Name: induction of hypoxia in living frog and zebrafish embryos
Uploaded: 2017-06-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos at JoVE.com

Diese Arbeit wurde unterstützt von der Unterstützung von Wellcome Trust SIA Award 100329 / Z / 12 / Z an WAH und dem DFG-Stipendium KH 376 / 1-1 an HK

Dieses Protokoll folgt den Tierschutzrichtlinien der Universität von Cambridge. 1. Tierpflege <ol><li> Frosch-Embryonen ANMERKUNG: Embryonen können entsprechend der Tier- und Laboreinrichtung angehoben und gepflegt werden. Hier wird ein Beispiel für die Tierpflege beschrieben. <ol><li> Vorbereitung der 0,1x modifizierten Barth-Lösung (MBS): 0,88 mM NaCl, 10 μM KCl, 24 μM NaHCO 3 , 100 μM HEPES, 8,2 μM MgSO 4 , 3,3 μM Ca (NO 3 ) 2 und 4,1 μM CaCl 2 , pH 7,6 . </li><li> Erhält Xenopus laevis embryos durch In-vitro- Fertilisation. <ol><li> Den Eisprung in erwachsenen weiblichen afrikanischen Krallenfröschen ( Xenopus laevis) durch Injektion mit schwangerem Stutenserum Gonadotropin eine Woche (60 IE) und 12 h (500 IE) vor der Ei verlegen. </li><li> Sammeln Sie Oozyten und befruchten sie in vitro mit homogenisiertem männlichen Hoden. </li><li> RaiSe Embryonen in 0,1x MBS bei 16 - 18 ° C. Bühne die Embryonen nach der Normaltabelle von Xenopus laevis 14 . Achten Sie darauf, ganze und lebendige Embryonen für das Experiment auszuwählen. </li></ol></li></ol></li><li> Zebrafisch-Embryonen ANMERKUNG: Embryonen können entsprechend der Tier- und Laboreinrichtung angehoben und gepflegt werden. Hier wird ein Beispiel für die Tierpflege beschrieben. <ol><li> Bereiten Sie Embryo-Medium vor: 5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl 2 , 0,33 mM MgSO 4 und 0,00001% Methylenblau. </li><li> Pflegen und züchten WT AB-Stamm Danio rerio bei 26,5 ° C. </li><li> Sammeln Sie die Embryonen am Morgen der Befruchtung, erhöhen Sie bis 4 d Nachdüngung (dpf) bei 28 ° C in Embryo-Medium, das wie oben beschrieben hergestellt wurde, wählen Sie und stufen Sie, wie zuvor beschrieben 15 . </li></ol></li></ol> 2. Induktion von Hypoxie in vivo </P&gt; <ol><li> Aufbau der Gasinkubationskammer <ol><li> Verwenden Sie einen Zucht-Wassertank ( Abb. 1A ), der normalerweise in der Fischanlage für den hypoxischen Kammerbau verwendet wird. Dieser Tank sollte eine 24-Well-Platte passen. </li><li> Bereiten Sie eine Maschen-Boden-24-Well-Platte vor, wie in Abbildung 1 dargestellt . Entfernen Sie den Kunststoffboden der 24-Well-Platte ( Abbildung 1B ), z . B. mit einer Fräsmaschine zu diesem Zweck. </li><li> Füllen Sie den Raum zwischen dem Kunststoff der Brunnen und den Wänden der Platte mit Epoxidharz. Befestigen Sie jeden Nylonfilter ( Bild 1C ) mit einem Maschendurchmesser von 0,1-0,2 mm zum harzbeschichteten Kunststoff und lassen Sie die Platte vollständig trocken sein. </li><li> Nach dem Trocknen bohren Sie drei oder vier Tunnel ( Abb. 1D ) von 10 mm Länge und 5 mm Durchmesser in die harz- und mesh-beschichteten Plattenwände. Kunststoff- oder Teflonstäbe anbringen( Abbildung 1E ) von geeigneter Durchmesser und 30 mm Länge zu den Tunneln und legen Sie die Platte in den Tank der Wahl. </li><li> Legen Sie die Mesh-Boden 24-Well-Platte in den Wassertank der Wahl. Bei Verwendung eines Silikonschlauches ( Abbildung 1F ) einen Gasbehälter ( Bild 1G ) mit dem gewünschten O 2 / N 2 -Mischung oder einem anderen Gasgemisch der Wahl zu einem Verteilerventil ( Bild 1H ) unter Verwendung eines geeigneten Gasreglers (I) (BOC 200 Bar). Hier verwenden wir in den hier vorgestellten Hypoxie-Experimenten Gasbehälter mit einer Mischung aus 5% Sauerstoff und 95% N 2 . </li><li> Stellen Sie den Sauerstoffdurchsatz im Kammermedium auf 0,0017-0.0019 Kubikmeter pro Sekunde ein. Unter dieser Gasströmungsrate sollte keine Störung des Mediums in den Wells der Platte gesehen werden. <ol><li> Verwenden Sie dazu den hochreinen zweistufigen Gasregler. Stellen Sie den Regler ein, um den Innendruck von th zu reduzierenE Gasbehälter (1000 - 2500 PSI) bis zu einem Förderdruck von 10 PSI während des gesamten Experiments. Somit wurde in Übereinstimmung mit den Spezifikationen dieses Gasreglers eine Durchflussrate von 0,00189 Kubikmetern pro Sekunde während des gesamten Experiments erreicht. </li></ol></li><li> Verbinden Sie den Silikonschlauch und das Verteilerventil mit einem Keramikscheiben-Diffusor ( Abbildung 1J ) im Inneren des Wassertanks. Schließen Sie den Wassertank und verschließen Sie den Deckel vorsichtig und beschichten Sie ihn mit Silikonfett ( Abbildung 1K ) (siehe Abbildung 1 ). Wenn eine bestimmte Nicht-Raumtemperatur erforderlich ist, legen Sie die Hypoxikammer in einen Laborinkubator der erforderlichen Temperatur. </li><li> Abhängig von der Art der Embryonen, die in dem Experiment verwendet werden, füllen Sie den hypoxischen Kammerbehälter mit dem geeigneten Embryonemedium und beginnen, das Gasgemisch durch den keramischen Scheibendiffusor zu diffundieren. Äquilibrieren für 10-15 min. </li><li> Nach dem Äquilibrieren mit thE gewünschte Sauerstoffmischung, Messung der Sauerstoffkonzentration im Wasser unter Verwendung eines Oxymeters oder einer Sauerstoffsonde. Hier verwenden Sie hierzu einen Oxymeter mit dem faseroptischen gelösten Sauerstoff- und Temperatursensor. </li></ol></li><li> Induktion