Dieses Protokoll beschreibt einen kolorimetrischen Hochdurchsatz-Assay in den drei Lebenszyklusphasen von Trypanosoma cruzi zur Identifizierung neuer Arzneimittelkandidaten für die Chagas-Krankheit. Dies kann verwendet werden, um trypanozide Verbindungen auf einfache, schnelle und reproduzierbare Weise zu identifizieren. Das Verfahren wird von Romina Manarin, einer Laborzellkulturtechnikerin aus dem Labor von Pamela crib, demonstriert.
Beginnen Sie mit der Kultivierung von Beta-Galactosidase, die Trypanosoma cruzi epimastigotes in einem T-25-Gewebekulturkolben exprimieren, und inkubieren Sie bei 28 Grad Celsius, um sie axenisch zu züchten. Quantifizieren Sie mit einer Neubauer-Kammer das Parasitenwachstum, bevor Sie subkultivieren. Um die Kulturen in einer logarithmischen Phase zu halten, subkulturieren Sie alle 48 bis 72 Stunden in fünf Millilitern LIT-Medium, ergänzt mit 10% FCS und Geneticin in Sulfat bei einer Endkonzentration von 200 Mikrogramm pro Milliliter.
Schließen Sie dann die Kappe sicher, bevor Sie bei 28 Grad Celsius in vertikaler Position inkubieren. Aus der Log-Phase-Kultur wird eine Suspension von Epimastigot in LIT-Medium hergestellt, die mit Geneticin und Sulfat in der Endkonzentration von 200.000 Zellen pro Milliliter Epimastigot pro Milliliter ergänzt wird. Nach der Abgabe von 100 Mikrolitern Suspension pro Vertiefung einer 96-Well-Platte, Make-up-Endvolumen von gut 200 Mikroliter mit Medium.
Machen Sie die Vero-Zellsuspension in DMEM ergänzt mit 2% FCS bei der Endkonzentration von 100.000 Zellen pro Milliliter. Samen Sie 100 Mikroliter der Suspension pro Vertiefung in eine 96-Well-Gewebekulturplatte. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht für die Anhaftung und am nächsten Tag beobachten Sie die Zellen unter dem Mikroskop.
Am nächsten Tag spülen Sie die Vero-Zell-Monoschicht dreimal mit 100 Mikrolitern sterilem PBS ab. Fügen Sie zuvor erhaltene metazyklische Trypomastigotes hinzu. Fügen Sie eine Vielzahl von Infektionen oder MOI von 10-1 in 100 Mikrolitern DMEM hinzu, die mit 2% FCS pro Vertiefung ergänzt werden, und inkubieren Sie sechs Stunden lang, wie zuvor gezeigt.
Waschen Sie die Platte am Ende der Inkubation zweimal mit PBS und fügen Sie 100 Mikroliter DMEM ohne Phenolrot hinzu, ergänzt mit 2% FCS. Nach der Herstellung der Vero-Zellsuspension in DMEM fügen Sie die Endkonzentration von 1 Million Zellen pro Milliliter hinzu. Samen Sie 800.000 Zellen in fünf Millilitern des Mediums in T-25-Kolben und inkubieren Sie über Nacht für die Zelladhärenz.
Sobald der Kolben mit PBS gespült ist, fügen Sie Trypomastigotes hinzu, fügen Sie ein MOI von 10-1 in fünf Millilitern DMEM hinzu, das mit 2% FCS ergänzt wird, und inkubieren Sie über Nacht, wie zuvor gezeigt. Waschen Sie den Kolben am Ende der Inkubation zweimal mit PBS. Fügen Sie fünf Milliliter frisches DMEM hinzu, das mit 2% FCS ergänzt wird, und inkubieren Sie vier Tage lang.
