Die Immunhistochemie ist eine relativ schnelle und einfache Technik, die die räumliche und zeitliche Beobachtung von Proteinen direkt in einem Gewebe oder Organismus mit markierten Antikörpern ermöglicht. Der Nutzen dieser Technik besteht darin, dass sie die Färbung eines intakten Gewebes oder eines Organismus ermöglicht, ohne es zuerst abschnitten zu müssen, und die konfokale Mikroskopie kann verwendet werden, um eine dreidimensionale Darstellung des Proteinexpressionsmusters zu erzeugen. Die Immunhistochemie wird in der biomedizinischen Forschung häufig eingesetzt, um die Ätiologie und die molekularen Mechanismen zu verstehen, die der Krankheit zugrunde liegen.
Es ist auch ein wertvolles diagnostisches Werkzeug, um Tumore in pathologischen Proben zu identifizieren. Bereiten Sie zunächst Laichtanks vor, die mit Systemwasser und einem Netz oder schlitzgeschlitzten Linern gefüllt sind. Platzieren Sie erwachsene Zebrafische gemischte Sexpaare in Gruppen in den Tanks über Nacht.
Verwenden Sie einen 14-Stunden/10-Stunden-Licht-/Dunkelzyklus mit Lichtern, die um 9 .m eintreffen. Am nächsten Morgen, wenn die Lichter eingeschaltet sind, wechseln Sie das Laichbeckenwasser mit frischem Systemwasser, um Kot zu entfernen. Sobald die Eier gelegt sind, kehren Sie die Erwachsenen in die Tanks zurück.
Sammeln Sie die Eier, indem Sie sie mit einer Transferpipette aufziehen. Übertragen Sie 50 Eier auf jede Petrischale, die auf halbem Weg mit Embryo-Medium gefüllt ist. Entfernen Sie alle undurchsichtigen und trüben Eier, die tot sind oder nicht geteilt werden konnten.
Die Schale der Eier bei 28,5 Grad Celsius bis 23 Stunden nach der Befruchtung bebrüten. Wenn Embryonen älter als 24 Stunden nach der Befruchtung sind, übertragen Sie die Embryonen mit einer Pipette auf 200 mikromolare PTU im Embryomedium, um eine Melanogenese zu verhindern. Dechorionate die ungeschlüpften Embryonen unter einem Stereomikroskop mit ultrafeinen Spitzenzangen.
Mit feuerpolierten Pasteur Pipetten, um Schäden zu minimieren, übertragen Sie sie in Glas oder Kunststoff Petrischalen mit 1-2%Agarose in Embryo-Medium gelöst beschichtet. Dann übertragen Sie die Embryonen mit einer Kunststoff- oder feuerpolierten Pipette in 1,5 Milliliter Zentrifugenrohre. Embryomedium mit einer Mikropipette entfernen.
Lassen Sie nur genug Flüssigkeit, um nur die Embryonen zu bedecken. Fixieren Sie die Embryonen in 4%PFA für ein bis zwei Stunden mit sanftem Schaukeln bei Raumtemperatur. Als nächstes waschen Sie die Embryonen dreimal in 1X PBS und 1%PBTriton für fünf Minuten.
Verwenden Sie die Embryonen sofort oder lagern Sie bei vier Grad Celsius bis zu einer Woche. Zur Langzeitlagerung die Embryonen bei minus 20 Grad Celsius in 100% Methanol dehydrieren und lagern. Um die Embryonen zu rehydrieren, führen Sie serielle Inkubationen jeweils fünf Minuten bei Raumtemperatur mit abnehmenden Mengen an Methanol und PBS und PBTriton für die Endwäsche durch.
Fahren Sie mit der Embryovorbereitung gemäß dem Manuskript fort. Wählen Sie eine Blockierlösung aus, die der sekundären Antikörper-Wirtsart entspricht, z. B. 10%Ziegenserum in PBTriton mit oder ohne zwei Milligramm pro Milliliter BSA. Fügen Sie 0,5 Milliliter der Blockierlösung in die Röhre, die den Embryo enthält, und legen Sie das Rohr für ein bis drei Stunden bei Raumtemperatur auf eine Wippe.
