Die Autoren danken René Scriwanek für die Unterstützung bei der Vorbereitung der Abbildung. FR wird von ECHO (700.59.003) unterstützt, ALW-Open-Programm (821.02.017 und 822.02.014), DFG-NWO Zusammenarbeit (DN82-303) und ZonMW VICI (016.130.606) Zuschüsse.

1. Spheroplastenpräparation <ol><li> Inkubieren der Hefe über Nacht bei 30 ° C in 10 ml des entsprechenden Mediums durch die Gestaltung des Experiments bestimmt. </li><li> Am Tag danach Messen der optischen Dichte der Kultur bei 600 nm (OD 600) unter Verwendung eines Photometers, verdünnt Zellen im gleichen Kulturmedium bis zu einer OD 600 von 0,2-0,4 wachsen sie zu einem exponentiellen Wachstumsphase, wenn die Konstruktion der Experiment erfordert einen anderen Zustand. Zellen in der exponentiellen Phase, wenn die Kultur eine OD 600 von 1-2. </li><li> Sammeln 10 OD 600 Äquivalente Zellen durch Zentrifugation bei 3.500 × g für 5 min in ein 50 ml Röhrchen. Nach der Zentrifugation den Überstand verwerfen. </li><li> Zellpellet in 5 ml 100 mM PIPES (pH 9,6), 10 mM Dithiothreitol bei 30 ° C für 10 min inkubiert. </li><li> Sammeln wieder die Zellen durch Zentrifugation bei 3.500 × g für 5 min. Überstand verwerfen. </li><li> Resuspendieren der Zellen in 5 ml Medium (von der Gestaltung des Experiments bestimmt), enthaltend 1 M Sorbit und 5 mg lytischen Enzym, und Inkubieren der Mischung bei 30 ° C unter leichtem Schütteln für 30 min. </li><li> Zentrifugieren der Zellsuspension bei 300 × g für 5 min, um die Pelletfraktion, die den Sphäroplasten entspricht sammeln. Überstand verwerfen. </li><li> Resuspendieren der Sphäroplasten in 960 ul eiskaltem Medium (Medium, durch das Design des Experiments bestimmt), enthaltend 1 M Sorbit und überführt die Mischung in eine eiskalte 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen. </li></ol> 2. Nanogold-Aufnahme <ol><li> Mit einer Pipette vorsichtig mischen die Sphäroplast mit 4 nmol von positiv geladenen Teilchen in Nanogold 40 ul Wasser resuspendiert. Das endgültige Volumen der Mischung zu 1 ml betragen. </li><li> Legen Sie die erhaltene Zellsuspension auf Eis für 15 min. </li><li> Übertragen Sie die Suspension bei Raumtemperatur inkubiert und es für die erforderliche Zeit, um Nanogold Internalisierung per E erlaubenndocytosis. HINWEIS: Ein 5 Minuten-Aufnahme wird in erster Linie für die Etikettierung von endozytischen Vesikel und frühen Endosomen führen, während eine 15 min-Aufnahme wird es ermöglichen, das gesamte System Endosomen (frühe und späte Endosomen) zu markieren. Längere Inkubationszeiten (über 30 min) wird auch erlauben, die Vakuole zu beschriften. HINWEIS: Pulse-Chase-Markierungsexperimente können mit dieser Methode nicht durchgeführt werden. Deshalb, wenn die Kennzeichnung für die Analyse von LE, Nanogold wird auch auf der Uhr und INEE gefunden werden. </li></ol> 3. Fixierung und Schnitt <ol><li> Stoppen des Nanogold-Aufnahme durch Zugabe von 1 ml doppelt konzentrierten Fixierlösung [4% Paraformaldehyd (PFA), 0,4% Glutaraldehyd (GA) in 0,1 M PHEM-Puffer (20 mM PIPES, 50 mM HEPES, pH 6,9, 20 mM EGTA, 4 mM MgCl 2)], enthaltend 1 M Sorbitol zu der Zellsuspension. Hielt das Rohr bei Raumtemperatur. </li><li> Während 30 min vorsichtig manuell invertieren die micocentrifuge Rohre mehrmals (dies wird erlauben, die in Spheroplasten haltenSuspension) und dann zweimal zentrifugieren bei 1.700 g für 25 Sekunden. </li><li> Ersetzen Sie das Fixiermittel durch Verwerfen des Überstandes und durch Zugabe von 1 ml frischem Normfestigkeit Fixiermittel (2% PFA, 0,2% GA in 0,1 M PHEM Puffer) mit 1 M Sorbitol und Inkubation für 2 Stunden bei Raumtemperatur auf einem langsam drehenden Rades. </li><li> Verarbeiten Sie die Zellen, die für Kryo-Schnitte wie zuvor 6 beschrieben. HINWEIS: Für die Aufnahme Nanogold und Silber Verbesserung Verfahren hat die in der angegebenen Protokoll beschrieben periodische Säurebehandlung nicht durchgeführt werden. Die Periodsäure-Behandlung ist besser zu permeabilisieren die Zellwand 26, aber diese Struktur bei der Erzeugung von Sphäroplasten eliminiert. </li><li> Cut 50 nm dünne Gefrierschnitte bei -120 ° C mit trockenen Diamantmesser mit Hilfe eines Ultramikrotoms UCT wie zuvor beschrieben, 8 und legen