von Hypoxie bei Embryonen <ol><li> Vorsichtig wählen Sie die Embryonen für das Experiment, verwenden Sie ganze und lebendige Embryonen für die Hypoxie Inkubation. Hier sind uns Frosch-Embryonen der Stufe 38 oder Zebrafisch-Embryonen 4 dpf in den hier vorgestellten Experimenten. </li><li> Legen Sie die Embryo-Schalen in den Inkubator ( Abbildung 1K ), der die Gas-Inkubationskammer enthält, und lassen Sie sie sich auf die Temperatur des Inkubators ausgleichen. </li><li> Sorgfältig die Embryonen in die Vertiefungen der Maschen 24-Well-Platte ( Abbildung 1B ) der Gasinkubationskammer unter Verwendung einer Plastikpipette überführen. Verwenden Sie immer eine Plastikpipette für den Embryotransfer während des gesamten Protokolls. HINWEIS: Jeder Brunnen dieser Platte kann aufnehmenBis 5 Frosch-Embryonen der Stufe 38 oder bis zu 7 Zebrafisch-Embryonen von 4 dpf. Beschriften Sie die Brunnen sorgfältig, wenn Sie verschiedene Genotypen verwenden. </li><li> Halten Sie die Gasinkubationskammer unter einer konstanten Infusion mit dem Gasgemisch der Wahl für 5 h oder für eine längere Zeit, die dem Experiment entspricht. Verwenden Sie hier eine Mischung aus 5% O 2 und 95% N 2 . </li><li> Sorgfältig die Embryonen aus der Gasinkubationskammer zurück in das dem Embryotyp entsprechende normoxische Medium übertragen und sofort mit den Schritten 3 oder 4 fortfahren. </li><li> Wenn eine weitere normoxische Behandlung erforderlich ist, überträgt man die Embryos vorsichtig auf das dem Embryotyp entsprechende normoxische Medium. </li></ol></li></ol> 3. Kontrolle der erfolgreichen Hypoxie-Induktion durch Überwachung von HIF-1α-Stufen <ol><li> Vorbereitungen <ol><li> 0,4 mg / ml MS222-Lösung in 0,1x MBS vorbereiten. </li><li> Hygienepuffer vorbereiten: Radioimmunpräzipitationstestpuffer (RIPA bUffer) zur Homogenisierung des Gewebes und ergänzen die für den Versuch mit Protease Inhibitor notwendige Puffermenge auf eine Endkonzentration von 1: 100 V / V. </li><li> Vorbereitung von Lösungen für Western Blot. <ol><li> 4x Laemmli-Gel-Beladungspuffer vorbereiten: 425 mM Tris pH 8,0, 40% v / v Glycerin, 8% v / v SDS, 4% v / v beta-Mercaptoethanol, 0,5% w / v Bromphenolblau, 10 mL Gesamtvolumen ddH 2 O. </li><li> 5x Laufpuffer vorbereiten: 15 g Trizma-Base, 72 g Glycin, 5 g SDS, 1 l Gesamtvolumen ddH 2 O. </li><li> Vorbereiten des Transferpuffers: 2,66 g Trizma-Base, 14,4 g Glycin, 200 ml 100% Methanol, 1 l Gesamtvolumen ddH 2 O. </li><li> Vorbereitung 10x TBST: 5 ml 1 M Tris pH 8,0, 30 ml 5M NaCl, 2,5 ml Tween 20, 1 L Gesamtvolumen H 2 O. </li><li> Vorbereiten der Sperrlösung: 4% w / v Magermilchpulver in 1x TBST. </li></ol></li></ol></li><li> Sammlung von Gewebe <ol><li> Anästhesieren Sie die Embryonen durch Baden in 0,4 mg / ml MS222-Lösung16 , 17 und überführen sie in ein mit Homogenisierungspuffer gefülltes Plastikreaktionsrohr unter Verwendung einer Plastikpipette. 20 μl Puffer pro Embryo verwenden. Beachten Sie, dass mindestens 5 Frosch-Embryonen der Stufe 38 oder 7 Zebrafisch-Embryonen von 4 dpf erforderlich sind, um eine signifikante Veränderung der HIF1α-Proteingehalte zu bestimmen. </li><li> Homogenisieren des Gewebes mit einem geeigneten Gewebehomogenisator oder einem Ultraschallgerät. Entfernen Sie den Schmutz durch Zentrifugation (15 min, 13.000 xg, 4 ° C). <ol><li> Alternativ zerlegen Sie die Retinas aus den anästhesierten Froschembryonen 17 und homogenisieren wie oben. 20 μl Homogenisierungspuffer pro 10 Retinas verwenden. </li></ol></li><li> Nehmen Sie den Überstand mit einer Pipette, denaturieren bei 85 ° C für 5 min und ergänzen mit Laemmli Gelbeladungspuffer auf eine Endkonzentration von 1x v / v ( z. B. fügen Sie 5 μl 4x Laemmli-Puffer zu 15 μl Homogenat hinzu). Benutze diesen Überstand für die WesTern blot oder einfrieren die Proben bei -20 ° C. </li></ol></li><li> Westlicher Fleck <ol><li> Laden Sie die in Schritt 3.2 hergestellten Proben auf einem vorgefertigten 12% Gel in einem Elektrophoresesystem unter Verwendung von 1x V / V Laufpuffer. Verwenden Sie eine Proteinleiter zur Bestimmung der Proteingröße. Übertragen Sie die Proteine ​​auf eine Nitrozellulosemembran (0,45 μm Membran) in Transferpuffer für 1 h, gepackt auf Eis bei 4 ° C, nach Herstellerprotokoll. </li><li> Block unspezifische Bindungsstellen, die die Membran in Blocking Puffer für 60 min inkubieren. Folge mit 3 x 10 min wäscht in 1x TBST. </li><li> Inkubieren der Membran in Lösungen von Kaninchen-Anti-HIF-1α-Antikörper und Maus-anti-α-Tubulin, verdünnt 1: 100 v / v bzw. 1: 5000 v / v in Blockierungslösung für 2,5 h bei RT. Folge mit 3 x 10 min wäscht in 1x TBST. </li><li> Zur Detektion inkubieren in Ziegen-Anti-Kaninchen und Ziegen-anti-Maus HRP-konjugierte Antikörper 1: 1000 v / v in Blockierungslösung für 1 h verdünnt.Folgen Sie mit 3 x 10 min Wäschen in 1x TBST und visualisieren Sie die HRP-Färbung mit einem kommerziellen Kit und einer Entwickler-Maschine der Wahl. </li><li> Quantifizierung der Menge an HIF1α-Protein mittels digitaler Quantifizierung. </li></ol></li></ol> 4. Überwachung der Zellproliferation bei Hypoxie <ol><li> Vorbereitungen <ol><li> Bereiten Sie 5 mM EdU-Lösung im Embryo-Medium der Wahl vor. Die Lösung kann sofort oder