Dieses Protokoll kann verwendet werden, um konsistente Lipid-Nanopartikel zu formulieren, die MRA verkapseln. Die Formulierungsparameter können abgestimmt und die verschiedenen Lipid-Nanopartikel auf ihre Wirksamkeit und Bioverteilung hin bewertet werden. Ein standardisiertes Protokoll für die Formulierung von Lipid-Nanopartikeln sowie In-vitro- und In-vivo-Tests können verwendet werden, um konsistente Lipid-Nanopartikel zu formulieren, die miteinander verglichen werden können.
Es gibt viele kleine Details, die bei der Formulierung und Bewertung der Wirksamkeit von Nanopartikeln zu beachten sind, aber welche Details wurden berücksichtigt? Die Zubereitung der Formulierung sollte nicht schwierig sein. Beginnen Sie damit, ein sauberes Vier-Liter-Becherglas mit 200 bis 300 Millilitern frischem 10X PBS zu füllen und es mit Reinstwasser auf 1x zu verdünnen.
Stellen Sie sicher, dass das endgültige PBS-Volumen zwischen zwei und drei Litern liegt. Dialysekassetten mit der entsprechenden Kapazität für das Lipid-Nanopartikel oder die LNP-Formulierung werden in das Feldbecherglas eingesetzt. Nehmen Sie die zehnfache Verdünnung eines 100-millimolaren Zitronensäure-Puffermaterials mit Reinstwasser vor, um einen 10-millimolaren Zitronensäurepuffer für die mRNA-Verdünnung zu erzeugen.
Als nächstes wird C 12 200 ionisierbares Lipid, Helferlipid, Cholesterin und lipidverankerte PEG oder Lipid-PEG-Stammlösungen hergestellt, indem jedes Lipid in 100%igem Ethanol aufgelöst wird. Stellen Sie sicher, dass die Stammlösungen vollständig aufgelöst sind, indem Sie sie bei 37 Grad Celsius erhitzen und mischen. Kombinieren Sie die berechneten Volumina der verschiedenen Lipidkomponenten in einem konischen Röhrchen.
Verdünnen Sie die Lipide mit 100%igem Ethanol bis zum Endvolumen von V, was 25% des Endvolumens von LNP entspricht. Berechnen Sie die Menge an mRNA, die für die Formulierung erforderlich ist, basierend auf dem Verhältnis von ionisierbarem Lipid zu mRNA-Gewicht und dem Gesamtvolumen von mRNA-LNP. Als nächstes tauen Sie die Glühwürmchen-Luciferase, die für die mRNA kodiert, auf Eis auf.
Verdünnen Sie dann die mRNA mit dem 10-millimolaren Zitronensäurepuffer auf ein Endvolumen, das dreimal so hoch ist wie die organische Phase. Besprühen Sie ein empfindliches Tuch mit einem Oberflächendekontaminat für RNAs und DNA und wischen Sie das Innere des mikrofluidischen Instruments gründlich ab. Öffnen Sie als Nächstes eine neue Mikrofluidik-Kartusche und setzen Sie sie mit den Einlasskanälen nach unten und weg ein.
Legen Sie zwei sterile konische 15-Milliliter-Röhrchen mit abgenommenen Kappen auf den Halter. Wenn Sie fertig sind, füllen Sie eine Fünf-Milliliter-Spritze mit der mRNA-Lösung, die mRNA enthält, die in 10 Millimolar Zitronensäurepuffer verdünnt ist. Füllen Sie dann eine Drei-Milliliter-Spritze mit der Lipidlösung, die die in 100%igem Ethanol verdünnten Lipide enthält.
Stellen Sie sicher, dass die Luft aus den Spritzen entfernt wird. Führen Sie dann ohne Nadel die Fünf-Milliliter-Spritze mit der mRNA-Lösung in den linken Einlass der Kartusche ein und führen Sie die Drei-Milliliter-Spritze mit der Lipidlösung in den rechten Einlass der Kartusche ein. Schalten Sie das Mikrofluidik-Instrument ein und wählen Sie Schnelllauf.
Nachdem Sie die richtigen Spritzentypen für die eingesetzten Fünf- und Drei-Milliliter-Spritzen ausgewählt haben, geben Sie die Parameter für die LNP-Formulierung mit einem wässrigen zu organischen Flussratenverhältnis von drei zu eins ein, bevor Sie die Starttaste drücken, um die mRNA-LNPs zu formulieren. Laden Sie die im rechten konischen Röhrchen gesammelten mRNA-LNPs mit einer Spritze in die zuvor hydratisierten Dialysekassetten, ohne die Kassettenmembran zu punktieren oder zu berühren, legen Sie die Dialysekassetten mit den mRNA-LNPs zurück in das PBS-haltige Becherglas und lassen Sie sie mindestens zwei Stunden dialysieren. Nach der Dialyse werden die Dialysekassetten mit den mRNA-LNPs in eine sterile Biosicherheitswerkbank gebracht und die mRNA-LNPs mit einer Spritze mit einer Nadel entfernt.