Sie sie auf Formvar Kohlenstoff beschichtet 50 Maschen Nickelgittern. </li></ol> 4. Silber Erweiterung für Nanogold Particle Visualisierung HINWEIS: Das Verfahren, um die Reaktionsgemischen herzustellen, ist im Grunde die ein vom Hersteller angegeben. Praktische Anpassungen dieses Protokoll verwenden, macht der Silberverstärkung Verfahren effektiv und zuverlässig auf Gefrierschnitten. <ol><li> Entfernen Sie die Silberverstärkung Kit aus dem Gefrierschrank und tauen sie in einem 37 ° C Inkubator oder Wasserbad. Wenn aufgetaut, legen Sie das Kit in einer 24 ° C-Inkubator in einen dunklen Raum bis zur Verwendung platziert (siehe 4.7). </li><li> Legen Sie die Heizplatte in den dunklen Raum und warm es auf die Endtemperatur von 24 ° C </li><li> Decken Sie die Oberseite der Heizplatte mit dem Oberflächenschutz, glänzenden Seite nach oben, und befestigen Sie sie mit einem Band. </li><li> Setzen Sie den Parafilm auf der Benchkote und markieren die Ränder mit einem schwarzen Marker, um die Parafilm Kanten in der Dunkelheit zu sehen. </li><li> Kleben Sie ein Thermometer auf der Oberseite des Benchkote, um die Temperatur der Heizplatte überwachen. Nach und nach die Temperatur einstellen, wenn nicht 24 ° C. </li><li> PlaCE Die 50-ml-Tube mit doppelt destilliertem Wasser und Silberverstärkung Satz im Inneren. </li><li> Füllen Sie die kleinen Petrischalen mit doppelt destilliertem Wasser, bei 37 ° C vorgewärmt Legen Sie die Netze im Wasser, Probenseite nach unten, für 30 min. </li><li> Wiederholen Sie diesen Schritt 4.7 noch einmal. </li><li> Übertragen Sie die Netze in der Aufbewahrungsbox und bringen sie in den dunklen Raum. </li><li> Spülen Sie die Gitter wieder, indem man sie (mit der Probenseite nach unten) auf einige Tropfen doppelt destilliertem Wasser bei 24 ° C auf dem Parafilm gelegt, die auf der Wärmeplatte fixiert wurde. </li><li> Stellen Sie sicher, dass 9 weitere doppelt destilliertem Wasser Tropfen bereit sind, auf die Parafilm, zum Spülen nach der Silberverstärkung Reaktion. </li><li> Schalten Sie das Licht aus, und stellen Sie sicher, dass alle Lichter ausgeschaltet sind. Schalten Sie das rote Licht auf. </li><li> Nehmen Sie die Lösungen der Silberverstärkung Kit von der 24 ° C-Inkubator A und B. </li><li> Setzen ersten 6 Tropfen der Lösung A und dann 6 Tropfen der B-Lösung in einem 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen, und gut mischen mit einem Glas Pasteur-Pipette, um Blasen zu vermeiden, zu machen. Die Lösung ist recht dick und manuell mit einer Pipette, bevor sie schließlich Vortexen es kurz gemischt werden, die es hat. </li><li> Setzen Sie die Lösungen A und B wieder in der 24 ° C-Inkubator und nehmen Sie die C-Lösung. </li><li> 6 Tropfen der Lösung C in die A / B-Gemisch. Dann mischen Sie wieder zuerst mit einer Pasteur-Pipette und dann durch Wirbeln, verhindern, dass Blasen. </li><li> Verwenden Sie sofort die endgültige Mischung, indem Tropfen (~ 20 ul / Drop) auf dem Parafilm. </li><li> Mit einem sauberen, anti-magnetischen Pinzette, legen Sie die Gitter auf die Mischung (zB., Silber Verbesserung Reaktion) für 6 bis 15 min je nach der Erweiterung (zB. Größe der Goldpartikel) wollte zu erhalten. </li><li> Entfernen Sie die Gitter aus der Mischung und leiten sie an die Spitze der doppelt destilliertem Wasser sinkt bei 24 ° C wäscht. Verwenden Sie zuerst in schnell nacheinander und dann 6 Tropfen 3 Tropfen mit 7 min Inkubationszeit pro Tropfen, Bevor die Lichter an. </li><li> Fahren Sie mit dem nächsten Schritt entweder Immuno-Gold-Kennzeichnung oder Membranfärbung 27, um das Ergebnis für einen EM-Untersuchung zu visualisieren. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Immuno-Elektronenmikroskopie ist eine Technik, kombiniert Lokalisierung von Proteinen mit der ultra Auflösung der Träger und Organellen, in denen diese Proteine ​​befinden können. Dies ist besonders wichtig, wenn die Untersuchung der Hefe endosomalen System, weil seine Fächer erscheinen als punktförmigen Strukturen in der Fluoreszenzmikroskopie. Es ist daher schwierig, sie zu unterscheiden. Aus diesem Grund ist der Einsatz einer Sonde nachweisbar EM und Eingabe der endocytischen Weg in einer zeitabhängigen Wei...