Dann inkubieren Sie den Embryo in primären Antikörper in Blockierlösung verdünnt und PBTriton über Nacht bei vier Grad Celsius beim Schaukeln. Am Morgen den Embryo fünfmal in PBTriton für jeweils 10 Minuten bei Raumtemperatur beim Schaukeln waschen. Wählen Sie dann einen sekundären Antikörper basierend auf der Wirtsart des primären Antikörpers und der gewünschten Wellenlänge bei 488 Nanometern aus.
Fügen Sie den sekundären Antikörper, der in einer Blockierenden Lösung verdünnt wird, in das Rohr, das den Embryo enthält. Bedecken Sie das Rohr mit Aluminiumfolie und inkubieren Sie für zwei Stunden bei Raumtemperatur beim Schaukeln. Danach waschen Sie die Embryonen dreimal in PBTriton für jeweils 10 Minuten bei Raumtemperatur, während sie mit Aluminiumfolie bedeckt und schaukeln.
Mit einer Pipette die Embryonen in eine 50%glyzerinlösung in PBS über ein Bett von 2%Agarose im Embryomedium übertragen. Um das Eigelb zu entfernen, übertragen Sie 200 Mikroliter 1X PBS auf eine Vertiefungsfolie oder eine schlichte Glasrutsche. Verwenden Sie eine Kunststoff-Transferpipette, um einen oder mehrere Embryonen in das PBS-Tröpfchen zu bewegen.
Verwenden Sie ultrafeine Zangen und Doppelnull Insektenstifte, um das Eigelb auseinander zu brechen und sehr sanft schaltigen DotterGranulat von der ventralen Oberfläche des Embryos. Entfernen Sie das Dottergranulat und füllen Sie es bei Bedarf mit PBS auf. Legen Sie die Probe nach der Montage auf die Mikroskopstufe.
Suchen Sie die Region von Interesse, indem Sie ein relativ helles Beispiel auswählen. Stellen Sie die Kamerabelichtung und -verstärkung so ein, dass das Signal ausreichend hell ist, ohne zu sättieren. Verwenden Sie beim Vergleich zwischen den experimentellen Antikörper-markierten Embryonen und Kontrollantikörperembryonen die gleichen Expositionseinstellungen.
Dieses Protokoll der ganzen Mount-Immunhistochemie ist ein wertvolles Werkzeug für die Untersuchung der räumlichen und zeitlichen Proteinexpression mittels Zebrafischentwicklung. Die GluN1-Untereinheit des NMDA-Typ-Glutamatrezeptors zeigte die Expression von Glutamatrezeptor-Untereinheiten während der Entwicklung von Zebrafischmuskeln nach 23 Stunden nach der Befruchtung. Gefrorene Abschnitte von 72-stündigen Embryos nach der Befruchtung wurden auf Dias montiert und immunstainiert für Phospho-H3, einen Marker von sich ausbreitenden Zellen.
Mehrere Zellen exprimieren Phospho-H3 und die Expression war am bemerkenswertesten in den ventrikulären Zonen. Maus-IgG-Kontrollantikörper und ohne primäre Antikörper ergaben einen geringen Grad an unspezifischer Expression. Es ist wichtig, geeignete Blockierlösungen und sekundäre Antikörper auf der Grundlage der primären Antikörper-Wirtsarten auszuwählen, um den Nachweis zu gewährleisten und unspezifische Färbungen zu minimieren.
Die Immunhistochemie muss überprüft werden, um sicherzustellen, dass das beobachtete Signal tatsächlich das Protein von Interesse ist. Folgeexperimente beinhalten in der Regel die Verwendung genetisch oder umweltverträglicher Organismen. Die Immunhistochemie gibt Forschern die Möglichkeit, Proteine vor Ort zu beobachten, was unser Verständnis zahlreicher Systeme sowohl in der Grundlagen- als auch in der angewandten Biologie, insbesondere während der Embryoentwicklung, erheblich beschleunigt.
Methanol und Formaldehyd sind giftig und sollten sorgfältig behandelt werden. Abfälle müssen nach institutionellen Verfahren gesammelt und entsorgt werden.