aliquotiert und bei -20 ° C für bis zu 6 Monate gelagert werden. </li><li> Phosphat-gepufferte Saline (PBS) vorbereiten oder PBS aus kommerziellen Ressourcen kaufen. Autoklav für 10 min bei 115 ° C. </li><li> Vorbereitung von Lösungen für den Nachweis der EdU-Inkorporation. <ol><li> Fixierungslösung vorbereiten: 4% v / v von 16% Formaldehyd-Stammlösung in PBS. </li><li> Saccharose-Lösung vorbereiten: 30% w / v Saccharose in PBS. </li><li> Vorbereitung PBST: 0,1% v / v Triton X-100 in PBS. </li><li> Vorbereiten Blockierungslösung: 10% v / v Hitze-inaktiviertes Ziegenserum (H.IGS) in PBST. </li><li> DAPI-Lösung vorbereiten: 1: 1000 v / v 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) in PBST. </li></ol></li></ol></li><li> Inkubation von Embryonen in Hypoxie für EdU-Inkorporation <ol><li> Füllen Sie die Gasinkubationskammer mit 400-500 ml 5 mM EdU-Lösung, ergänzt mit 1% V / V DMSO. Vor-equilibrieren der Lösung mit dem gleichen Gasgemisch, das in dem Experiment für 15 min vor dem Experiment verwendet wurde. Beachten Sie, dass das Volumen der Inkubationslösung minimiert werden kann, indem kürzere Stäbe ( Abbildung 1E ) an der Maschenbodenplatte befestigt werden. </li><li> Verbinden Sie den Gasschlauch mit der Gasflasche, die ein Gasgemisch aus 5% O 2 und 95% N 2 enthält . Inkubieren Sie die Lösung für 15 min. </li><li> Übertragen Sie die Embryos in die hypoxische Kammer, verteilen sie gleichmäßig zwischen den Brunnen und inkubieren für 2 h. Jeder Brunnen kann bis zu 5 Frosch-Embryonen der Stufe 38 oder bis zu 7 Zebrafisch-Embryonen 4 dpf. </li><li> Analysiere den EmbryoS für EdU Eingliederung. </li></ol></li><li> Zeitverlauf der Embryo-Inkubation bei Hypoxie und EdU-Inkorporation <ol><li> Füllen Sie die Gas-Inkubationskammer mit 500 ml Embryo-Medium der Wahl. Verbinden Sie den Gasschlauch mit der Gasflasche, die ein Gasgemisch aus 5% O 2 und 95% N 2 enthält, und das Medium mit dem Gasgemisch für 15 min ausgleichen. </li><li> Übertragen Sie die Embryos in die hypoxische Kammer und verteilen sie gleichmäßig zwischen die Vertiefungen und inkubieren für die gewünschte Zeitspanne bis zu 48 h. Für die letzten 1 h, ersetzen Sie das Embryo-Medium mit 5 mM EdU-Lösung, ergänzt mit 1% v / v DMSO. </li><li> Übertragen Sie die Embryonen wieder auf die normoxische Schale und analysieren Sie für die EdU-Inkorporation. </li></ol></li><li> EdU-Inkorporationserkennung und -analyse <ol><li> Anästhesieren Sie die Embryonen durch Baden in 0,4 mg / ml MS222-Lösung. </li><li> Die Embryonen in eine geeignete Glasampulle überführen und durch Inkubieren in Fixierlösung für 2 ha fixierenT RT oder O / N bei 4 ° C. Folgen Sie mit 3 x 10 min Waschungen in PBS. Sorgfältig die Embryonen auf die Saccharose-Lösung für die Gewebekryoprotektion übertragen. Inkubieren für 4 h oder bis die Embryonen auf den Boden der Glasampulle sinken. </li><li> Einbetten der Embryonen in Einbettmedium (optimale Schneidtemperatur-Verbindung). Kryoseblöcke mit Embryonen sofort oder bis zu 14 d bei -80 ° C aufbewahren. </li><li> Kryosektion der Blöcke mit Embryonen unter Verwendung eines Kryostaten. Sammeln Sie Abschnitte von 12 μm (Zebrafisch-Embryonen) oder 16 μm (Frosch-Embryos) Dicke auf Mikroskop-Objektträger und lassen Sie trocken. Kryosektionen sofort verarbeiten oder bei -20 ° C für bis zu 3 Monate lagern. </li><li> Nachweis der EdU-Inkorporierung durch Immunfluoreszenzfärbung unter Verwendung eines handelsüblichen Chemiekits. Bereiten Sie die Menge an EdU Reaction Mix vor, die für die Anzahl der Kryosorten im Experiment notwendig ist, wie vom Hersteller beschrieben. <ol><li> Für 500 μl EdU-Reaktionsmischung 430 μl 1X EdU-Reaktionspuffer verwenden, 20 &amp; mgr; l CuSO 4 , 1,2 &amp; mgr; l Alexa Fluorazid, 50 &amp; mgr; l 1X EdU-Pufferadditiv. </li></ol></li><li> Die Kryosorten einmal mit PBS waschen, um das Einbettungsmedium zu entfernen, und 3 x 5 min mit PBST, um das Gewebe zu permeabilisieren. Inkubieren Sie die Kryosorten in Blockierlösung für 30 min. </li><li> Inkubieren Sie die Cryose mit dem EdU Reaction Mix für 1 h und gefolgt von 3 x 10 min Waschungen in PBST. Die Kryosektionen mit DAPI-Lösung für 15 min kochen lassen, gefolgt von 3 x 10 min Waschungen in PBST. Montieren Sie die Folien mit gefärbten Kryosorten in Montagemedium, decken Sie mit Deckgläschen ab und lassen Sie sie vor dem Analysieren unter einem Leuchtstoffmikroskop trocknen oder bei 4 ° C bis zu 1 Jahr aufbewahren. </li><li> Analysieren Sie die Kryosorten mit Anti-EdU-Färbung unter einem invertierten konfokalen Rastermikroskop und bestimmen Sie die Anzahl der EdU-positiven Zellen mit digitaler Quantifizierung. </li></ol></li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Hier haben wir eine einfache, aber robuste neue Methode vorgestellt, um eine Hypoxie zu induzieren, die für den Einsatz mit Frosch- und Zebrafisch-Embryonen angepasst ist, aber auch für andere Wasserorganismen geeignet ist. Der wesentliche Vorteil dieser Methode liegt in ihrer Einfachheit und Kosteneffizienz. Dennoch sind die mit dieser Methode erzielten Ergebnisse sehr robust. Wir haben gezeigt, dass Hypoxie in der Kammer sowohl in ganzen Embryonen als auch in spezifischem Gewebe effizient induziert werden kann - hie...