Die endosomalen System ist ein Hauptmembransortiervorrichtung, die mehrere entscheidende Rollen einschließlich Mobilhandel lysosomalen Enzyms Sortier Rezeptoren und das Recycling von Plasmamembran (PM)-Rezeptoren spielt 1,2. Endosomen in drei Kammern, nämlich unterteilt. die frühen Endosomen (EE), die späten Endosomen (LE) und die Recycling-Endosomen. Diese Einstufung basiert auf der Zeit, die für die Endozytose Material, um sie zu erreichen, auf die bestimmte Markerproteine ​​und über deren Morphologie. Membranen, dh Protein-und Lipiddoppelschichten, von der PM verinnerlicht kann entweder über Endosomen zu den Lysosomen zum Abbau geliefert werden oder zurückgeführt werden. Membranen werden auch Endosomen vom Golgi transportiert und in ähnlicher Weise entweder weiterhin Lysosomen oder zurück zu den Golgi abgerufen werden. Weiterhin können Proteine ​​in luminalen Vesikel angeh nach innen von der endosomalen Grenzmembran, ein Verfahren, das zur Bildung von führt sortierteine Unterkategorie der LE, die multivesikulären Körpern. Die Hefe endosomalen System ist relativ weniger komplex als die der Hoch eukaryotischen Zellen. Hefe Endosomen in EE und LE unterteilt. Im Gegensatz zu Säugerzellen sie Recycling Endosomen als auch gewebespezifische Lysosom bedingten Organellen enthalten. Folglich haben sie ein weniger komplexes Netzwerk von Handelsrouten endosomalen 3,4. Daher Hefe vertreten und stellt noch immer eine vorteilhafte experimentelle System, einige der zugrunde liegenden Prinzipien Membran Verkehr in der endosomalen System zu studieren. Dieser Vorteil wird durch die Tatsache, dass zahlreiche Gene in den Endosomen Wegen beteiligt wurden zunächst mit genetischen Screens in Hefe isoliert 5 hervorgehoben. Während die Hefe endosomalen System in Wildtyp-und mutierten Zellen wurde ausgiebig mit biochemischen und Fluoreszenzmikroskopie Ansätze untersucht, hat ihre Untersuchung auf ultrastruktureller Ebene erst seitminimal. Morphologische Analysen sind in der Hefe besonders relevant, weil die meisten der endosomalen Organellen werden als punktförmigen Strukturen, die durch Fluoreszenz-Mikroskopie, die ihre zweifelsfreie Ermittlung schwierig machen 6 nachgewiesen. Leider nur eine begrenzte Anzahl von Antiseren erkennen Hefe endosomalen Protein-Marker in immunelektronenmikroskopische Arbeits (IEM) Zubereitungen 7-10. Bei einigen Proteinen wurde dieses Problem durch die Markierung des endogenen Gens von Interesse, und die Verwendung eines Antikörper, der das Etikett, um es zu erfassen, 7,11,12 umgangen. Oft jedoch sind Proteine ​​nachweisbar durch IEM wegen ihrer niedrigen Expressionsniveaus. Die Überexpression ist keine Lösung, weil dieser Ansatz falsch Lokalisierungen und / oder Änderungen in den Organellen-Morphologie / Funktionen zu induzieren. So ist die Beschriftung der endozytischen Fächer mit einer Sonde durch Elektronenmikroskopie EM nachweisbar ist eine wirksame Option. Dies ist eine optimale Lösung, insbesondere wenn die probe ist die Eingabe der endozytischen Route in einem zeitabhängig, was zu wissen, wenn es eine spezifische Organelle 6 kennzeichnen können. Die Aufnahme von positiv geladenen Nanogold durch Hefe Spheroplasten (Hefe, wo die Zellwand enzymatisch entfernt also.) Erfolgreich verwendet worden, um die Hefe zu identifizieren endosomalen Fächer 10. Diese Partikel stark an die negativ geladenen Lipide, aus denen die biologischen Membranen zu binden. Somit werden die positiv geladenen Nanogold assoziiert mit dem PM, dringt in die Zelle durch Endocytose und gelangt durch die EE und LE vor Erreichen der Vakuole. Diese kleinen Goldpartikel, jedoch nicht über eine geeignete Größe von EM gesehen werden. Um sie sichtbar zu machen, kann ihre Größe durch chemische Reaktionen, die zur Abscheidung von Silber oder Gold auf der Goldsonde 13-15 führen vergrößert werden. Wir haben uns entwickelt und erfolgreich angewandt eine IEM-Ansatz auf der Basis der Tokuyasu Methode, um subzelluläre durchführenLokalisierungsstudien 8,16. Diese Methode ermöglicht die Durchführung Immunogoldmarkierung auf Hefe Zubereitungen mit einem hervorragenden Auflösung der Morphologie 8,17-24. Wir haben auch eine Kombination dieser Verfahren IEM Protokoll mit der Nano-Gold-Markierung des Hefe endosomalen System Fächer 6. Mit diesem Ansatz haben wir morphologisch charakterisiert verschiedenen Unterklassen der Endosomen und ultrastrukturell untersucht Mutanten mit einem Defekt endosomalen Handel 6,25. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass diese Nanogold-Markierung kann mit Immun Markierungen bietet die Möglichkeit, die Verteilung eines Proteins von Interesse in den verschiedenen Subpopulationen Endosom erkunden kombiniert werden. Hier präsentieren wir, wie die Kennzeichnung der Hefe endosomalen System mit positiv geladenen Nanogold praktisch durchgeführt.

