Ziel dieser Methode ist es, die Eierstöcke der Planarien Schmidtea mediterranea für die zelluläre und subzelluläre Analyse der Eizellbiologie mit TEM oder Antikörperfärbung zu präparieren. Dieses Protokoll verwendet einen kurzen Fixationsschritt, um die Lokalisierung und Dissektion von Planarien-Eierstöcken zu erleichtern, was eine Bildtiefe und -qualität bietet, die bisher nicht zugänglich waren. Die größte Herausforderung für jemanden, der diese Technik noch nie zuvor durchgeführt hat, wird darin bestehen, die Eierstöcke nach der Fixation zu lokalisieren.
Es ist hilfreich, sich vor dem Experiment mit der Anatomie der sexuellen Planarien vertraut zu machen. Bereiten Sie sich auf das Experiment vor, indem Sie Geschlechtsplanarien zweimal pro Woche mit Bio-Leberpaste füttern, um die Geschlechtsreife zu erreichen. Behandeln Sie geschlechtsreife Würmer mit 5%N-Acetyl-L-Cystein oder NAC in einer Schale bei Raumtemperatur für fünf Minuten.
Ersetzen Sie NAC durch 10 Milliliter frisch zubereitetes 4%iges Paraformaldehyd und fixieren Sie die Würmer eine Stunde lang bei Raumtemperatur unter gelegentlichem Schütteln. Beginnen Sie die Dissektion 10 Minuten nach Zugabe von 4%Paraformaldehyd, während die Würmer fixiert werden. Beobachten Sie die epitheliale Pigmentierung, um die ventralen Nervenstränge zu lokalisieren, die als zwei Linien mit hellerer Pigmentierung erscheinen, die von den vorderen Kopfganglien zum Schwanz verlaufen.
Lokalisieren Sie die mutmaßlichen Eierstöcke, indem Sie die Pigmentierung beobachten und ihre Position bestätigen. Führen Sie mit zwei chirurgischen Messern Schnitte hinter und vor den Eierstöcken durch, um die vorderen und hinteren Wurmfragmente vollständig zu entfernen. Verwenden Sie ein Messer, um die Wurm zu verankern, und das andere Messer für das Sezieren.
Reinige das Messer, mit dem du die Schnitte gemacht hast. Um die beiden Eierstöcke zu trennen, schneiden Sie die Mittellinie des Eierstockfragments ein und drehen Sie das Fragment dann mit der Bauchseite nach unten. Verwenden Sie zwei Paar spitze Pinzetten vom Typ 5-SA, um das Rückengewebe abzuziehen und den Darm freizulegen.
Entfernen Sie vorsichtig die Darmäste, die über dem Bauchgewebe sitzen, mit der Spitze der Pinzette oder einer weichen Bürste, um den Eierstock freizulegen. Entferne das umgebende Gewebe, um den Eierstock herauszunehmen. Nehmen Sie die Eierstöcke heraus und geben Sie sie in eine 1,5-Milliliter-Tube, um sie mit 1 Milliliter PBS zu waschen.
Die dorsalen und ventralen Pigmentmuster wurden verwendet, um die Position der Eierstöcke zu lokalisieren. Überschüssiges Gewebe wurde Schritt für Schritt entfernt. Sobald der Eierstock freigelegt war, wurde das umgebende Gewebe abgeschnitten.
Eierstöcke mit mehreren somatischen Zelltypen wurden sowohl für die Ultrastrukturanalyse als auch für die Immunfluoreszenzfärbung verwendet. Die präparierten Eierstöcke ermöglichen eine qualitativ hochwertige Bildgebung der zellulären und subzellulären Anatomie der Eizellen. Dieses Verfahren soll RNA-Interferenzexperimente ermöglichen, um molekulare Regulationen der Eizellbiologie zu untersuchen.
Diese Technik führte zur Entdeckung eines neuen Phänomens in den Eizellen von Plattwürmern, dass die Kernhülle in Vesikel zerfällt, die Kernproteine einkapseln, anstatt intakt zu bleiben, was als geschlossene Mitose bezeichnet wird, oder in Stücke zerbricht, auch bekannt als offene Mitose.
