Dieses Protokoll bietet Einblicke in Algenblüten und wie toxische Algenarten effektiv überwacht werden können. Das Verfahren hilft, eine Frühwarnung vor Algenblüten zu bieten, um die Gemeinschaft vor damit verbundenen Schäden zu schützen. Die Metabarcoding-Analyse kann viele Arten in einer Probe gleichzeitig nachweisen, erfordert jedoch komplizierte Verfahren.
Dieses Protokoll erklärt visuell jeden Schritt, um menschliche Fehler während der Analyse zu minimieren. Die Mikroskopieverfahren werden von Henry Cameron von der Antofagasta University, die Probensammlung von Jonathan Vilugron vom Instituto de Fomento Pesquero, die Probenvorbehandlung von Karen Vergara von der Los Lagos University und die Metabarcoding-Analyse von Ignacio Rilling und Marco Campos von der La Frontera University demonstriert. Beginnen Sie mit dem Sammeln von drei Litern Wasserprobe von einem Zielpunkt.
Filtern Sie einen Liter des Wassers für die 16S rRNA-Analyse durch eine Tandemfiltration, um die frei lebenden und anhaftenden Bakterien zu trennen. Als nächstes filtern Sie einen weiteren Liter Wasser für die 18S rRNA-Analyse durch eine einzige Filtration mit einer 0,2-Mikron-Membran. Schneiden Sie dann mit einer sterilen chirurgischen Schere die gefilterte Membran in zwei Hälften, wickeln Sie eine Hälfte mit Aluminiumfolie zur Lagerung ein und fahren Sie mit der anderen Hälfte mit der DNA-Extraktion mit der Chelex-Methode fort.
Für die mikroskopische Analyse einen Milliliter der Wasserprobe mit einer Pipette auf einen Ein-Milliliter-Gitterobjektträger übertragen. Beobachten Sie die Probe unter dem Mikroskop und notieren Sie die Namen und die Menge der Phytoplanktonarten. Reinigen Sie die Pipetten im Laminarhaubenschrank mit 70% Ethanol, gefolgt von einer UV-Einwirkung für 30 Minuten.
Für die erste PCR-Amplicon-Generation aliquot 22,5 Mikroliter der Master-Mischung in einem Acht-Röhrchen-Streifen gefolgt von 2,5 Mikrolitern der DNA-Probe, dann führen Sie den ersten PCR-Zyklus durch. Als nächstes bereiten Sie 100 Milliliter eines 2% Agarose TBE Gels mit 10 Mikrolitern einer Nukleinsäuregelfärbung vor. Sobald das Gel fertig ist, laden Sie eine Mischung mit 1,5 Mikrolitern eines DNA-Beladungsfarbstoffs und vier Mikrolitern des PCR-Produkts und führen Sie 30 Minuten lang eine Elektrophorese bei 100 Volt durch.
Stellen Sie dann das Gel unter UV-Licht dar und bestätigen Sie das Vorhandensein eines 500 bis 600 Basenpaarbandes. Fehlende Amplikone können manchmal gelöst werden, indem die Probe mit Wasser auf das 1.000-fache verdünnt wird. Als nächstes verwenden Sie ein auf magnetischen Perlen basierendes DNA-Reinigungssystem, um die ersten PCR-Produkte zu reinigen, übertragen dann 20 Mikroliter jedes gereinigten ersten PCR-Produkts auf eine neue 96-Well-Platte und versiegeln die Platte mit einem Microseal-Film.
Lagern Sie die Platte bei minus 20 Grad Celsius bis zum nächsten Schritt. Für die Indexierung durch zweite PCR, nachdem alle Index eins und Index zwei Primer auf eine ein mikromolare Konzentration mit PCR-Grade-Wasser in acht Röhrchen-PCR-Streifen verdünnt wurden, positionieren Sie die Index-One-Primer in einer horizontalen Reihe und indizieren Sie zwei Primer in einer vertikalen Reihe. Dann unter Verwendung einer Mehrkanalpipette mit 2,5 Mikrolitern Index eine Grundierung zu jeder Vertiefung einer neuen 96-Well-Platte.
Als nächstes fügen Sie 12,5 Mikroliter einer Heißstartformulierung zu jeder Vertiefung hinzu. Fügen Sie dann 2,5 Mikroliter Index zwei Primer und 7,5 Mikroliter des gereinigten ersten PCR-Produkts zu jeder Vertiefung hinzu. Nachdem Sie die Platte 10 Mal durch Pipettieren auf und ab gemischt haben, bedecken Sie die Platte mit einem Microseal-Film und führen Sie den zweiten PCR-Zyklus durch.
Nachdem die PCR abgeschlossen ist, legen Sie das DNA-Screen-Band in einen Fragmentanalysator. Mischen Sie zwei Mikroliter Probenpuffer in drei Mikroliter des zweiten PCR-Amplikons in neuen acht Röhrchenstreifen und führen Sie die Streifen in den Fragmentanalysator ein, um die Analyse zu starten. Stellen Sie sicher, dass die zweiten PCR-Amplikone ungefähr 613 Basenpaare für 16S- und 18S-rRNA-Gene sind.
Reinigen Sie die zweiten PCR-Produkte mit einem DNA-Cleanup-System für magnetische Kügelchen, wie zuvor gezeigt. Messen Sie dann ihre DNA-Konzentration mit einem Nukleinsäure-Quantifizierungsspektrophotometer. Verdünnen Sie in einer neuen 200 Mikroliter 96-Well-Platte jedes gereinigte zweite PCR-Produkt mit sterilem PCR-Wasser auf vier Nanomol.