<table><tbody><tr><td>PIPES (piperazin-1,4-bis (2-ethansulfensaure)</td><td>Merck, Darmstadt, Germany</td><td>1,102,200,250</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Merck, Darmstadt, Germany</td><td>391,340</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma, St louis, MO</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;middot;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Merck, Darmstadt, Germany</td><td>1,058,330,250</td><td></td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol</td><td>Sigma, St louis, MO</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Sorbitol</td><td>Sigma, St louis, MO</td><td>S1876</td><td></td></tr><tr><td>Positively charged Nanogold</td><td>Nanoprobes, Yaphank, NY</td><td>2022</td><td>store at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>HQ-silver&amp;trade; enhancement kit</td><td>Nanoprobes, Yaphank, NY</td><td>2012</td><td>store at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Sigma, St louis, MO</td><td>441244</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde 8% EM grade</td><td>Polyscience, Inc., Warrington, PA</td><td>216</td><td>store at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Lytic enzyme</td><td>MP Biomedicals, Santa Ana, CA</td><td>153526</td><td>store at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Sigma, St louis, MO</td><td>P7793</td><td></td></tr><tr><td>50 meshes nickel grids&amp;nbsp;</td><td>Agar Scientific, Stansted, United Kingdom</td><td>G209N</td><td></td></tr><tr><td>Cryo-immuno diamond knife 35&amp;deg;</td><td>Diatome AG, Biel, Switzerland</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>UCT ultramicrotome&amp;nbsp;</td><td>Leica, Solms, Germany</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>Formvar 15/95 resine</td><td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA</td><td>15800</td><td></td></tr><tr><td>50 meshes nickel grids&amp;nbsp;</td><td>Agar Scientific, Stansted, United Kingdom</td><td>AGG2050N</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma, St louis, MO</td><td>P7793</td><td></td></tr><tr><td>Grids storage box</td><td>Leica, Solms, Germany</td><td>162-50</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 100 mm x 15 mm Petri dish</td><td>Corning, Corning, NY</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur capillary pipettes 150 mm</td><td>Van Bruggen Glas, Rotterdam, The Netherlands</td><td>10216234</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml microcentrifuge&amp;nbsp;</td><td>Sarstedt, N&amp;uuml;mbrecht, Germany</td><td>72690001</td><td></td></tr><tr><td>50 ml tube</td><td>Bio-one, Alphen aan den Rijn, The Netherlands</td><td>210296</td><td></td></tr><tr><td>Benchkote surface protector</td><td>Whatman, Maidstone, United Kingdom&amp;nbsp;</td><td>1159201</td><td></td></tr></tbody></table>

nanogold labeling of the yeast endosomal system for ultrastructural analyses

Endosomen sind einer der Hauptmembransortier Checkpoints in eukaryotischen Zellen, und sie Verwertung oder Vernichtung von Proteinen regulieren hauptsächlich von der Plasmamembran und Golgi. Als Ergebnis der endosomalen System spielt eine zentrale Rolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase Zelle, und Mutationen in Genen zu diesem Netzwerk von Organellen durch Vesikeltransport miteinander verbunden gehören, verursachen schwere Erkrankungen wie Krebs und neurobiologischen Erkrankungen. Es ist daher von größter Bedeutung, um die Mechanismen der Biogenese und der Organisation des endosomalen System zugrunde liegen. Die Hefe Saccharomyces cerevisiae ist in dieser Aufgabe entscheidend. Um spezifisch zu markieren und zu analysieren, auf ultrastruktureller Ebene die endosomalen System dieser Modellorganismus, hier präsentieren wir eine detaillierte Protokoll für die positiv geladenen Nanogold-Aufnahme durch Spheroplasten gefolgt von der Visualisierung dieser Teilchen durch eine Silberverstärkung Reaktion. Dieses Verfahren ist auch ein wertvoller zul für die morphologische Untersuchung von Mutanten mit Defekten in endosomalen Handel. Darüber hinaus ist es nicht nur anwendbar für ultrastrukturelle Untersuchung kann aber auch mit Immun Markierungen zur Proteinlokalisierung Untersuchungen kombiniert werden.

