Hi.In diesem Video erfahren Sie, wie Sie hyperpolarisierte MR-Untersuchungen des perfundierten Mausherzens durchführen. David Shaul, ein MD/PhD-Student im Labor, führt Sie durch die verschiedenen Techniken und Verfahren. Heute lernen wir ein Protokoll zur Untersuchung des hyperpolarisierten Kohlenstoff-13-Pyruvat-Metabolismus in Kombination mit 31P-NMR-Spektroskopie.
Der Pyruvatstoffwechsel steht an der Kreuzung von aerobem und anaerobem Stoffwechsel. Und als solches ist es von großem Wert für die Untersuchung verschiedener Zustände des Herzens. Also lasst uns loslegen.
Das Mausherz wird isoliert und mit Krebs-Hensleit-Puffer in einem 10-Millimeter-NMR-Röhrchen perfundiert. Das Herz wird dann in das NMR-Spektrometer eingeführt. Dort wird ein 31P-Spektrum aufgezeichnet, um die Herzenergetik und den pH-Wert zu beobachten, indem die Resonanzen von Adenosintriphosphat, Phosphokreatin und anorganischem Phosphat beobachtet werden.
Währenddessen wird eine Pyruvatprobe, die an erster Stelle mit Kohlenstoff-13 markiert ist, hyperpolarisiert. Und nachdem die Auflösung aufgetreten ist, wird es in das Herz injiziert, um die Messung von Laktat, anorganischen Stoffen und Pyruvat der organisierten Aktivitäten in Echtzeit zu ermöglichen. Bereiten Sie einen Tag vor dem Experiment 400 Milliliter modifizierten Krebs-Henselet-Puffer vor.
Im ersten Schritt lösen wir diese Inhaltsstoffe in doppelt destilliertem Wasser. Dann blasen Sie diese Lösung 20 Minuten lang mit dieser Sauerstoffmischung und fügen Sie dann Calciumchlorid hinzu. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 ein.
Fügen Sie am Tag des Experiments Glukose und Insulin hinzu. Stellen Sie das Wasserbad auf 40 Grad Celsius ein. Setzen Sie die mittelgroße Flasche mit 200 Millilitern KH-Puffer in das Bad ein.
Verwenden Sie eine Peristaltikpumpe, um den KH-Puffer zu recyceln. Schließen Sie daran eine Zuflussleitung und zwei Abflussleitungen an. Führen Sie die Zu- und Abflussleitungen in den beheizten KH-Puffer ein.
Verwenden Sie einen Sauerstoffmischer mit 95% O2 und 5% CO2. Führen Sie dann die Sauerstoffleitung in den erhitzten KH-Puffer ein. Schalten Sie die Schlauchpumpe ein und stellen Sie sie auf ein konstantes Durchflussgewicht von 7,5 Millilitern pro Minute ein.
Wir wollen das System kalibrieren, bevor wir das Herz einführen. Führen Sie daher die Zu- und Abflussleitungen in ein 10-Millimeter-NMR-Röhrchen ein und setzen Sie einen optischen Temperaturfühler ein, der NMR-kompatibel ist. Führen Sie den NMR-Röhrchen in die Magnetbohrung ein.
Stellen Sie den Heiztank auf 42 Grad Celsius ein und verwenden Sie die NMR-Heizung, um die Temperatur im Inneren des Magneten auf 37 Grad Celsius einzustellen. Beachten Sie, dass die NMR-Temperatur tatsächlich im KH-Puffer im Inneren des Magneten mit einem NMR-kompatiblen Temperaturkern überwacht wird. Jetzt können wir die 31P-Spektroskopie verwenden, um das Signal von anorganischem Phosphat im Puffer zu beobachten.
Dies ist die Ausrüstung, die für den chirurgischen Eingriff erforderlich ist. Geben Sie 100 Milliliter KH-Puffer in Eis und blasen Sie es mit der gleichen Sauerstoffmischung. Betäuben Sie die Maus in der Kastenkammer mit 3,3% Isofluran, gemischt mit Raumluft zur Induktion, bei einer Durchflussrate von 340 Millilitern pro Minute.
Übertragen Sie die Maus in die Nasenanästhesie. Bei gleicher Durchflussrate auf 2,9 % Isofluran reduzieren. Drücken Sie den Fuß zusammen, um einen negativen Pedalschmerzreflex zu überprüfen und sicherzustellen, dass die Maus vollständig betäubt ist.
Injizieren Sie der Maus 300 Einheiten Natriumheparin intraperitoneal. Schneiden Sie die Haut zwei Zentimeter unterhalb des Xiphoid-Prozesses. Schneiden Sie die Bauchdecke ab, um die Bauchhöhle freizulegen.