Hypoxie-Forschung hat zahlreiche Anwendungen. Dazu gehören die Untersuchung der Pathogenese und die Entwicklung von Behandlungen für medizinische Zustände, die durch Hypoxie 1 und akute Höhenkrankheit gekennzeichnet sind 2 . Hypoxischer Stress verursacht große metabolische Veränderungen in allen Organismen, die Sauerstoff benötigen. Hypoxischer Stress beeinflusst auch das fetale Wachstum und die Entwicklung und die Pathogenese mehrerer menschlicher Krankheiten, einschließlich der intrauterinen Wachstumsbeschränkung 3 . Hypoxischer Stress kann nicht nur zu reduziertem Geburtsgewicht, fetaler und neonataler Mortalität führen, sondern kann auch zu vielen Komplikationen im Erwachsenenleben führen, wie Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Typ-2-Diabetes, Fettleibigkeit und Hypertonie 4 . Ein hypoxischer Stress wird auch häufig während der soliden Tumorentwicklung beobachtet, wenn das Tumorgewebe seine Blutversorgung erweitert. Es ist daher entscheidend, die Auswirkungen von Hypoxie in vivo und direkt während der Embr<html> Yonische Entwicklung. Unter den bekanntesten Methoden, die zur Untersuchung von Wirkungen von Hypoxie während der Entwicklung angewendet wurden, ist die Verwendung von Kobaltchlorid im Wachstumsmedium oder die Inkubation des Organismus in einer hypoxischen Kammer. Kobaltchlorid induziert aufgrund seiner Rolle bei der Stabilisierung von hypoxieinduzierbarem Faktor-1 alpha (HIF-1α) durch die Verhinderung seines proteosomalen Abbaus 5 , 6 , 7 künstlich eine hypoxische Reaktion unter normaler Sauerstoffkonzentration. Allerdings kann die Verwendung von Cobaltchlorid sowie anderer ähnlicher chemischer Hypoxie-Mimetika eine unspezifische schädliche Wirkung auf Zellen und Gewebe, z . B. Apoptose 9, aufweisen . Daher sind hypoxische Kammern eine bessere Methode zur Induktion von &quot;natürlicher Hypoxie&quot; in lebenden Organismen durch den Verlauf der normalen Entwicklung. Wir haben uns auf die Entwicklung eines Systems zur Induktion von Hypoxie in Wassertierembryonen konzentriert. Beide Frösche und Zebrafisch sind mittlerweile zu informativen Wirbeltiermodellorganismen für Studien zahlreicher biologischer Prozesse sowie zu Modellen für verschiedene menschliche Krankheiten geworden. Frosch- und Zebrafisch-Embryonen Entwickeln sich nach außen, eliminieren die Komplikation der mütterlichen Kompensation, und ein schneller Entwicklungsverlauf ermöglicht es, Umweltfaktoren zu manipulieren und die phänotypischen Veränderungen der Organbildung in Echtzeit zu beobachten. Darüber hinaus sind viele Komponenten großer Signaltransduktionswege in hohem Maße konserviert Diese Modellorganismen sind im Detail durch eine große Anzahl von Literatur charakterisiert worden. Der Hauptvorteil bei der Verwendung von Fröschen und Zebrafisch-Embryonen, um die Auswirkungen von Hypoxie auf die Wirbeltierentwicklung zu untersuchen, ist, dass alle Prozesse direkt überwacht werden können, da Sauerstoff schnell die Embryonen durchdringt. So, bei Fröschen und Zebrafisch, wie im Gegensatz zu anderen Modellorganismen wieMaus-Embryonen, kann der Einfluss einer spezifischen Sauerstoffkonzentration im interessierenden Gewebe untersucht werden, ohne die Anwesenheit oder den Mangel an funktionellem Gefäß zu berücksichtigen. Die meisten handelsüblichen Aufbauten für die hypoxische Inkubation haben den Nachteil, dass sie vergleichsweise groß sind und entsprechend hohe Betriebskosten aufweisen. Abgesehen von ihrem hohen anfänglichen Kosten- und Gasverbrauch erfordert die Äquilibrierung und die Aufrechterhaltung gemeinsamer Hypoxie-Kammern die Aufrechterhaltung einer konstanten hypoxischen Atmosphäre gegen den Gasgradienten, der in diesen Kammern aufgrund ihrer größeren und / oder organischen Atmung natürlich vorkommt. Dies erfordert die Verwendung von Gasventilatoren und ein Kühlsystem, das die Menge an zusätzlichen notwendigen Geräten erhöht, die Geschicklichkeit des Forschers beeinträchtigt und insgesamt die Einfachheit des experimentellen Verfahrens verringert. Im Gegensatz dazu ist das hier präsentierte Setup vergleichsweise robust, aber sehr kostengünstig, klein, einfach zu ermitteln und erlaubt fAst Gas-Äquilibrierung, stabile hypoxische Atmosphäre und einfacher Austausch von Materialien und Lösungen in der Kammer. Unser System kann für den Einsatz mit jedem aquatischen Modell Organismus von Interesse eingesetzt werden. Wir haben eine hypoxische Kammer konstruiert, die bequem klein ist und daher in einem gemeinsamen Laborinkubator platziert werden kann, was leicht experimentelle Eingriffe bei einer bestimmten Temperatur ermöglicht. Durch die bequeme Kontrolle der Temperatur sowie der Sauerstoffkonzentration im Medium liegt der Vorteil unseres Systems gegenüber den handelsüblichen Hypoxieinkubatoren in seiner geringen Größe und Kosteneffizienz. So kann unser Setup mit Hilfe von Laboratorien für die meisten Laboratorien eingerichtet werden und erfordert keine teuren Materialien. Darüber hinaus erzeugt unser Setup keine Hitze, im Gegensatz zu den handelsüblichen Hypoxie-Inkubatoren und ermöglicht die Verwendung bei Temperaturen unterhalb der Raumtemperatur in einem Inkubator. Das laSt ist besonders kritisch für die Arbeit mit kaltblütigen Organismen wie Frösche und Fische, wo Entwicklungs- und Stoffwechselraten stark temperaturabhängig sind. Als sehr kostengünstig und leicht zu bauen ist unsere Gasinkubationskammer dennoch sehr vielseitig einsetzbar, um verschiedene hypoxische oder hyperoxische Zustände zu etablieren und eine schnelle und einfache Verabreichung unterschiedlicher Medien und Lösungen für eine Vielzahl von experimentellen Bedingungen zu ermöglichen. Darüber hinaus ermöglicht unser System die Verwendung einer 24-Well-Platte anstelle von üblicherweise verwendeten Speisen oder Labortanks 10 , 11 , 12. Unser System ermöglicht die Beobachtung und experimentelle Behandlung von mehreren Mutantenbedingungen auf einmal. Um die korrekte Induktion der Hypoxie zu kontrollieren, haben wir die Niveaus des HIF-1α-Proteins durch Western-Blot-Detektion überwacht. Darüber hinaus ist die Anzahl der proliferierenden Zellen vor und nach der InkubationN in der hypoxischen Kammer kann verwendet werden, um festzustellen, ob Hypoxie im Gewebe induziert worden ist. Diese Methode basiert auf unseren bisher veröffentlichten Ergebnissen 13 , die zeigen, dass die Proliferation in der embryonalen retinalen Stammzellnische bei der Induktion der Hypoxie abnimmt. So haben wir das Niveau der Retinal-Stammzell-Proliferation durch Zugabe von 5-Ethinyl-2&#39;-desoxyuridin (EdU) zum Embryonemedium überwacht und deren Einarbeitung in die DNA von neu proliferierenden Zellen gemessen.