Sterilfiltrieren Sie die mRNA-LNPs mit einem 0,22-Mikrometer-Spritzenfilter und sammeln Sie sie in einem sterilen konischen Röhrchen. Geben Sie dann 65 Mikroliter der mRNA-LNP-Lösung zur Charakterisierung in ein 1,5-Milliliter-Mikroröhrchen. Platte 5.000 HepG2-Zellen in einer weißen Wand, klarem Boden, 96-Well-Platte in 100 Mikroliter vollständigem Zellkulturmedium und Inkubation der Zellen über Nacht in einem kontrollierten Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid.
Vor der Behandlung von Zellen mit mRNA-LNPs ist das komplette Medium aus den Vertiefungen zu entfernen. Als nächstes werden die Zellen entweder mit 100 Mikrolitern mRNA-LNPs, die in vollständigem Zellkulturmedium in den gewünschten Dosen verdünnt sind, oder mit 100 Mikrolitern vollständigem Medium vor einer 24-stündigen Inkubation behandelt. Nach der Inkubation wird das Zellkulturmedium von der 96-Well-Platte entfernt, 20 Mikroliter Lysepuffer in jede Vertiefung gegeben, gefolgt von 100 Mikrolitern der Luciferase-Assay-Reagenzien.
Schützen Sie die Platte vor Licht und legen Sie die Platte in ein Plattenlesegerät, um das biolumineszierende Signal zu messen. Verdünnen Sie die mRNA-LNP-Lösung mit sterilem PBS, so dass zwei Mikrogramm Gesamt-mRNA in 100 Mikrolitern des Injektionsvolumens der Schwanzvene vorhanden sind. Füllen Sie eine 29-Gauge-Insulinspritze entweder mit 100 Mikrolitern mRNA-LNP oder 100 Mikrolitern PBS und entfernen Sie alle Blasen aus der Spritze.
Führen Sie die Nadel mit der Fase nach oben in die seitliche Schwanzvene der Maus ein und injizieren Sie langsam die 100 Mikroliter mRNA-LNP oder PBS. Sechs Stunden nach der Injektion eine Stammlösung von 15 Milligramm pro Milliliter D-Luciferin-Kaliumsalz in sterilem PBS herstellen. Aktivieren Sie in der Bildgebungssoftware für das In-vivo-Bildgebungssystem (IVIS) das Kontrollkästchen neben Lumineszenz, bevor Sie auf Initialisieren drücken, um das Gerät für die Datenerfassung vorzubereiten.
Als nächstes werden den zuvor behandelten Mäusen 200 Mikroliter D-Luciferin intraperitoneal verabreicht und 10 Minuten gewartet, bis sich das Luciferase-Signal stabilisiert hat, bevor die Mäuse betäubt werden. Übertragen Sie die anästhesierten Mäuse auf die Nasenkegel im Inneren des In-vivo-Bildgebungssystems und stellen Sie sicher, dass sie auf dem Rücken liegen und ihr Bauch freiliegt, bevor Sie die Kammertür schließen. Stellen Sie in der Bildgebungssoftware sicher, dass das richtige Sichtfeld ausgewählt ist, und stellen Sie die Belichtungszeit auf automatisch ein, klicken Sie auf die Schaltfläche "Aufnehmen" in der Software, um Biolumineszenzbilder zu erhalten.
Die Verkapselungseffizienz der mRNA-LNPs wurde mit 92,3 % unter Verwendung des hier gezeigten modifizierten Fluoreszenzassays und der hier gezeigten Gleichung bestimmt. Eine Zunahme der Biolumineszenz wurde bei der Behandlung von 5.000 HepG2-Zellen mit steigenden Dosen von mRNA-LNP beobachtet. Die Luciferase-Expression konnte bei der niedrigsten Dosis dieser Studie von fünf Nanogramm pro Vertiefung leicht nachgewiesen werden.
Ein starkes Biolumineszenzsignal wurde im Oberbauch der Mäuse beobachtet, die mit formulierten LNPs behandelt wurden. Um die Lebersignale herum wurden Regionen von Interesse gezeichnet, um den gesamten lumineszenten Fluss zu berechnen. Der gesamte lumineszierende Lichtstrom betrug ungefähr fünfmal 10 bis zum 9.
Halten Sie bei der Formulierung von LNPs immer das Gewichtsverhältnis von ionisierbaren Lipiden zu Nukleinsäuren bei. Jedes Volumen der organischen Phase sollte ionisierbares Lipid enthalten, das der mRNA in drei Volumina der wässrigen Phase entspricht.