Am Ende der Inkubation, nach der Beobachtung des Überstands für Trypomastigotes Anwesenheit unter einem optischen Mikroskop. Quantifizieren Sie die Trypomastigoten mit einer Neubauer-Kammer. Sammeln Sie den Überstand in einem 15-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie bei 7.000 mal G für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
Dann entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet in DMEM ohne Phenolrot, ergänzt mit 2% FCS, um eine Konzentration von 1 Million Trypomastigoten pro Milliliter zu erhalten. Samen Sie 100 Mikroliter der Trypomastigot-Suspension pro Well in einer 96-Well-Platte. Fügen Sie Benznidazollösung zu Epimastigoten, Vero-Zellen mit Amastigoten oder Trypomastigotes hinzu, wie im Textmanuskript beschrieben.
Dann inkubieren Sie die Epimastigotes, setzen Sie 28 Grad Celsius für 72 Stunden und die Trypomastigotes oder infizierten Vero-Zellen mit Amastigotes für 24 Stunden bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Für den farbmetrischen Assay richten Sie die leeren Vertiefungen ein, indem Sie 100 Mikroliter PBS oder das entsprechende Medium hinzufügen. Als nächstes fügen Sie 40 Mikroliter CPRG-Substratlösung und 10 Mikroliter der Reinigungsmittellösung zu jeder Vertiefung hinzu, um eine Endkonzentration von 200 mikromolaren CPRG und 0,1% Reinigungsmittel in einem Endvolumen von 250 Mikrolitern in jeder Vertiefung zu erhalten.
Nach der Inkubation messen Sie bei 37 Grad Celsius für zwei Stunden die Absorption bei 595 Nanometern mit einem Mikroplatten-Spektralphotometer. Erstellen Sie in der Software ein neues Protokoll, indem Sie Absorption als Erkennungsmethode und Endpunkt als Lesetyp auswählen, und klicken Sie dann auf OK. Fügen Sie als Nächstes einen Leseschritt hinzu.
Geben Sie die ausgewählte Wellenlänge ein und klicken Sie auf OK. Markieren Sie im Abschnitt Plattenlayout die zu lesenden Vertiefungen, klicken Sie auf OK und klicken Sie auf Platte lesen, warten Sie, bis die Werte auf dem Bildschirm angezeigt werden, und exportieren Sie sie in eine Tabelle, um die Ergebnisse zu analysieren und die Absorptionswerte mit Subtraktion zu berechnen, wie im Manuskript beschrieben. Zeichnen Sie in einer statistischen Analysesoftware die Konzentration von BZN im Vergleich zur Absorption bei 595 Nanometern in der XY-Tabelle auf.
Transformieren Sie die BZN-Konzentrationen in logarithmische Werte, indem Sie auf Analysieren klicken, die Option Transformieren auswählen und auf OK klicken. Um IC50-Werte zu erhalten, klicken Sie auf Analysieren, wählen Sie in der Liste XY-Analyse die Option Nichtlineare Regressionskurvenanpassung aus, und klicken Sie dann auf OK. Gehen Sie als Nächstes zum Parameterfenster, gehen Sie auf der Registerkarte Modell zur Dosis-Wirkungs-Hemmungsgruppe der integrierten Gleichungen, wählen Sie log inhibitor versus response variable slope für Parameter, während die Dosis-Wirkungs-Methode alle anderen Registerkarten auf Standardwerten belässt und dann auf okay klickt.
Klicken Sie auf den Ergebnisabschnitt, um den IC50-Wert, den SD und die Güte der Passform zu finden. Klicken Sie auf den Diagrammabschnitt, um das XY-Diagramm der logarithmischen Konzentration des Arzneimittels im Vergleich zu den Absorptionswerten zu finden und sicherzustellen, dass die Kurvenanpassung auch in einer anderen Farbe grafisch dargestellt wird. In der vorliegenden Studie betrug der für Epimastigotes erhaltene IC50-Wert etwa 20 Mikromolaren, ähnlich wie in früheren Studien.
Darüber hinaus zeigten die Ergebnisse eine Liner-beta-Galactosidase-Aktivität der Epimastigoten im Laufe der Zeit. Es ist sehr wichtig, mindestens Replikationen jedes getesteten Zustands durchzuführen und Fehler im Volume-Management zu minimieren.