Platzieren Sie die Scherenklemme zwischen dem Xiphoidfortsatz und der Brusthaut und verwenden Sie sie, um die Brustwand zurückzuziehen und das Zwerchfell freizulegen. Durchstechen Sie den rechten Lappen des Zwerchfells und schneiden Sie dann den Rest des Zwerchfells ab. Schneiden Sie über die Mittellinie der Brustwand und vermeiden Sie dabei den Kontakt mit tieferen Organen wie dem Herzen und den Gefäßen.
Injizieren Sie 200 Einheiten Natriumheparin in den linken Ventrikel des Herzens. Injizieren Sie dem Herzen 0,1 Milliliter 0,5 Molar KCL, um einen Herzstillstand zu erreichen. Ziehen Sie das Thymusgewebe nach vorne zurück und schneiden Sie es von seiner Wurzel ab, um die darunter liegende Aorta freizulegen.
Versuchen Sie, so viel Thymusgewebe wie möglich zu entfernen und gleichzeitig Schäden an der Aorta zu vermeiden. Entfernen Sie restliches Brustkorbgewebe, um den intravenösen Katheter frei passieren zu lassen. Legen Sie die gebogene Pinzette unter die Aorta und legen Sie damit einen Seidennahtknoten um die Aorta.
Platzieren Sie eine gebogene Pinzette an der Aortenwurzel und ziehen Sie das Herz nach unten zurück, um die Aorta freizulegen und zu dehnen. Injizieren Sie drei Milliliter eiskalten KH-Puffer in den linken Ventrikel, um Blutgerinnsel aus der Aorta zu entfernen und die Lebensfähigkeit des Herzens zu erhalten. Geben Sie auch einige Tropfen auf die Herzoberfläche.
Verwenden Sie eine intravenöse Katheternadel, um die Arterienwand der Aorta zu punktieren, ohne die hintere Wand zu beschädigen. Führen Sie dann den Katheter mit der Nadel etwa drei Millimeter ein. Entfernen Sie anschließend die Nadel und führen Sie gleichzeitig den Katheterschlauch für weitere fünf Millimeter ein, vermeiden Sie jedoch das Eindringen in die linke Ventrikelkammer.
Legen Sie Cyanacrylatkleber in den Einstichbereich der Aorta, um zu verhindern, dass der Katheterschlauch beim Anziehen der Naht aus der Aorta rutscht. Binden Sie vorsichtig einen Knoten zwischen der Aorta und dem Kanülenschlauch. Injizieren Sie zusätzliche fünf Milliliter KH-Puffer in den linken Ventrikel und überprüfen Sie, ob er durch das Kanülierungsröhrchen fließt.
Dies bedeutet, dass die Kanülierung erfolgreich war. Entfernen Sie die gebogene Pinzette von der Aortenwurzel. Trennen Sie das Herz von den umgebenden Eingeweiden und vermeiden Sie dabei den Kontakt mit dem Kanülierungsmittel und dem Herzgewebe.
Schließen Sie die Kanüle sofort an eine fließende eiskalte KH-Pufferspritze an. Es ist wichtig, das Eindringen von Luftblasen in das Herz zu vermeiden. Entfernen Sie nicht-kardiales Gewebe.
In diesem Stadium sollten Sie beobachten, wie das Herz wieder schlägt. Schneiden Sie die restlichen Seidennahtränder ab. Trennen Sie im NMR-Raum die Kanüle von der Spritze und schließen Sie sie an den 37-Grad-KH-Puffer des Perfusionssystems an.
Führen Sie dann das Herz in das 10-Millimeter-NMR-Röhrchen ein. Platzieren Sie das Herz in der Mitte der Sonde und führen Sie dann das NMR-Röhrchen mit dem Herzen in die Bohrung des NMR-Spektrometers ein. Führen Sie "Shim" mit dem Wassersignal auf dem 1H-Kanal durch, bis eine Leitungsbreite von 10 bis 20 Hertz erreicht ist.
Erfassen Sie dann 31P-Spektren des Herzens, indem Sie einen Flip-Winkel von 50 Grad und einen TR von 1,1 Sekunden im stationären Zustand verwenden. Diese Bedingungen begünstigen das Signal von ATP gegenüber den Signalen von PCr und anorganischem Phosphat. Die Beobachtung der Signale von ATP und PCr bedeutet, dass das Gewebe im NMR-Spektrometer lebensfähig ist.
Verwenden Sie ein spezielles Verarbeitungsprogramm, um die Spektren zu analysieren. Führen Sie eine exponentielle Aufrüstung von sieben Hertz durch. Verwenden Sie die Basislinienkorrektur und weisen Sie dann das Phosphokreatinsignal minus 2,5 ppm zu.
Beobachten Sie die Signale von anorganischem Phosphat, Phosphokreatin und ATP. Polarisieren Sie die Pyruvatprobe, die an erster Stelle mit Kohlenstoff 13 markiert ist, 80 Minuten lang. Nach 80 Minuten Polarisation ist die Probe bereit für die Lösung.