Gemäß der vorgestellten Protokoll kann die Morphologie der Hefe Endosom System zugänglich sein durch Übertragungs EM. Fig. 1 zeigt verschiedene Arten von Endosomen, die erreicht haben und deshalb mit Nanogold markierten. Das Silber-Nanogold verbessert deutlich als Elektronen-dichten Teilchen gesehen werden. Die für die Silberverstärkung Reaktion etabliert optimalen Einstellungen können mit Goldpartikeln in einer homogenen Größenbereich zwischen 5 und 15 nm, die nicht mit der Ultrastruktur der H...

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Nanogold Labeling of the Yeast Endosomal System for Ultrastructural Analyses

Hefe, Saccharomyces cerevisiae, war ein wichtiger Modellorganismus zu identifizieren und zu untersuchen Gene Regelung der Biogenese und Funktion des endosomalen Systems. Hier präsentieren wir eine detaillierte Protokoll für die spezifische Markierung von den Endosomen für ultrastrukturelle Studien.

Nanogold Markierung der Hefe Endosomale System für Ultrastrukturanalysen

Endosomes are one of the major membrane sorting checkpoints in eukaryotic cells and they regulate recycling or destruction of proteins mostly from the ...

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Research

JoVE Journal

Biology

10.2K Aufrufe.  University Medical Center Utrecht.  Hefe, Saccharomyces cerevisiae, war ein wichtiger Modellorganismus zu identifizieren und zu untersuchen Gene Regelung der Biogenese und Funktion des endosomalen Systems. Hier präsentieren wir eine detaillierte Protokoll für die spezifische Markierung von den Endosomen für ultrastrukturelle Studien. 

Serie: Nanogold Labeling of the Yeast Endosomal System for Ultrastructural Analyses

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help achieve an comprehensive understanding of molecular pathways. In Saccharomyces cerevisiae, with the development of the non-essential gene deletion array, we can globally study the morphology of different organelles like the endoplasmic reticulum (ER) and the mitochondria using GFP (or variant)-markers in different gene backgrounds. However, incorporating GFP markers in each single mutant individually is a labor-intensive process. Here, we describe a procedure that is routinely used in our laboratory. By using a robotic system to handle high-density yeast arrays and drug selection techniques, we can significantly shorten the time required and improve reproducibility. In brief, we cross a GFP-tagged mitochondrial marker (Apc1-GFP) to a high-density array of 4,672 nonessential gene deletion mutants by robotic replica pinning.  Through diploid selection, sporulation, germination and dual marker selection, we recover both alleles. As a result, each haploid single mutant contains Apc1-GFP incorporated at its genomic locus. Now, we can study the morphology of mitochondria in all non-essential mutant background. Using this high-throughput approach, we can conveniently study and delineate the pathways and genes involved in the inheritance and the formation of organelles in a genome-wide setting.

GFP-fusion proteins are widely used to visualize organelles by confocal microscopy. However, screening for mutations that affect the morphology of organelles generally requires individual mutagenesis and is time consuming. Here, we demonstrate a method to simultaneously incorporate organelle-GFP markers in almost 5,000 non-essential genes in yeast.

Ein High-Throughput-Verfahren zur global Studie der Organellen-Morphologie in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Forschung