<table><tbody><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td>NaCl/0.1x MBS, Embryo medium, 10x TBST</td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td>KCl/0.1x MBS, Embryo mediu,</td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;/0.1x MBS</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>0.1x MBS</td></tr><tr><td>Magnesium sulfate</td><td>Sigma</td><td>M7506</td><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;/0.1x MBS, Embryo medium</td></tr><tr><td>Calcium nitrate</td><td>Sigma</td><td>202967</td><td>Ca(NO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;/0.1x MBS</td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;/0.1x MBS, Embryo medium</td></tr><tr><td>Methylene blue</td><td>Sigma</td><td>M9140</td><td>Embryo medium</td></tr><tr><td>Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG)</td><td>Sigma</td><td>CG10</td><td>Frog fertilization</td></tr><tr><td>Zebrafish breeding tank</td><td>Carolina</td><td>161937</td><td>Gas chamber construction</td></tr><tr><td>24-well plate</td><td>Thermo Scientific</td><td>142475</td><td>Nunclon Delta Surface, for gas chamber construction</td></tr><tr><td>Epoxy resin</td><td>RS Components UK</td><td>Kit 199-1468</td><td></td></tr><tr><td>Gas distributor valve</td><td>WPI Luer Valves</td><td>Kit 14011</td><td>Aquatic tank attachment (Schema 1, &lt;strong&gt;H&lt;/strong&gt;)</td></tr><tr><td>High precision gas valve</td><td>BOC&amp;nbsp;</td><td>200 bar HiQ C106X/2B</td><td>Gas tank attachment (Schema 1, &lt;strong&gt;I&lt;/strong&gt;)</td></tr><tr><td>5% oxygen and 95% N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; gas tank</td><td>BOC</td><td>226686-L</td><td>Hypoxic gas mixture</td></tr><tr><td>ceramic disc diffuser</td><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Art&amp;nbsp;</td><td>Glass CO2 Nano Aquarium Diffuser, DG005DG005</td><td>Schema 1, &lt;strong&gt;J&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>silicone grease</td><td>Scientific Laboratory Supplies</td><td>VAC1100</td><td>Schema 1, &lt;strong&gt;K&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>oxymeter</td><td>Oxford Optronix&amp;nbsp;</td><td>Oxylite, CP/022/001</td><td>Hypoxic chamber setup</td></tr><tr><td>fibre-optic dissolved oxygen sensor</td><td>Oxford Optronix</td><td>HL_BF/OT/E</td><td>Hypoxic chamber setup</td></tr><tr><td>plastic pasteur pipette</td><td>Sterilin</td><td>STS3855604D</td><td>For embryo transfer</td></tr><tr><td>MS222&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E10521-50G</td><td>Embryo anesthetic</td></tr><tr><td>RIPA buffer&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>R0278-50ML</td><td>Tissue homogenization</td></tr><tr><td>Protease inhibitor</td><td>Sigma</td><td>P8340</td><td>Tissue homogenization</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td>77-86-1</td><td>4x Laemmli loading buffer, 10x TBST</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td>4x Laemmli loading buffer</td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td><td>Sigma</td><td>L3771</td><td>4x Laemmli loading buffer, 5x Running buffer</td></tr><tr><td>beta-Mercaptoethanol&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td>4x Laemmli loading buffer</td></tr><tr><td>Bromophenol Blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0126</td><td>4x Laemmli loading buffer</td></tr><tr><td>Trizma base&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>77-86-1</td><td>5x Running buffer, Transfer buffer</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>G8898</td><td>5x Running buffer, Transfer buffer</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma</td><td>34860</td><td>Transfer buffer</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P2287-500ML</td><td>10x TBST</td></tr><tr><td>skim milk powder</td><td>Sigma</td><td>70166</td><td>Blocking Solution</td></tr><tr><td>Eppendorf microcentrifuge tube</td><td>Sigma</td><td>T9661</td><td></td></tr><tr><td>tissue homogenizer</td><td>Pellet Pestle Motor Kontes</td><td>Z359971</td><td>Tissue homogenization</td></tr><tr><td>pellet pestles</td><td>Sigma</td><td>Z359947-100EA</td><td>Tissue homogenization</td></tr><tr><td>precast 12% gel</td><td>Biorad</td><td>Mini-ProteinTGX, 456-1043</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>protein ladder</td><td>Amersham</td><td>Full-Range Rainbow ladder, RPN800E</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>nitrocellulose membrane (0.45 &amp;micro;m)</td><td>Biorad</td><td>162-0115</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>anti-HIF-1&amp;alpha; antibody</td><td>Abcam</td><td>ab2185</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>anti-&amp;alpha;-tubulin antibody</td><td>Sigma</td><td>T6074</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>goat anti-rabbit antibody</td><td>Abcam</td><td>ab6789</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>goat anti-mouse antibody</td><td>Abcam</td><td>ab97080</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>Pierce ECL 2 reagent&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>80196</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>ECL films Hyperfilm</td><td>GE Healthcare Amersham</td><td>28906837</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>5-Ethynyl-2&amp;prime;-deoxyuridine &amp;nbsp;</td><td>santa cruz</td><td>CAS&amp;nbsp;61135-33-9</td><td>EdU, EdU incorporation</td></tr><tr><td>Phosphate-buffered Saline (PBS)</td><td>Oxoid</td><td>BR0014G</td><td>1x</td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Thermo Scientific</td><td>28908</td><td>Fixation solution</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fluka</td><td>S/8600/60</td><td>Solution solution</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284-500ML</td><td>PBST</td></tr><tr><td>Heat-inactivated Goat Serum (HiGS)</td><td>Sigma</td><td>G6767-100ml</td><td>Blocking solution (EdU incorporation)</td></tr><tr><td>4&#039;,6-diamidino-2-phenylindole&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D1306</td><td>DAPI, EdU incorporation</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Molecular Probes</td><td>C10338</td><td>EdU incorporation</td></tr><tr><td>glass vial</td><td>VWR</td><td>98178853</td><td>EdU incorporation analysis</td></tr><tr><td>Tissue-Plus optimal cutting temperature compound&amp;nbsp;</td><td>Scigen</td><td>4563</td><td>Embedding medium, EdU incorporation analysis</td></tr><tr><td>cryostat Jung Fridgocut 2800E</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>CM3035S</td><td>EdU incorporation analysis</td></tr><tr><td>microscope slides Super-Frost plus Menzel glass</td><td>Thermo Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td>EdU incorporation analysis</td></tr><tr><td>EdU Click-iT chemistry kit</td><td>Molecular Probes</td><td>C10338</td><td>EdU incorporation analysis</td></tr><tr><td>FluorSave</td><td>Calbiochem</td><td>D00170200</td><td>Mounting medium, EdU incorporation analysis</td></tr><tr><td>coverslips</td><td>VWR</td><td>ECN631-1575</td><td>EdU incorporation analysis</td></tr><tr><td>fluorescent microscope</td><td>Nikon</td><td>Eclipse 80i</td><td>EdU incorporation analysis</td></tr><tr><td>confocal scanning microscope</td><td>Olympus</td><td>Fluoview FV1000</td><td>EdU incorporation analysis</td></tr><tr><td>Volocity software</td><td>PerkinElmer</td><td>Volocity 6.3</td><td>EdU incorporation analysis</td></tr></tbody></table>

