Dieses Protokoll beschreibt die Synthese eines Nanopartikelsystems, das in der Lage ist, Gene in vivo zum Schweigen zu bringen, indem siRNAs mit hoher Effizienz geliefert werden. Durch den einfachen Austausch des Targeting-Peptids und der siRNA-Nutzlast können die fusogenen Nanopartikel als potenzielle therapeutische Formulierung für Krankheiten verwendet werden, die eine In-vivo-Genmodulation erfordern. Wir haben bereits Ergebnisse veröffentlicht, die die fusogene Nanoplattform gegen grampositive bakterielle Infektionen verwenden, indem wir ein Gen zum Schweigen bringen, das für Entzündungen in Makrophagen kodiert, um chronische Entzündungen zu beenden.
Vor der Durchführung dieses Verfahrens eine Teflon-Ätzzelle, die einen Siliziumwafer enthält, in einer Drei-zu-eins-Lösung für Flusssäure zusammensetzen. Führen Sie einen Wechselstrom einer quadratischen Wellenform mit einer niedrigen Stromdichte von 50 Milliampere pro Zentimeter quadratisch für 0,6 Sekunden und einer hohen Stromdichte von 400 Milliampere pro Zentimeter für 0,36 Sekunden, die für 500 Zyklen wiederholt werden. Sobald die Ätzung abgeschlossen ist, entfernen Sie die Zelle aus dem Kreislauf und spülen Sie die Flusssäurelösung vorsichtig mit einer Spritze aus.
Dann dreimal mit Ethanol abspülen. Um die poröse Schicht aus dem Siliziumwafer zu heben, füllen Sie zunächst den Brunnen der Ätzzelle mit 10 Millilitern einer 1-zu-29-Flusssäurelösung. Führen Sie dann eine Konstante von 3,7 Milliampere pro Zentimeter quadratisch für 250 Sekunden aus.
Sobald die Ätzung abgeschlossen ist, entfernen Sie die Zelle aus dem Schaltkreis. Die poröse Siliziumschicht kann sichtbare Wellen haben, was auf eine Ablösung vom kristallinen Siliziumwafer hindeutet. Die Flusssäurelösung vorsichtig auswaschen und jeweils dreimal mit Ethanol und Wasser abspülen.
Mit einer Pipettenspitze den Umfang der porösen Siliziumschicht fest knacken, um eine vollständige Ablösung zu erhalten. Mit Ethanol die porösen Siliziumfragmente oder Chips aus der Teflon-Ätzzelle in ein Wägeboot zu sammeln. Dann übertragen Sie die Chips auf eine Glasflasche zur Lagerung.
Als nächstes ersetzen Sie das Ethanol in der Glasflasche, das die porösen Siliziumchips enthält, durch zwei Milliliter RNase-freies Wasser. Die Durchstechflasche mit Parafilm fest verriegeln und versiegeln. Legen Sie die Glasflasche in ein Beschallungsbad und hängen Sie so, dass das Volumen der porösen Siliziumchips vollständig unter der Oberfläche des Wasserbades untergetaucht ist.
Um einen signifikanten Wasserverlust während der Beschallung zu vermeiden, legen Sie einen mit Wasser gefüllten Volumekolben auf, der invertiert ist, so dass die Öffnung des Kolbens die Oberfläche des Wasserbades berührt. Dann beschallen Sie die porösen Siliziumchips 12 Stunden lang bei 35 Kilohertz mit einer HF-Leistung von 48 Watt. Nach der Beschallung die Glasflasche für eine Stunde auf eine flache Oberfläche legen, damit sich die größeren Partikel am Boden absetzen können.
Dann sammeln Sie den Überstand mit einer Pipette. In einer Glasdurchstechflasche 72,55 Mikroliter DMPC-Lösung, 15,16 Mikroliter DSPE-PEG-Lösung und 19,63 Mikroliter DOTAP-Lösung hinzufügen und durch Pipettieren mischen. Legen Sie die Durchstechflasche in eine Dunstabzugshaube mit einer lockeren Kappe, damit das Lösungsmittel über Nacht verdampfen kann.
Der getrocknete Film wird eine trübe, harte, gelartige Substanz am Boden der Durchstechflasche sein. Als nächstes legen Sie ein Mikrozentrifugenrohr mit 150 Mikroliterporen porösen Silizium-Nanopartikeln in ein zuvor vorbereitetes Eisbeschallungsbad. Unter einer 15-minütigen Ultraschallation, pipette 150 Mikroliter siRNA und 700 Mikroliter zweimolares Calciumchlorid in die porösen Silizium-Nanopartikel.
Entfernen Sie die Tube mit einem Milliliter siRNA-belasteter calciumbeschichteter poröser Silizium-Nanopartikel aus dem Beschallungsmittel. Füllen Sie einen breiten Becher mit entionisiertem Wasser. Einweichen Sie eine Polycarbonatmembran und vier Filterstützen, indem Sie sie auf der Wasseroberfläche schweben.