Biologie

Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as colloidal gold can reveal the localization and distribution of specific antigens in various tissues1. The two most widely used techniques are pre-embedding and post-embedding techniques. In pre-embedding immunogold-electron microscopy (EM) techniques, the tissue must be permeabilized to allow antibody penetration before it is embedded. These techniques are ideal for preserving structures but poor penetration of the antibody (often only the first few micrometers) is a considerable drawback2. The post-embedding labeling methods can avoid this problem because labeling takes place on sections of fixed tissues where antigens are more easily accessible. Over the years, a number of modifications have improved the post-embedding methods to enhance immunoreactivity and to preserve ultrastructure3-5.
Tissue fixation is a crucial part of EM studies. Fixatives chemically crosslink the macromolecules to lock the tissue structures in place. The choice of fixative affects not only structural preservation but also antigenicity and contrast. Osmium tetroxide (OsO4), formaldehyde, and glutaraldehyde have been the standard fixatives for decades, including for central nervous system (CNS) tissues that are especially prone to structural damage during chemical and physical processing. Unfortunately, OsO4 is highly reactive and has been shown to mask antigens6, resulting in poor and insufficient labeling. Alternative approaches to avoid chemical fixation include freezing the tissues. But these techniques are difficult to perform and require expensive instrumentation. To address some of these problems and to improve CNS tissue labeling, Phend et al. replaced OsO4 with uranyl acetate (UA) and tannic acid (TA), and successfully introduced additional modifications to improve the sensitivity of antigen detection and structural preservation in brain and spinal cord tissues7. We have adopted this osmium-free post-embedding method to rat brain tissue and optimized the immunogold labeling technique to detect and study synaptic proteins.
We present here a method to determine the ultrastructural localization of synaptic proteins in rat hippocampal CA1 pyramidal neurons. We use organotypic hippocampal cultured slices. These slices maintain the trisynaptic circuitry of the hippocampus, and thus are especially useful for studying synaptic plasticity, a mechanism widely thought to underlie learning and memory. Organotypic hippocampal slices from postnatal day 5 and 6 mouse/rat pups can be prepared as described previously8, and are especially useful to acutely knockdown or overexpress exogenous proteins. We have previously used this protocol to characterize neurogranin (Ng), a neuron-specific protein with a critical role in regulating synaptic function8,9 . We have also used it to characterize the ultrastructural localization of calmodulin (CaM) and Ca2+/CaM-dependent protein kinase II (CaMKII)10. As illustrated in the results, this protocol allows good ultrastructural preservation of dendritic spines and efficient labeling of Ng to help characterize its distribution in the spine8. Furthermore, the procedure described here can have wide applicability in studying many other proteins involved in neuronal functions.

The localization and distribution of proteins provide important information for understanding their cellular functions. The superior spatial resolution of electron microscopy (EM) can be used to determine the subcellular localization of a given antigen following immunohistochemistry. For tissues of the central nervous system (CNS), preserving structural integrity while maintaining antigenicity has been especially difficult in EM studies. Here, we adopt a procedure that has been used to preserve structures and antigens in the CNS to study and characterize synaptic proteins in rat hippocampal CA1 pyramidal neurons.

Post-Einbettung Immunogoldmarkierung der synaptischen Proteine ​​in Hippocampusschnitt Kulturen

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as ...

Neurowissenschaften

Application of Fluorescent Nanoparticles to Study Remodeling of the Endo-lysosomal System by Intracellular Bacteria

Fluorescent nanoparticles (NPs) with desirable chemical, optical and mechanical properties are promising tools to label intracellular organelles. Here, we introduce a method using gold-BSA-rhodamine NPs to label the endo-lysosomal system of eukaryotic cells and monitor manipulations of host cellular pathways by the intracellular pathogen Salmonella enterica. The NPs were readily internalized by HeLa cells and localized in late endosomes/lysosomes. Salmonella infection induced rearrangement of the vesicles and accumulation of NPs in Salmonella-induced membrane structures. We deployed the Imaris software package for quantitative analyses of confocal microscopy images. The number of objects and their size distribution in non-infected cells were distinct from the ones in Salmonella-infected cells, indicating extremely remodeling of the endo-lysosomal system by WT Salmonella.

This article describes methods for the synthesis and fluorescent labeling of nanoparticles (NPs). The NPs were applied in pulse-chase experiments to label the endo-lysosomal system of eukaryotic cells. Manipulation of the endo-lysosomal system by activities of the intracellular pathogen Salmonella enterica were followed by live cell imaging and quantified.

Die Anwendung der Fluoreszenz-Nanopartikel zur Umgestaltung des Endo-lysosomalen System-Studie durch intrazelluläre Bakterien

Fluorescent nanoparticles (NPs) with desirable chemical, optical and mechanical properties are promising tools to label intracellular organelles. Here, we ...

Immunologie und Infektion

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Mitochondria are essential organelles of eukaryotic cells capable of aerobic respiration. They contain circular genome and gene expression apparatus. A mitochondrial genome of baker&#8217;s yeast encodes eight proteins: three subunits of the cytochrome c oxidase (Cox1p, Cox2p, and Cox3p), three subunits of the ATP synthase (Atp6p, Atp8p, and Atp9p), a subunit of the ubiquinol-cytochrome c oxidoreductase enzyme, cytochrome b (Cytb), and mitochondrial ribosomal protein Var1p. The purpose of the method described here is to specifically label these proteins with 35S methionine, separate them by electrophoresis and visualize the signals as discrete bands on the screen. The procedure involves several steps. First, yeast cells are cultured in a galactose-containing medium until they reach the late logarithmic growth stage. Next, cycloheximide treatment blocks cytoplasmic translation and allows 35S methionine incorporation only in mitochondrial translation products. Then, all proteins are extracted from yeast cells and separated by polyacrylamide gel electrophoresis. Finally, the gel is dried and incubated with the storage phosphor screen. The screen is scanned on a phosphorimager revealing the bands. The method can be applied to compare the biosynthesis rate of a single polypeptide in the mitochondria of a mutant yeast strain versus the wild type, which is useful for studying mitochondrial gene expression defects. This protocol gives valuable information about the translation rate of all yeast mitochondrial mRNAs. However, it requires several controls and additional experiments to make proper conclusions.