induction of hypoxia in living frog and zebrafish embryos

Hier stellen wir ein neuartiges System zur Hypoxie-Induktion vor, das wir entwickelt haben, um die Auswirkungen von Hypoxie in Wasserorganismen wie Frosch und Zebrafisch-Embryonen zu untersuchen. Unser System besteht aus einer Kammer mit einem einfachen Aufbau, der dennoch robust ist, um eine spezifische Sauerstoffkonzentration und Temperatur in jeder experimentellen Lösung der Wahl zu induzieren und aufrechtzuerhalten. Das dargestellte System ist sehr kostengünstig, aber hochfunktionell, ermöglicht die Induktion und Erhaltung von Hypoxie für direkte Experimente in vivo und für verschiedene Zeiträume bis zu 48 h. Um die Wirkungen von Hypoxie zu überwachen und zu untersuchen, haben wir zwei Methoden angewendet - die Messung der Ebenen des Hypoxie-induzierbaren Faktors 1alpha (HIF-1α) in ganzen Embryonen oder spezifischen Geweben und die Bestimmung der retinalen Stammzellproliferation durch 5-Ethinyl-2&#39;- Desoxyuridin (EdU) Einarbeitung in die DNA. HIF-1α-Spiegel können als allgemeiner Hypoxie-Marker im ganzen Embryo oder Gewebe dienenDer Wahl, hier embryonale Netzhaut. EdU-Inkorporation in die proliferierenden Zellen der embryonalen Retina ist eine spezifische Ausgabe der Hypoxie-Induktion. So haben wir gezeigt, dass hypoxische embryonale Netzhautvorläufer die Proliferation innerhalb von 1 h der Inkubation unter 5% Sauerstoff sowohl von Frosch als auch von Zebrafischembryonen verringern. Einmal gemeistert, kann unser Setup für die Verwendung mit kleinen aquatischen Modellorganismen, für direkte in vivo Experimente, jede gegebene Zeitspanne und unter normaler, hypoxischer oder hyperoxischer Sauerstoffkonzentration oder unter irgendeinem anderen Gasgemisch eingesetzt werden.

