Ziel dieser Methode ist es, die funktionelle Konnektivität von Ferneingaben aus entfernten Hirnregionen mithilfe von Photostimulation in Hirnscheiben zu identifizieren. Die stereotaxic-Targeting einer bestimmten Hirnregion für verschiedene vermittelte Expression von lichtempfindlichen Ionenkanälen ermöglicht die selektive Stimulation von Axonen aus dieser Region mit Licht. Demonstriert wird das Verfahren von Louis Richevaux, einem Doktoranden meiner Fraktion.
Stellen Sie vor der Operation sicher, dass das Tier mit einer Zehenzange gut befruchtet ist. Ziehen Sie vorsichtig die Zunge heraus, um das Atmen zu erleichtern. Dann rasieren Sie das Schädelhaar.
Injizieren Sie 20 Mikroliter Lidocainhydrochlorid unter die Haut des Kopfes für die lokale Anästhesie und warten Sie fünf Minuten. Um den Schädel zu belichten, machen Sie einen Schnitt auf der Kopfhaut. Dann legen Sie das Tier in einen stereotaxic Rahmen.
Legen Sie die Ohrstangen und ruhen Sie sie auf den Knochen leicht rostral zu den Ohren und ziehen Sie die Haut nach unten, um einen guten Zugang zum Schädel zu schaffen. Ziehen Sie die Ohrbügel fest und installieren Sie das Nasenstück. Halten Sie den Körper des Tieres horizontal und auf der Ebene des Kopfes mit einer höhenverstellbaren Stütze.
Legen Sie ein Heizkissen unter das Tier, um es bei physiologischer Temperatur zu halten. Reinigen Sie dann den Schädel, indem Sie 0,9% Natriumchlorid mit einem Wattestäbchen auftragen, um Weichgewebe zu entfernen. Passen Sie den Schädel so an, dass der Bregma-Lambda-Zugang eingeebnet ist.
Dann lokalisieren Sie die Injektionsstelle auf dem Schädel nach den hinteren und medialen Koordinaten und positionieren Sie die Injektionsnadel darüber. Markieren Sie den Schädel mit einer Einwegnadel. Anschließend die Injektionsnadel um vier Zentimeter nach oben bewegen.
Erstellen Sie mit einem 0,5-Millimeter-Grat eine Kraniotomie von einem Millimeter auf der Marke bei der Hälfte der maximalen Geschwindigkeit. Tupfer mit einem Gewebe, wenn eine Blutung auftritt. Als nächstes entleeren Sie das in der Hamilton-Spritze enthaltene Wasser zur Lagerung, indem Sie es vollständig mit einer Pumpe auswerfen.
Nur die Nadel ist mit Wasser gefüllt. Die virusbehaftete Lösung, die auf Eis injiziert werden soll, auftauen, kurz vom Eis entfernen und 700 Nanoliter der Lösung mit einer Mikropipette erhalten. Als nächstes legen Sie einen Tropfen auf ein Stück Paraffinfilm.
Legen Sie den Paraffinfilm auf die Kraniotomie. Tauchen Sie die Nadel in den Tropfen der viralen Lösung, ohne die Anteroposterior und seitliche Position zu ändern. Danach verwenden Sie die Rückzugsfunktion der Pumpe, um die Spritze mit etwa 500 Nanolitern der viralen Lösung auf dem Paraffinfilm zu füllen.
Führen Sie dieses Verfahren unter dem Stereoskop durch, beobachten Sie, wie der Tropfen verschwindet, und stellen Sie sicher, dass Sie keine Luft ansaugen. Stellen Sie sicher, dass die Spritze korrekt gefüllt wurde. Testen Sie das Auswurfsystem, indem Sie den Kolben herunterfahren, um zu testen, wie ein kleiner Tropfen Flüssigkeit ausgeworfen wird.
Anschließend setzen Sie die Nadel in die gewählte Tiefe in das Gehirn ein. Drücken Sie die Run-Taste zur Injektion. Ziehen Sie dann die Nadel langsam über drei bis fünf Minuten zurück.
Waschen Sie die Nadel sofort in sauberem destilliertem Wasser, indem Sie sie mehrmals entleeren, um Verstopfungen zu vermeiden. Entfernen Sie anschließend das Tier aus dem stereotaxic Rahmen. Befestigen Sie die Haut und machen Sie drei oder vier Stiche mit 2-1-1 Standard chirurgische Knoten gebunden.
Um das Gehirn zu extrahieren, machen Sie einen Schnitt auf der Haut vom Hals bis zur Nase, dann schneiden Sie die letzten Wirbel aus dem Schädel mit der Schere. Ziehen Sie die Haut zurück und schneiden Sie den Schädel entlang der Mittellinie von kaudaler in rostrale Richtung. Entfernen Sie vorsichtig den parietalen Knochen und den kaudalen Teil des Frontalknochens.