So erfolgt die Auflösung. Injizieren Sie den Auflösungsinhalt mit dem kontinuierlichen Perfusionsansatz in das Herz. Dieser Ansatz wurde entwickelt, um das Pyruvat ohne Unterbrechung der Gewebeperfusion und des Sauerstoffgehalts zu liefern.
Das Lösungsmedium, das das hyperpolarisierte Pyruvat enthält, wird in ein konisches Röhrchen injiziert, dann manuell in einen Bypass injiziert, und dann leiten wir die Perfusion durch den Bypass, und der Bypass-Inhalt fließt kontinuierlich durch das Herz und wird schließlich ausgewaschen. Wir verwenden eine Perfusionsrate von 7,5 Millilitern pro Minute und ein Bypassvolumen von 22 Millilitern. So dass die hyperpolarisierten Medien etwa drei Minuten lang durch das Herz fließen.
In diesem Zeitfenster verwenden wir die Kohlenstoff-13-Spektroskopie, um Pyruvat-, Laktat- und Bicarbonatsignale zu messen. Wir verwenden ein Anregungsschema, das zwischen Laktatanregung und Bikarbonatanregung mit Intervallen von sechs Sekunden wechselt. Wir haben eine sättigende selektive Anregung verwendet, um das Kohlenstoff-13-Signal zu erhalten.
Bei diesem Ansatz wird das Substrat Pyruvat minimal angeregt, während die Metaboliten, Laktat und Bicarbonat, vollständig angeregt werden. Beobachten und zeichnen Sie den Kohlenstoff-13-Pyruvatstoffwechsel etwa drei Minuten lang auf. Die metabolische Untersuchung ist abgeschlossen, nachdem das Pyruvatsignal abgeklungen ist.
Diese Abbildung zeigt 31P-Spektren, die von einem mit KH-Puffer durchbluteten Mausherzen aufgenommen wurden. Das vom Herzen erfasste Spektrum zeigt die Signale von Alpha-, Beta- und Gamma-ATP, PCr und Pi. Das Pi-Signal besteht aus zwei Hauptkomponenten. Die Komponente auf der linken Seite, die in einem höheren Feld erscheint, stellt ein Pi-Signal dar, das hauptsächlich auf KH-Puffer bei einem pH-Wert von 7,4 zurückzuführen ist. Der Rand und die weniger homogene Komponente auf der rechten Seite, die sich in einem unteren Feld befindet, zeigt das Pi-Signal, das sich in einer saureren Umgebung befindet.
Diese Komponente entsteht aus dem Herzgewebe. Als nächstes wurde das Pi-Signal des Gewebes erhalten, indem das Puffer-Pi-Signal vom gesamten Pi-Signal subtrahiert wurde. Es wurde dann von einer ppm-Skala in eine pH-Skala umgewandelt.
Der pH-Wert wird mit einer multiparametrischen Analyse des Gewebe-Pi-Signals untersucht, indem der gewichtete Mittelwert, der gewichtete Median, das globale Maximum und die Schiefe berechnet werden. Diese Abbildung zeigt ein typisches Kohlenstoff-13-NMR-Spektrum, das unter Verwendung des hyperpolarisierten produktselektiven Sättigungsanregungsansatzes während der hyperpolarisierten Kohlenstoff-13-Pyruvat-Injektion in das perfundierte Mausherz erhalten wurde. Beachten Sie Laktatpyruvat- und Bicarbonatsignale.
Das Pyruvatsignal wird hier zu Anzeigezwecken abgeschnitten. Die Änderungen der Signalintensitäten des Substrats und der Metaboliten sind auf die T1-Relaxation, die Anregungsfrequenz und die Fließeigenschaften zurückzuführen. Als nächstes werden die integrierten Intensitäten dieser Signale aufgetragen.
Darüber hinaus haben wir in schwarzen Kreisen die in Pyruvat integrierte Intensität aufgetragen, die für den T1-Zerfall und für den Effekt von 4D-Frequenzanregungen unter Verwendung einer effektiven Abklingzeitkonstante von 32 Sekunden gesammelt wurde. Es wurde festgestellt, dass diese Korrektur die erwartete Fließdynamik für das Substrat ergibt. Einwaschen, Plateau und Auswaschen.
Anhand dieses korrigierten Signalzeitverlaufs wählten wir für die weitere Analyse das hellblau markierte Zeitfenster aus, in dem die Pyruvatkonzentration im NMR-Röhrchen konstant und maximal war. Die Raten von LDH und PDH wurden für jeden der ausgewählten Zeitpunkte berechnet und dann gemittelt. Die Hauptwerte für diese Injektion werden in Einheiten von Nanomol pro Sekunde angegeben.
Zusammenfassend haben wir das Experimentiersystem zur Durchführung von hyperpolarisierten Pyruvat-Stoffwechselstudien im perfundierten Mausherz gezeigt. Wir hoffen, dass diese Informationen nützlich waren.