Der Einsatz des hypoxischen Kammersystems, das wir hier vorstellen, erlaubt die Untersuchung der Wirkungen von Hypoxie einzeln und in vivo bei ganzen lebenden Tieren. Hypoxie kann durch die Platzierung von ganzen Frosch- oder Zebrafisch-Embryonen in die hypoxische Kammer induziert werden ( Abbildung 1 ) und wird bei verschiedenen Kombinationen von Bedingungen durchgeführt. Ein Bild unseres fertiggestellten Gaskammer-Aufbaus ist in <strong class="xf...

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Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Wir stellen ein neuartiges hypoxisches Kammersystem für die Verwendung mit Wasserorganismen wie Frosch und Zebrafisch-Embryonen vor. Unser System ist einfach, robust, kostengünstig und ermöglicht die Induktion und Aufrechterhaltung der Hypoxie in vivo und für bis zu 48 h. Wir präsentieren 2 reproduzierbare Methoden zur Überwachung der Wirksamkeit der Hypoxie.

Induktion von Hypoxie im lebenden Frosch und Zebrafisch Embryonen

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.7K Aufrufe.  University of Cambridge.  Wir stellen ein neuartiges hypoxisches Kammersystem für die Verwendung mit Wasserorganismen wie Frosch und Zebrafisch-Embryonen vor. Unser System ist einfach, robust, kostengünstig und ermöglicht die Induktion und Aufrechterhaltung der Hypoxie in vivo und für bis zu 48 h. Wir präsentieren 2 reproduzierbare Methoden zur Überwachung der Wirksamkeit der Hypoxie. 

Serie: Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic conservation, as well as similarities in cellular, molecular, and physiological processes, with other vertebrates including humans. During early ontogeny, zebrafish embryos are optically transparent, allowing researchers to visualize the dynamics of organogenesis using a simple stereomicroscope. Microbead implantation is a method that enables tissue manipulation through the alteration of factors in local environments. This allows researchers to assay the effects of any number of signaling molecules of interest, such as secreted peptides, at specific spatial and temporal points within the developing embryo. Here, we detail a protocol for how to manipulate and implant beads during early zebrafish development.

The zebrafish is an excellent model system for genetic and developmental studies. Bead implantation is a valuable tissue manipulation technique that can be used to interrogate developmental mechanisms by introducing alterations in local cellular environments. This protocol describes how to perform microbead implantation in the zebrafish embryo.

Microbead Implantation im Zebrafischembryo

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in vivo imaging techniques can provide a clear window into these processes in the living organism. For example, dividing cells and their progeny can be followed in real time as the nervous system forms. In recent years, technical advances in multicolor techniques have expanded the types of questions that can be investigated. The multicolor Brainbow approach can be used to not only distinguish among like cells, but also to color-code multiple different clones of related cells that each derive from one progenitor cell. This allows for a multiplex lineage analysis of many different clones and their behaviors simultaneously during development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells over real time within the developing zebrafish nervous system. This is particularly useful for following cellular interactions among like cells, which are difficult to label differentially using traditional promoter-driven colors. Our approach can be used for tracking lineage relationships among multiple different clones simultaneously. The large datasets generated using this technique provide rich information that can be compared quantitatively across genetic or pharmacological manipulations. Ultimately the results generated can help to answer systematic questions about how the nervous system develops.

In vivo imaging is a powerful tool that can be used to investigate the cellular mechanisms underlying nervous system development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells in real time within the developing zebrafish nervous system.

Visualisierung des sich entwickelnden Gehirns bei lebenden Zebrafischen mit Brainbow und Zeitraffer-Konfokalbildnis

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

Zwei-Photonen-Based Photoaktivierung in Live Zebrafischembryonen

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Biologie

Untersuchung der Entwicklung mit optogenetischer Signalmanipulation im Zebrafisch

Optogenetic Signaling Activation in Zebrafish Embryos

Signaling pathways orchestrate fundamental biological processes, including development, regeneration, homeostasis, and disease. Methods to experimentally manipulate signaling are required to understand how signaling is interpreted in these wide-ranging contexts. Molecular optogenetic&#160;tools can provide reversible, tunable manipulations of signaling pathway activity with a high degree of spatiotemporal control and have been applied in vitro, ex vivo, and in vivo. These tools couple light-responsive protein domains, such as the blue light homodimerizing light-oxygen-voltage sensing (LOV) domain, with signaling effectors to confer light-dependent experimental control over signaling. This protocol provides practical guidelines for using the LOV-based bone morphogenetic protein (BMP) and Nodal signaling activators bOpto-BMP and bOpto-Nodal in the optically accessible early zebrafish embryo. It describes two control experiments: A quick phenotype assay to determine appropriate experimental conditions, and an immunofluorescence assay to directly assess signaling. Together, these control experiments can help establish a pipeline for using optogenetic tools in early zebrafish embryos. These strategies provide a powerful platform to investigate the roles of signaling in development, health, and physiology.

Autor im Rampenlicht: Manipulation der Signalübertragung in Zebrafischembryonen, um Entscheidungen über das Schicksal von Zellen zu entschlüsseln 

Optogenetic manipulation of signaling pathways can be a powerful strategy to investigate how signaling is decoded in development, regeneration, homeostasis, and disease. This protocol provides practical guidelines for using light-oxygen-voltage sensing domain-based Nodal and bone morphogenic protein (BMP) signaling activators in the early zebrafish embryo.

Optogenetische Signalaktivierung in Zebrafischembryonen

Signaling pathways orchestrate fundamental biological processes, including development, regeneration, homeostasis, and disease. Methods to experimentally ...

Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function. Our studies have found that dying cells send signals to their live neighbors to form and contract a ring of actin and myosin that ejects it out from the epithelial sheet while closing any gaps that might have resulted from its exit, a process termed cell extrusion1. The optical clarity of developing zebrafish provides an excellent system to visualize extrusion in living epithelia. Here we describe a method to induce and image extrusion in the larval zebrafish epidermis. To visualize extrusion, we inject a red fluorescent protein labeled probe for F-actin into one-cell stage transgenic zebrafish embryos expressing green fluorescent protein in the epidermis and induce apoptosis by addition of G418 to larvae. We then use time-lapse imaging on a spinning disc confocal microscope to observe actin dynamics and epithelial cell behaviors during the process of apoptotic cell extrusion. This approach allows us to investigate the extrusion process in live epithelia and will provide an avenue to study disease states caused by the failure to eliminate apoptotic cells.

Dying cells are extruded from epithelial tissues by concerted contraction of neighboring cells without disrupting barrier function. The optical clarity of developing zebrafish provides an excellent system to visualize extrusion in living epithelia. Here we describe methods to induce and image extrusion in the larval zebrafish epidermis at cellular resolution.

Live-Bildgebung von Zell Extrusion aus der Epidermis der Entwicklung von Zebrafisch

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function.  Our studies have found ...

Triggering Cell Stress and Death Using Conventional UV Laser Confocal Microscopy

Using a standard confocal setup, a UV ablation method can be utilized to selectively induce cellular injury and to visualize single-cell responses and cell-cell interactions in the CNS in real-time. Previously, studying these cell-specific responses after injury often required complicated setups or the transfer of cells or animals into different, non-physiological environments, confounding immediate and short-term analysis. For example, drug-mediated ablation approaches often lack the specificity that is required to study single-cell responses and immediate cell-cell interactions. Similarly, while high-power pulsed laser ablation approaches provide very good control and tissue penetration, they require specialized equipment that can complicate real-time visualization of cellular responses. The refined UV laser ablation approach described here allows researchers to stress or kill an individual cell in a dose- and time-dependent manner using a conventional confocal microscope equipped with a 405-nm laser. The method was applied to selectively ablate a single neuron within a dense network of surrounding cells in the zebrafish spinal cord. This approach revealed a dose-dependent response of the ablated neurons, causing the fragmentation of cellular bodies and anterograde degeneration along the axon within minutes to hours. This method allows researchers to study the fate of an individual dying cell and, importantly, the instant response of cells-such as microglia and astrocytes-surrounding the ablation site.

Targeted manipulations to cause directed stress or death in individual cells have been relatively difficult to accomplish. Here, a single-cell-resolution ablation approach to selectively stress and kill individual cells in cell culture and living animals is described based on a standard confocal UV laser.

Das Auslösen Zellstress und Tod unter Verwendung von herkömmlichen UV-Laser konfokale Mikroskopie

Using a standard confocal setup, a UV ablation method can be utilized to selectively induce cellular injury and to visualize single-cell responses and ...

Neurowissenschaften

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these relationships will help to understand the underlying etiology for a range of diseases linked with mitochondrial dysfunction, such as diabetes and obesity. Recent advances in instrumentation, has enabled the monitoring of distinct parameters of mitochondrial function in cell lines or tissue explants. Here we present a method for a rapid and sensitive analysis of mitochondrial function parameters in vivo during zebrafish embryonic development using the Seahorse bioscience XF 24 extracellular flux analyser. This protocol utilizes the Islet Capture microplates where a single embryo is placed in each well, allowing measurement of bioenergetics, including: (i) basal respiration; (ii) basal mitochondrial respiration (iii) mitochondrial respiration due to ATP turnover; (iv) mitochondrial uncoupled respiration or proton leak and (iv) maximum respiration. Using this approach embryonic zebrafish respiration parameters can be compared between wild type and genetically altered embryos (mutant, gene over-expression or gene knockdown) or those manipulated pharmacologically. It is anticipated that dissemination of this protocol will provide researchers with new tools to analyse the genetic basis of metabolic disorders in vivo in this relevant vertebrate animal model.

Zebrafish represent a powerful vertebrate model that has been under-utilised for metabolic studies. Here we describe a rapid way to measure the in vivo metabolic profile of developing zebrafish that allows the comparison of different mitochondrial function parameters between genetically or pharmacologically manipulated embryos, thereby increasing the applicability of this organism.

Metabolic-Profil-Analyse von Zebrafischembryonen

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo. The small size and relative transparency of zebrafish embryos make them particularly useful for the visual examination of processes such as heart and vascular development. In several recent studies transgenic zebrafish that express EGFP in vascular endothelial cells were used to image and analyze complex vascular networks in the brain and retina, using confocal microscopy. Descriptions are provided to prepare, treat and image zebrafish embryos that express enhanced green fluorescent protein (EGFP), and then generate comprehensive 3D renderings of the cerebrovascular system. Protocols include the treatment of embryos, confocal imaging, and fixation protocols that preserve EGFP fluorescence. Further, useful tips on obtaining high-quality images of cerebrovascular structures, such as removal the eye without damaging nearby neural tissue are provided. Potential pitfalls with confocal imaging are discussed, along with the steps necessary to generate 3D reconstructions from confocal image stacks using freely available open source software.

Imaging of cerebrovascular development in larval zebrafish is described. Techniques to facilitate 3D imaging and modify cerebrovascular development using chemical treatments are also provided.

Imaging und 3D-Rekonstruktion der zerebrovaskuläre Strukturen in embryonalen Zebrafisch

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo.  The small size and relative transparency of zebrafish embryos make ...

Induktion von Hypoxie im lebenden Frosch und Zebrafisch Embryonen

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Microbead Implantation im Zebrafischembryo

Visualisierung des sich entwickelnden Gehirns bei lebenden Zebrafischen mit Brainbow und Zeitraffer-Konfokalbildnis

Zwei-Photonen-Based Photoaktivierung in Live Zebrafischembryonen

Optogenetische Signalaktivierung in Zebrafischembryonen

Optogenetische Signalaktivierung in Zebrafischembryonen

Optogenetische Signalaktivierung in Zebrafischembryonen

Live-Bildgebung von Zell Extrusion aus der Epidermis der Entwicklung von Zebrafisch

Das Auslösen Zellstress und Tod unter Verwendung von herkömmlichen UV-Laser konfokale Mikroskopie

Metabolic-Profil-Analyse von Zebrafischembryonen

Imaging und 3D-Rekonstruktion der zerebrovaskuläre Strukturen in embryonalen Zebrafisch