Extrahieren Sie das Gehirn mit einem kleinen abgerundeten Spachtel, indem Sie es zwischen dem Gehirn und dem Schädelboden einsetzen, indem Sie die Riechbirne, den Sehnerv und andere Hirnnerven und Kleinhirn abschnitten. Tauchen Sie das Gehirn vorsichtig in eiskalte Schneidlösung ein. Anschließend das Gehirn auf ein Filterpapier übertragen und die kortikale Oberfläche sanft trocknen.
Kleben Sie den Hirnkortex an den Probenhalter eines Vibratom mit der kaudalen Seite zur Klinge, um horizontale Gehirnscheiben zu schneiden. Als nächstes füllen Sie die Schneidkammer mit eiskalter sauerstoffhaltiger Schneidlösung, damit das Gehirn vollständig versunken ist. Abschnitt 300 Mikrometer dicke Scheiben mit dem Vibratome mit einer Geschwindigkeit von 07 Millimetern pro Sekunde bei einer Amplitude von einem Millimeter.
In diesem Stadium wird empfohlen, den Chronos-GFP-Ausdruck im Thalamus mit einer leuchtstofffreien Taschenlampe und entsprechenden Filtergläsern kurz zu überprüfen. Um eine Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahme durchzuführen, übertragen Sie vorsichtig eine Gehirnscheibe mit dem Hippocampus-Komplex in die Aufnahmekammer. Kontinuierlich durchdringen Sie die Aufnahmekammer mit 34 Grad Celsius ACSF mit Autobogen bei zwei bis drei Milliliter pro Minute.
Betrachten Sie kurz den Chronos-GFP-Ausdruck in Axonklemmen im Interessenbereich mit blauer LED-Beleuchtung bei 4X Vergrößerung. Wechseln Sie zu einem 63X-Tauchziel und passen Sie den Fokus an. Suchen Sie nach Axonen, die Chronos-GFP ausdrücken, und wählen Sie ein pyramidenförmiges Neuron für die Patch-Aufnahme.
Als nächstes füllen Sie eine Pipette mit Kaliumgluconat-basierte interne Lösung. Montieren Sie es in der Pipettenhalter auf der Kopfbühne. Patchen Sie die Zelle in Spannungsklemmenkonfiguration.
Nähern Sie sich dem identifizierten Neuron und drücken Sie vorsichtig die Pipettenspitze auf das Soma. Der positive Druck sollte ein Grübchen auf der Membranoberfläche erzeugen. Lassen Sie dann den Druck los, um eine GigoOm-Dichtung zu erstellen.
Nach dem Abdichten stellen Sie die Haltespannung auf minus 65 Millivolt ein. Brechen Sie die Membran mit einem scharfen Impuls von Unterdruck. Zeichnen Sie die Reaktionen des Neurons auf hyperpolarisierende und depolarisierende Stromschritte im Ganzzellstromklemmenmodus auf.
Aufzeichnung der strom- oder Spannungsklemme postsynaptischen Reaktionen auf 475 Nanometer LED-Vollfeldstimulation von affemittenten Fasern, die Chronos ausdrücken. Stimulieren Sie mit Zügen von zehn Stimulationen von zwei Millisekunden Dauer bei 20 Hertz. Die Aktivität von präsubikulären Neuronen in Schicht drei als Reaktion auf hyperpolarisierende und depolarisierende Stromschritte wurde in der Ganzzell-Patch-Clamp-Konfiguration aufgezeichnet.
Stimulierende ADN-Axonklemmen, die Chronos-GFP exzessikulieren, entlockten im aktuellen Klemmmodus exzitatorische postsynaptische Potenziale in der präsubikulären Schicht drei Hauptzellen. Je nach Lichtintensität könnten die EPSP einen Aktionspotenzialschwellenwert erreichen. Postsynaptische Reaktionen wurden auch im Spannungsklemmenmodus beobachtet, da exzitatorische postsynaptische Ströme ausgelöst wurden.
Hier ist eine Schicht drei pyramidenförmige Neuron von thalamischen Axonen umgeben, die Chronos-GFP in präsubikulären oberflächlichen Schichten mit DAPI-Färbung mit einem Epifluoreszenzmikroskop ausdrücken. Und dieses Bild wurde bei einer höheren Vergrößerung mit einem konfokalen Mikroskop aufgenommen. Eine sorgfältige Nivellierung des Bregmas entlang der Achse bei der Durchführung von Pilotexperimenten mit einem fluoreszierenden Tracer ist entscheidend, um die Präzision der stereotaxic-Injektion zu verbessern.
Dieses Verfahren kann auch verwendet werden, um konvergierende Projektionen aus verschiedenen Bereichen zu untersuchen, indem in zwei generative Szenen injiziert wird, die für zwei verschiedene Wellenlängen empfindlich sind. Die Entwicklung dieser Technik hat eine präzise anatomische und funktionelle Schaltungsanalyse zwischen entfernten Hirnregionen auf zelltypspezifische Weise ermöglicht.
