Im Gegensatz zu anderen Stoffwechselwegen, wie z.B. der Glukoseentsorgung, wird die Fettsäuresynthese nicht routinemäßig bewertet, was zu unvollständigen Interpretationen des Stoffwechselstatus führt. Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass sie relativ nicht-invasiv ist und wahrscheinlich den Fluss der Fettsäuresynthese besser widerspiegelt als die Verwendung von isotopenmarkierter Glukose, bei der sich Änderungen in der vorgelagerten Glukosehandhabung auf die Ergebnisse auswirken können. Hier konzentrieren wir uns auf braunes Fettgewebe, aber diese Methode ist potenziell nützlich, um jedes Gewebe in jedem Mausmodell zu untersuchen.
Legen Sie die Proben zunächst auf Trockeneis. Nehmen Sie ein voretikettiertes Mikrozentrifugenröhrchen, stellen Sie es auf eine Analysenwaage und tarieren Sie die Waage. Dann eine Pinzette und ein Skalpell oder eine Rasierklinge aus Stahl für 10 bis 20 Sekunden zum Abkühlen auf Trockeneis legen.
Nehmen Sie die gefrorene Gewebeprobe mit der Pinzette aus dem Röhrchen und legen Sie sie auf ein Kunststoff-Gewichtsschiffchen, das auf einem flachen Trockeneisblock oder einer anderen vorgekühlten Oberfläche positioniert werden kann. Zerlegen Sie mit dem Skalpell oder der Rasierklinge aus Stahl einen kleinen Teil des Gewebes, der einem Gewicht von 5 bis 15 Milligramm entspricht, und legen Sie ihn in das Mikrozentrifugenröhrchen. Notieren Sie das genaue Gewicht und wiederholen Sie den Vorgang für jede Probe.
Zu jeder Probe wird ein Mikroliter pro Milligramm 10 Millimolar Hexadecansäure D31 gegeben, gefolgt von drei Fünf-Millimeter-Edelstahlperlen. Dann fügen Sie 250 Mikroliter Methanol, 250 Mikroliter Wasser und 500 Mikroliter Chloroform zu jeder Probe mit Kügelchen hinzu. Legen Sie die Röhrchen in einen vorgekühlten Block einer Mahlmühle und mischen Sie die Proben fünf Minuten lang mit einer Vibrationsfrequenz von 25 Hertz.
Entfernen Sie die Kügelchen mit einem Magneten und zentrifugieren Sie die Proben bei 12.000 G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Mit einer Mikropipette wird ein festes Volumen der unteren Phase jeder Probe in entsprechend beschriftete Mikrozentrifugenröhrchen gegeben. Geben Sie 500 Mikroliter Chloroform in die verbleibende Probe und wiederholen Sie diese Schritte.
Die Röhrchen mit der vereinigten unteren Phase unter Stickstoffgas oder in ein chloroformbeständiges, gekühltes Zentrifugalvakuum bei vier Grad Celsius stellen, bis sie vollständig trocken sind. Pipettieren Sie 98 Milliliter wasserfreies Methanol in eine Glasmedienflasche. Und langsam zwei Milliliter wasserfreie Schwefelsäure in den Abzug geben, um 2%ige Schwefelsäure in Methanol zu erhalten.
Mischen Sie, indem Sie die geschlossene Flasche schwenken. 500 Mikroliter dieser 2%igen Schwefelsäure in Methanollösung zu jeder Probe geben und kurz vortexen. Die Proben werden zwei Stunden lang bei 50 Grad Celsius auf dem Heizblock inkubiert und zu jeder Probe 100 Mikroliter gesättigte Natriumchloridlösung und 500 Mikroliter Hexan gegeben.
Die Proben eine Minute lang bei Raumtemperatur kräftig vorziehen und eine Minute ruhen lassen. Danach sollten die beiden Phasen erkennbar sein. Sammeln Sie die obere Phase in einem frischen Mikrozentrifugenröhrchen.
Wiederholen Sie dann die Zugabe von Hexan. Und nach der Phasentrennung sammeln Sie die Proben der zweiten oberen Phase in dieselben markierten Röhrchen. Trocknen Sie die Proben bei Raumtemperatur unter Stickstoffgas und resuspendieren Sie die Proben in 20 Mikrolitern Hexan pro Milligramm des ursprünglichen Gewebegewichts.