Im nächsten Schritt muss das Protokoll ohne Unterbrechung ausgeführt werden. Aliquot drei Mikroliter von jedem verdünnten zweiten PCR-Produkt in einem neuen sterilen 1,5-Milliliter-Röhrchen, um eine gepoolte Bibliothek zu erstellen. Halten Sie die Röhre immer bei vier Grad Celsius.
Entfernen Sie einen Tag vor der Sequenzierung eine vorgefüllte gebrauchsfertige Reagenzkartusche von minus 20 Grad Celsius und legen Sie sie zum Auftauen auf vier Grad Celsius. Stellen Sie am Tag der Sequenzierung einen für 1,5 Milliliter geeigneten Wärmeblock auf 96 Grad Celsius und legen Sie den Hybridisierungspuffer auf Eis. Verdünnen Sie dann Natriumhydroxid in molekularer Qualität mit Wasser und verdünnen Sie eine gebrauchsfertige Kontrollbibliothek mit TE-Puffer.
Mischen Sie 16 Mikroliter der vier Nanomol- oder gepoolten Probenbibliothek mit vier Mikrolitern der Kontrollbibliothek in einem neuen Röhrchen, das als eins gekennzeichnet ist. Mischen Sie dann 10 Mikroliter der Probe aus Röhrchen eins mit 10 Mikrolitern Natriumhydroxid in einem neuen Röhrchen, das als zwei gekennzeichnet ist. Nach dem Wirbeln und einer kurzen Drehung fünf Minuten lang das rohr zwei bei Raumtemperatur inkubieren und dann 980 Mikroliter Hybridisierungspuffer hinzufügen.
Als nächstes mischen Sie in einem neuen Röhrchen, das als drei gekennzeichnet ist, 260 Mikroliter der Probe aus Röhrchen zwei mit 390 Mikrolitern Hybridisierungspuffer. Nachdem Sie den Inhalt durch Invertieren der Tube gemischt haben, inkubieren Sie ihn bei 96 Grad Celsius für zwei Minuten, gefolgt von einer Inkubation auf Eis für zwei Minuten. Als nächstes nehmen Sie die Patrone aus dem Kühlschrank und richten Sie das Probenblatt für die Sequenzierung mit jedem entsprechenden Index eins und Index zwei Adapter ein.
Nachdem Sie die Durchflusszelle aus dem MiSeq V3-Kit entfernt haben, reinigen Sie die Durchflusszelle vorsichtig mit sterilem PCR-Wasser molekularer Qualität. Laden Sie das gesamte Volumen des dritten Schlauchs in die Patrone. Wählen Sie dann in der Gerätebetriebssoftware die Sequenzierung aus und befolgen Sie die Anweisungen zum Einsetzen der Durchflusszelle, des Einbaupuffers und der Kartusche.
Legen Sie abschließend das Probenblatt ein und drücken Sie Ausführen, um die Reaktion zu starten. Dieser Sequenzlauf dauert drei bis fünf Tage. Die 18S rRNA-Metabarcoding-Analyse zur Identifizierung von Algenarten im Meerwasser, die am 19. Februar 2019 in Metri Puerto Montt, Chile, gesammelt wurde, ergab 13.750 Messwerte mit über 30 Algenarten.
Die Navicula-Art war der dominierende Algo mit einer relativen Häufigkeit von 70,73%, auch für Micromonas-, Chaetoceros-, Scrippsiella- und Prorocentrum-Arten wurde eine ausreichende Häufigkeit beobachtet. Die Pseudochattonella-Art, einer der Hauptverursacher chilenischer schädlicher Algenblüten, hat eine Häufigkeit von 0,52%. In Übereinstimmung mit der 18S rRNA-Genanalyse zeigten mikroskopische Beobachtungen Navicula als dominante und Prorocentrum als nebensächliche Spezies.
Die 12,6% der kleinen, nicht identifizierbaren Phytoplanktonzellen, die durch Mikroskopie aufgezeichnet wurden, könnten Mikromonas sein, so die 18S rRNA-Ergebnisse. 16S rRNA Metabarcoding-Analyse zur Identifizierung von Bakterienarten in derselben Wasserprobe zeigte 31.758 Messwerte mit über 30 Bakterienarten. Die dominante freilebende Bakterienart war Amylibacter mit einer relativen Häufigkeit von 20,02%, gefolgt von Cladella mit 13,53% und Algiphilus mit 7,06%.
Die relative Häufigkeit aller Bakteriengattungen in Ordnungen, die über fünf Monate aus dem Meerwasser nachgewiesen wurden, wird aufgetragen und Zeit für die Analyse der Populationsänderung bestimmter Organismen benötigt. Es ist wichtig, besonders sauber zu sein. Eine Kontamination der Proben sollte durch alkoholhaltiges Tuch, UV-Licht oder Autoklavieren des Materials vermieden werden.
Verdünnte Lösungen sollten nicht wiederverwendet werden und Röhrchen sollten immer verschlossen werden. Der Algennachweis durch Metabarcoding muss mit der Mikroskopie gepaart werden. Die dominante Spezies kann durch Mikroskopie bestätigt werden, um sicherzustellen, dass keine menschlichen Fehler während der Metabarcodierungsprozesse auftreten.
Schädliche Algenblüten schädigen das marine Ökosystem und die Küstenwirtschaft. In Chile töten Algenblüten Zuchtlachse und schädigen Aguakulturen. Diese Metabarcoding-Analyse wird die Effizienz von Blütenwarnungen in Chile erhöhen.