Dann montieren Sie ein Liposomen-Extrusionskit, indem Sie den Anweisungen des Herstellers folgen. Als nächstes hydratisieren Sie den getrockneten Lipidfilm in der Glasdurchstechflasche mit einem Milliliter der siRNA-belasteten calciumbeschichteten porösen Silizium-Nanopartikel. Pipette, bis sich alle Lipide vom Boden der Durchstechflasche gehoben haben und eine trübe, homogene Lösung beobachtet wird.
Fügen Sie der Glasflasche einen magnetischen Rührbalken hinzu und legen Sie die Durchstechflasche auf eine Kochplatte, um die Partikel auf 40 Grad Celsius zu erhitzen, während sie die Lösung 20 Minuten lang magnetisch rührt. Befestigen Sie anschließend eine leere Spritze an einer Seite des Extruders. Dann füllen Sie eine weitere Spritze mit einem Milliliter der lipidbeschichteten porösen Silizium-Nanopartikellösung und befestigen Sie die Spritze an der anderen Seite des Extruders.
Beginnen Sie die Extrusion, indem Sie den Kolben langsam einschieben, um die Partikel von einer Spritze durch die Polycarbonatmembran in die andere Spritze zu schieben. Wiederholen Sie dies 20 Mal. Sammeln Sie dann die extrudierten Partikel in einem Mikrozentrifugenrohr.
Bereiten Sie einen Peptidbestand mit einer Peptidkonzentration von einem Milligramm pro Milliliter in RNase-freiem Wasser vor. In der Mikrozentrifugenröhre, die die fusogenen lipidbeschichteten porösen Silizium-Nanopartikel enthält, 100 Mikroliter des Peptidbestands und Pipette schonend hinzufügen. Halten Sie das Rohr 20 Minuten lang statisch bei Raumtemperatur.
Um überschüssiges Peptid oder siRNA und andere Hilfsstoffe zu entfernen, waschen Sie in einem 30-Kilodalton-Zentrifugalfilter, indem Sie bei 5 000 mal g bei Raumtemperatur eine Stunde lang drehen. Zentrifugieren Sie zwei weitere Male mit einem Milliliter PBS unter den gleichen Einstellungen. Nach der Zentrifugation die letzten peptidkonjugierten fusogenlipidbeschichteten porösen Silizium-Nanopartikel in PBS in der gewünschten Konzentration wieder aufsetzen.
Die Partikel können mindestens 30 Tage lang bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden. Eine erfolgreiche Synthese von fusogenporösen Silizium-Nanopartikeln sollte eine homogene, leicht opake Lösung erzeugen, die 30 Tage lang gelagert und aufgetaut werden kann, ohne strukturelle Veränderungen zu verursachen. Wenn das Verhältnis und die Konzentration nicht optimiert werden, sowie wiederholte Frost-Tau-Zyklen kann dies bei der Belastung zur Aggregation führen.
Wenn die Partikel extrudiert werden, sollte der durchschnittliche hydrodynamische Durchmesser der durch dynamische Lichtstreuung gemessenen fusogenporösen Silizium-Nanopartikel etwa 200 Nanometer betragen und das durchschnittliche Zeta-Potenzial etwa sieben Millivolt. Nach der Oberflächenmodifikation mit Targeting-Peptiden sollte der Gesamtdurchmesser weniger als 230 Nanometer betragen, und das durchschnittliche Zeta-Potenzial sinkt auf minus 3,4 Millivolt. Die Fusion kann bestätigt werden, indem die fusogenen Lipide mit dem lipophilen Fluorophor DiI gekennzeichnet und die In-vitro-Lokalisation mittels konfokaler Mikroskopie beobachtet wird.
Eine erfolgreiche Fusion wird beobachtet, wenn die Lipide des fusogenporösen Silizium-Nanopartikels das DiI auf die Plasmamembran übertragen und unabhängig von Lysosomen lokalisiert werden. Eine erfolglose Fusion zeigt die DiI-Lokalisierung innerhalb des Zytoplasmas der Zelle und die Kolokalisierung mit Lysosomen. Dieses fusogene Nanopartikelsystem wird nun nicht nur bei bakteriellen Infektionen, sondern auch bei der Krebsadjuvantentherapie und Krebsimmuntherapie für therapeutische Anwendungen eingesetzt.
Dieses Protokoll kann weiter optimiert werden, um mehr als siRNAs zu laden. Das fusogene Nanopartikelsystem hat Potenzial bei der Beladung und Bereitstellung größerer anionischer Nutzlasten wie mRNAs und CRISPR/Cas9-Komplexe gezeigt.
