Der Enzymschutzassay ermöglicht es, das Ausmaß der Staph aureus-Internalisierung und seine Überlebensfähigkeit in adhärenten Zellen sowie die Wirksamkeit der antimikrobiellen Verbindung zu untersuchen. Der verbesserte Enzymschutz-Assay vereinfacht die technische Handhabung erheblich und ermöglicht die Rückgewinnung internalisierter Bakterien aus schwach adhärenten Zellen und Zellen in Suspension. Das Verfahren wird Josselin Rigaill, Arzt und Doktorand aus meinem Labor, demonstrieren.
Zwei Tage vor dem Infektionstest säen Sie A549-Epithelzellen mit einer Dichte von 2,0 mal 10 bis zu den fünften Zellen pro Milliliter pro Vertiefung einer 24-Well-Platte aus und inkubieren die Zellen 48 Stunden bei 36 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid, bis sie 100% Konfluenz erreichen. Entfernen und verwerfen Sie am Tag des Tests das verbrauchte Kulturmedium aus den drei Vertiefungen, die für die Zählung der A549-Zellen vorgesehen sind, und fügen Sie einen Milliliter vollständiges Infektionsmedium hinzu, das fünf Mikrogramm pro Milliliter Hoechst 33342 und ein Mikrogramm pro Milliliter Propidiumiodid enthält. Inkubieren Sie die Zellen für 30 Minuten, zählen Sie dann mit einem Weitfeldfluoreszenzmikroskop die Anzahl der Zellen und berechnen Sie die Zelllebensfähigkeit.
Um die Bakteriensuspension herzustellen, geben Sie 25 Milliliter des vollständigen Infektionsmediums in einem Röhrchen ab und wärmsten Sie es bei 36 Grad Celsius vor. Als nächstes stellen Sie die Staphylococcus aureus-Suspension mit einem Zelldichtemessgerät auf einen OD von 0,5 in einem vollständigen Infektionsmedium ein und bereiten Sie dann 20 Milliliter Bakteriensuspension für die Zellimpfung vor, indem Sie die Kultur in einem vollständigen Infektionsmedium verdünnen, um einen MOI von eins entsprechend der Anzahl der Zellen pro Well zu erreichen. Als nächstes bestimmen Sie mit einem automatischen Spiralplatter die Staphylococcus aureus-Last der verdünnten Bakteriensuspension, die für den Zellimpfungsschritt verwendet werden soll, und inkubieren Sie die Agarplatten für 18 bis 24 Stunden bei 36 Grad Celsius.
Zählen Sie am nächsten Tag die Anzahl der Kolonien mit einem Koloniezähler, um den genauen MOI für jeden getesteten Stamm zu berechnen. Beobachten Sie vor der Zellimpfung jede Vertiefung der 24-Well-Platte durch Mikroskopie mit geringer Vergrößerung, um sicherzustellen, dass die Zellen gesund sind und wie erwartet wachsen, entfernen und verwerfen Sie dann das verbrauchte Zellkulturmedium von der 24-Well-Platte und fügen Sie 500 Mikroliter der Bakteriensuspension zu jeder Vertiefung hinzu, die 100% konfluente Zellen enthält. Inkubieren Sie die Zellen für zwei Stunden bei 36 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid.
Um die intrazellulären Bakterien mit dem verbesserten Enzymschutzassay zu quantifizieren, bereiten Sie 4x Lysepuffer, 2% Triton X-100, Trypsin-EDTA und Lysostaphin in Arbeitslösungen vor, wie im Textmanuskript erwähnt. Als nächstes bereiten Sie 6,25 Milliliter vollständiges Infektionsmedium vor, das mit Lysostaphin ergänzt wird, indem sechs Milliliter vollständiges Infektionsmedium zu 250 Mikrolitern der Lysostaphin-Arbeitslösung hinzugefügt werden. Geben Sie dann 250 Mikroliter des kompletten Infektionsmediums, ergänzt mit Lysostaphin, in jede Vertiefung und rühren Sie die Platte vorsichtig, indem Sie die Platte von Hand schwenken.
Damit das Lysostaphin die extrazellulären Bakterien abtöten kann, inkubieren Sie die Zellen eine Stunde lang bei 36 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid, inaktivieren Sie dann das Lysostaphin, indem Sie 10 Mikroliter Proteinase K bei 20 Mikrogramm pro Milliliter in jede Vertiefung geben und die Zellen für zwei Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Als nächstes fügen Sie 250 Mikroliter 4x Lysepuffer hinzu, um die Zellen durch osmotischen Schock zu lysieren, und inkubieren Sie die Zellen für 10 Minuten bei 36 Grad Celsius. Nach der Inkubation pipettieren Sie das Zelllysat mehrmals nach oben und unten, um sicherzustellen, dass die Zellen vollständig lysiert und homogenisiert sind, verwenden Sie dann einen automatischen Spiralplattierer, um die Staphylococcus aureus-Last jedes Bohrlochs zu bestimmen, und inkubieren Sie die Agarplatten für 18 bis 24 Stunden bei 36 Grad Celsius.
Zählen Sie am nächsten Tag die Anzahl der Kolonien mit einem Koloniezähler, um die intrazelluläre Staphylococcus aureus-Belastung jedes Bohrlochs zu berechnen. Die Internalisierung von zwei Stämmen von Staphylococcus aureus durch A549-Epithelzellen ist hier dargestellt. Unter Verwendung des Enzymschutzassays, der Waschungen zur Entfernung von Lysostaphin enthält, betrugen die mittleren intrazellulären Belastungen 4,46 und 0,49 log-KBE pro Milliliter für den SF8300-Wildtyp und die isogene Mutante, der die fnbA- bzw. B-Gene fehlen.
Unter Verwendung des verbesserten Enzymschutzassays, der Proteinase K zur Inaktivierung von Lysostaphin verwendet, betrugen die Belastungen 4,53 bzw. 0,56 log kbE pro Milliliter. Die intrazelluläre Aktivität von Vancomycin, Rifampicin und Levofloxacin gegen Staphylococcus aureus, gemessen mit einem Enzymschutzassay, ist hier dargestellt. Die mittleren intrazellulären Belastungen betrugen 4,57 kbE pro Milliliter für die Kontrolle, 4,51 für Vancomycin, 3,03 für Rifampicin und 2,91 für Levofloxacin.
Intensive Wäschen zur Entfernung des Enzyms neigen dazu, die am stärksten infizierten Zellen zu lösen, was zu ungenauen Ergebnissen führen und die Verwendung des verbesserten Protokolls unterstützen kann. Der verbesserte Enzymschutz-Assay erleichtert die Untersuchung der Staph-Aureus-Internalisierung mit Organoid und kann leicht an ein High-Content-Screening-System angepasst werden, das verwendet wird, indem es