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Baker&#8217;s yeast mitochondrial genome encodes eight polypeptides. The goal of the current protocol is to label all of them and subsequently visualize them as separate bands.

Kennzeichnung und Visualisierung von mitochondrialen Genomexpressionsprodukten in Baker es Yeast Saccharomyces cerevisiae

Mitochondria are essential organelles of eukaryotic cells capable of aerobic respiration. They contain circular genome and gene expression apparatus. A ...

Biochemie

Visualizing Yeast Organelles with Fluorescent Protein Markers

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a classic model system in studying organelle function and dynamics. In our previous works, we have constructed fluorescent protein-based markers for major organelles and endomembrane structures, including the nucleus, endoplasmic reticulum (ER), Golgi apparatus, endosomes, vacuoles, mitochondria, peroxisomes, lipid droplets, and autophagosomes. The protocol presented here describes the procedures for using these markers in yeast, including DNA preparation for yeast transformation, selection and evaluation of transformants, fluorescent microscopic observation, and the expected outcomes. The text is geared toward researchers who are entering the field of yeast organelle study from other backgrounds. Essential steps are covered, as well as technical notes about microscope hardware considerations and several common pitfalls. It provides a starting point for people to observe yeast subcellular entities by live-cell fluorescent microscopy. These tools and methods can be used to identify protein subcellular localization and track organelles of interest in time-lapse imaging.

Here we describe the use of a set of fluorescent protein-based organelle markers in live-cell imaging of the budding yeast, Saccharomyces cerevisiae.

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a classic model system in studying organelle function and dynamics. In our previous works, we have ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

Eine Fluoreszenz-Mikroskopie Assay zur Überwachung Mitophagy in der Hefe Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal remodeling and vesicular trafficking in living cells. Quantitative methodologies using chimeric GFP fusions have been developed for many applications; however, GFP is somewhat resistant to proteolysis, thus its fluorescence persists in the lysosome/vacuole, which can impede quantification of cargo trafficking in the endocytic pathway. An alternative method for quantifying endocytosis and post-endocytic trafficking events makes use of superecliptic pHluorin, a pH-sensitive variant of GFP that is quenched in acidic environments. Chimeric fusion of pHluorin to the cytoplasmic tail of transmembrane cargo proteins results in a dampening of fluorescence upon incorporation of the cargo into multivesicular bodies (MVBs) and delivery to the lysosome/vacuole lumen. Thus, quenching of vacuolar fluorescence facilitates quantification of endocytosis and early events in the endocytic pathway. This paper describes methods using pHluorin-tagged cargos for quantification of endocytosis via fluorescence microscopy, as well as population-based assays using flow cytometry.

Accurate quantification of vesicular trafficking events often provides key insights into roles for specific proteins and the effects of mutations. This paper presents methods for using superecliptic pHluorin, a pH-sensitive GFP variant, as a tool for quantification of endocytic events in living cells using quantitative fluorescence microscopy and flow cytometry.

Anwendungen von pHluorin für Quantitative, Kinetic und Hochdurchsatz-Analyse von Endozytose in Bäckerhefe

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...

Plunge Freezing: A Tool for the Ultrastructural and Immunolocalization Studies of Suspension Cells in Transmission Electron Microscopy

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize macromolecular complexes at very high resolution. However, to get as close as possible to the native state, perfect sample preservation is required. Conventional electron microscopy (EM) fixation with aldehydes, for instance, does not provide good ultrastructural preservation. The slow penetration of fixatives induces cell reorganization and loss of various cell components. Therefore, conventional EM fixation does not allow for an instantaneous stabilization and preservation of structures and antigenicity. The best choice for examining intracellular events is to use cryofixation followed by the freeze-substitution fixation method that keeps cells in their native state. High-pressure freezing/freeze-substitution, which preserves the integrity of cellular ultrastructure, is the most commonly used method, but requires expensive equipment. Here, an easy-to-use and low-cost freeze fixation method followed by freeze-substitution for suspension cell cultures is presented.

This manuscript describes an easy-to-use and low-cost cryofixation method for visualizing suspension cells by transmission electron microscopy.

Freezing Plunge: Ein Werkzeug für den Elektronenmikroskopische und Immunolokalisation Studium der Suspensionszellen in Transmissions-Elektronen-Mikroskopie

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize ...