Überführen Sie die Proben sofort in ein Glas-Gaschromatographie-Fläschchen mit Glaseinsatz. Injizieren Sie die Proben in ein einzelnes vierfaches Gaschromatographie-Massenspektrometer, um die Häufigkeit von Fettsäuremethylestern oder FAMEs-Isotopologen zu bestimmen. Injizieren Sie einen Mikroliter Probe in einen geteilten oder spaltfreien Einlass bei einer Eintrittstemperatur von 270 Grad Celsius unter Verwendung von Helium als Trägergas.
Mischen Sie in beschrifteten Mikrozentrifugenröhrchen mit sicherem Verschluss 10 Mikroliter jeder Plasmaprobe oder standardmäßig vier Mikroliter 10 molares Natriumhydroxid und vier Mikroliter 5%iges Aceton in Acetonitril. Führen Sie dies für jede Probe in dreifacher Ausführung durch. Nach der Inkubation der Proben über Nacht bei Raumtemperatur werden 450 bis 550 Milligramm Natriumsulfat zu jeder Probe gegeben, 600 Mikroliter Chloroform in jedes Röhrchen im Abzug gegeben und 15 Sekunden lang kräftig gewirbelt.
Die Proben werden zwei Minuten lang bei 300 g zentrifugiert. Nehmen Sie beschriftete Glas-GCMS-Fläschchen mit Glaseinsätzen und übertragen Sie das Dreifache und dann 80 Mikroliter Aliquots des Überstandes von jeder Probe in die Fläschchen. Verschließen Sie die Fläschchen für die GCMS-Analyse fest.
Der prozentuale Anteil der D2O-Anreicherung im Plasma von Mäusen über mehrere Zeitpunkte ist hier dargestellt. Es wurde festgestellt, dass das Körperwasser im Bereich von 2,5 bis 6 % angereichert ist, dass ein Ausgangsniveau der Deuteriumanreicherung im Körperwasser schnell in einer Stunde erreicht und für die Dauer der Studie aufrechterhalten wird. Die Massenisotopologverteilung von Palmitat im braunen Fettgewebe nach dreitägiger D2O-Verabreichung bei Raumtemperatur und Thermoneutralität ist hier dargestellt.
Dieses Ergebnis zeigt eine höhere M1- und M2-Deuteriumanreicherung bei Raumtemperatur. In dieser Abbildung sind die Anreicherung der Molaren des braunen Fettgewebes und die Anreicherung der Plasmamolaren einer Reihe von Fettsäuren nach dreitägiger D2O-Verabreichung bei Raumtemperatur und Thermoneutralität dargestellt. Die kältere Temperaturanreicherung wurde in einem breiten Spektrum von Fettsäuren im braunen Fettgewebe gefunden.
Bemerkenswert ist, dass die Gesamtfettsäureanreicherung im Plasma nicht dem gleichen Trend folgt wie braunes Fettgewebe, sondern die Fettsäureanreicherung mit Thermoneutralität erhöht wird. Diese Bilder stellen die Gesamthäufigkeit und das de novo synthetisierte Palmitat im braunen Fettgewebe nach dreitägiger D2O-Verabreichung dar. Das Ergebnis zeigt eine Steigerung der Gesamtpalmitatsynthese bei Raumtemperatur.
Seien Sie vorsichtig, wenn Sie Fettsäuren auf dem GCMS laufen lassen. Stellen Sie sicher, dass Palmitat nicht überladen ist, da dies zu künstlich hohen Isotopenanreicherungswerten führen kann. Stellen Sie außerdem sicher, dass bei der Analyse von Aceton auf dem GCMS kein Hintergrund-Aceton-Peak vorhanden ist, bevor Sie die Proben ausführen, also lassen Sie Leerzeichen laufen, um jegliches Aceton aus dem System zu entfernen.
Diese Methode betrachtet die Gesamtfettsäuren über mehrere Lipidklassen hinweg, aber wenn Sie verstehen möchten, wie sich die Fettsäuresynthese auf bestimmte Lipidklassen auswirkt, können Sie diese Lipidklassen zunächst durch Chromatographie trennen und dann Fettsäuren aus diesen Fraktionen extrahieren. Da die Lipogenese einen wichtigen Beitrag zur normalen Entwicklung, aber auch zu vielen Krankheiten leistet, kann dieses Protokoll in vielen Bereichen nützlich sein.
