum von Ameloblasten in der Kultur war eine der größten Herausforderungen im Emailbereich.
Und für uns ist es das erste Mal, dass wir dieses Markenzeichen in der Emailforschung erreicht haben. Dieses Modell kann verwendet werden, um die Biologie von Ameloblastenzellen zu verstehen. Dieses Modell wird von Dr. Mirali Pandya vorgeführt.
Beginnen Sie, indem Sie das gesammelte Gewebe von sechstägigen postnatalen Mäusen unter das Dissektionsmikroskop und die sezierten Zervixschleifen legen. Richten Sie einen Bioreaktor ein, indem Sie die sterilen Ventile an den Spritzenöffnungen befestigen. Fügen Sie beide Zellen, die Zervixschleife und die Zahnpulpa, zusammen mit einem beschichteten Gerüst in den Bioreaktor und füllen Sie das Bioreaktorgefäß mit 10 Milliliter Keratinozyten-SFM-Medien, ergänzt mit Wachstumsfaktoren und extrazellulären Matrixproteinen.
Schließen und straffen Sie die Kappe des Füllanschlusses des Bioreaktorbehälters und öffnen Sie dann die sterilen Ventile. Verwenden Sie zwei sterile Drei-Milliliter-Spritzen für einen Medienwechsel. Füllen Sie dazu eine Spritze mit dem frischen Medium und lassen Sie die andere Spritze leer.
Öffnen Sie beide Spritzenventile und manövrieren Sie die Blasen vorsichtig in Richtung der leeren Spritzenöffnung. Sobald das frische Medium aus der vollen Spritze vorsichtig in das Gefäß injiziert wurde, entfernen Sie alle Blasen durch den leeren Spritzenanschluss. Schließen Sie die Spritzenöffnungen mit Kappen.
Befestigen Sie jedes Gefäß an der Rotatorenbasis. Schalten Sie das Gerät ein und stellen Sie die Geschwindigkeit auf 10,1 Umdrehungen pro Minute ein. Stellen Sie die Geschwindigkeit ein, um sicherzustellen, dass die Gerüste aufgehängt sind und die Behälterwand nicht berühren.
Für den Medienwechsel alle 24 Stunden stellen Sie die Gefäße aufrecht, um sicherzustellen, dass sich die Zellen am Boden absetzen. Öffnen Sie die Spritzenöffnungen, um die sterilen Spritzen an die Anschlüsse anzuschließen. Saugen Sie 75% des nährstoffarmen Mediums ab und injizieren Sie das frische Medium durch den anderen Port, wie zuvor gezeigt.
Die Makrographen von Graphengerüst und Kollagengerüst sind hier dargestellt. Das Graphengerüst hatte eine parallele Anordnung von Oberflächenprägungen, während das Kollagengerüst die poröse Struktur aufwies. Ein skelettierter Mausunterkiefer wurde seziert und der distale größte Teil des unteren Mausschneidezahns wurde freigelegt.
Die genaue Position der resezierten zervikalen Schleife ist im sechstägigen postnatalen Mausschneidezahn abgegrenzt, während eine ähnliche Region in einem erwachsenen skelettierten Mausunterkiefer als Referenz angegeben wird. Die Hämimandibeln bestanden aus drei Unterkiefermolaren und einem ständig wachsenden Schneidezahn, während die zervikale Schleifenzellnische eine vielfältige Zellpopulation enthielt, die für die Schmelzbildung notwendig war. Die erfolgreiche Differenzierung der Zervixschleifenzellen in einer maßgeschneiderten Mikroumgebung führte zur Bildung von Ameloblasten mit einer typischen Eigenschaft polarisierter Zellen mit dem Kern an einem Ende und langen zellulären Prozessen am anderen Ende.
Die Kultur von Zellen in Medien allein ohne Wachstumsfaktoren und Gerüstbeschichtung führte zu zervikalen Schleifenzellen, die wichtige Schmelzproteine absonderten, sich aber nicht verlängerten oder polarisierten. Die Galanin-beschichtete Gerüstgruppe zeigte eine signifikant höhere Proliferationsrate im Vergleich zur Kontrollgruppe mit unbeschichteten Gerüsten. Die von E15-Mäusen geernteten Lungengewebesegmente wurden erfolgreich für 10 Tage in einer 3D-Mikrogravitationsumgebung im Bioreaktor kultiviert.
Die Zugabe von Interleukin-6 zum Kulturmedium führte zu entzündungsassoziierten Veränderungen in der Alveolarmorphologie, ähnlich denen, die in vivo beobachtet wurden. In der Einleitung habe ich Ihnen erzählt, wie schwierig es für das Emaille-Team war, ein Ameloblasten-Zellkulturmodell zu entwickeln. Nun haben wir uns dieser Herausforderung mit einem hochinnovativen Verfahren gestellt, das sich auf zwei Aspekte konzentriert: Schwamm-Kollagengerüst und auch die Verwendung von Matrix zur Differenzierung der Ameloblastenzellen.
Zusammen führten diese beiden Innovationen zur Polarisation und zum Wachstum von Ameloblasten-ähnlichen Zellen in 3D-Kultur. Diese 3D-kultivierten Zellen sind ein wunderbares Modell, um die Ameloblastenbiologie zu verstehen. Und um diese Biologie zu verstehen, können wir eine Vielzahl von Techniken verwenden, darunter Elektronenmikroskopie, Proteomik und Genomik.
Ameloblasten sind fantastische Zellen. Ja, sie haben die Fähigkeit, prismatischen Zahnschmelz abzusondern. Dieses Bioreaktormodell versetzt uns nun in die Lage zu verstehen, wie Ameloblasten Matrix absondern und Apatitmineralien absondern, um prismatischen Zahnschmelz zu züchten.