4D Microscopy of Yeast

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments in yeast are dynamic, and a full understanding of their properties requires time-lapse imaging. Multi-color 4D confocal fluorescence microscopy is a powerful method for tracking the behavior and composition of an intracellular compartment on a time scale of 5-15 min. Rigorous analysis of compartment dynamics requires the capture of thousands of optical sections. To achieve this aim, photobleaching and phototoxicity are minimized by scanning rapidly at very low laser power, and the pixel dimensions and Z-step intervals are set to the largest values that are compatible with sampling the image at full resolution. The resulting 4D data sets are noisy but can be smoothed by deconvolution. Even with high quality data, the analysis phase is challenging because intracellular structures are often numerous, heterogeneous, and mobile. To meet this need, custom ImageJ plugins were written to array 4D data on a computer screen, identify structures of interest, edit the data to isolate individual structures, quantify the fluorescence time courses, and make movies of the projected Z-stacks. 4D movies are particularly useful for distinguishing stable compartments from transient compartments that turn over by maturation. Such movies can also be used to characterize events such as compartment fusion, and to test the effects of specific mutations or other perturbations.

This protocol describes the analysis of fluorescently labeled intracellular compartments in budding yeast using multi-color 4D (time-lapse 3D) confocal microscopy. The imaging parameters are chosen to capture adequate signals while limiting photodamage. Custom ImageJ plugins allow labeled structures to be tracked and quantitatively analyzed.

4D-Mikroskopie der Hefe

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does not interfere with cell physiology, and requires minimal experimental handling. The low levels of technical interference enable researchers to study cells across multiple cycles of mitosis and to observe meiosis from beginning to end. Using fluorescent tags such as Green Fluorescent Protein (GFP) and Red Fluorescent Protein (RFP), researchers can analyze different factors whose functions are important for processes like transcription, DNA replication, cohesion, and segregation. Coupled with data analysis using Fiji (a free, optimized ImageJ version), live-cell imaging offers various ways of assessing protein movement, localization, stability, and timing, as well as nuclear dynamics and chromosome segregation. However, as is the case with other microscopy methods, live-cell imaging is limited by the intrinsic properties of light, which put a limit to the resolution power at high magnifications, and is also sensitive to photobleaching or phototoxicity at high wavelength frequencies. However, with some care, investigators can bypass these physical limitations by carefully choosing the right conditions, strains, and fluorescent markers to allow for the appropriate visualization of mitotic and meiotic events.

Here, we present live-cell imaging which is a non-toxic microscopy method that allows researchers to study protein behavior and nuclear dynamics in living fission yeast cells during mitosis and meiosis.

Untersuchung der Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics durch Fluoreszenz-Livezellmikroskopie

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...

Nanogold Markierung der Hefe Endosomale System für Ultrastrukturanalysen

Zusammenfassung

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Ein High-Throughput-Verfahren zur global Studie der Organellen-Morphologie in S. cerevisiae

Post-Einbettung Immunogoldmarkierung der synaptischen Proteine in Hippocampusschnitt Kulturen

Die Anwendung der Fluoreszenz-Nanopartikel zur Umgestaltung des Endo-lysosomalen System-Studie durch intrazelluläre Bakterien

Kennzeichnung und Visualisierung von mitochondrialen Genomexpressionsprodukten in Baker es Yeast Saccharomyces cerevisiae

Visualizing Yeast Organelles with Fluorescent Protein Markers

Eine Fluoreszenz-Mikroskopie Assay zur Überwachung Mitophagy in der Hefe Saccharomyces cerevisiae

Anwendungen von pHluorin für Quantitative, Kinetic und Hochdurchsatz-Analyse von Endozytose in Bäckerhefe

Freezing Plunge: Ein Werkzeug für den Elektronenmikroskopische und Immunolokalisation Studium der Suspensionszellen in Transmissions-Elektronen-Mikroskopie

4D-Mikroskopie der Hefe

Untersuchung der Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics durch Fluoreszenz-Livezellmikroskopie

Nanogold Markierung der Hefe Endosomale System für Ultrastrukturanalysen

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Ein High-Throughput-Verfahren zur global Studie der Organellen-Morphologie in S. cerevisiae

Post-Einbettung Immunogoldmarkierung der synaptischen Proteine ​​in Hippocampusschnitt Kulturen

Die Anwendung der Fluoreszenz-Nanopartikel zur Umgestaltung des Endo-lysosomalen System-Studie durch intrazelluläre Bakterien

Kennzeichnung und Visualisierung von mitochondrialen Genomexpressionsprodukten in Baker es Yeast Saccharomyces cerevisiae

Visualizing Yeast Organelles with Fluorescent Protein Markers

Eine Fluoreszenz-Mikroskopie Assay zur Überwachung Mitophagy in der Hefe Saccharomyces cerevisiae

Anwendungen von pHluorin für Quantitative, Kinetic und Hochdurchsatz-Analyse von Endozytose in Bäckerhefe

Freezing Plunge: Ein Werkzeug für den Elektronenmikroskopische und Immunolokalisation Studium der Suspensionszellen in Transmissions-Elektronen-Mikroskopie

4D-Mikroskopie der Hefe

Untersuchung der Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics durch Fluoreszenz-Livezellmikroskopie

Post-Einbettung Immunogoldmarkierung der synaptischen Proteine in Hippocampusschnitt Kulturen