Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Veränderungen der zytosolischen Kalziumkonzentrationen in lebenden Zellen zu überwachen, um neuronale oder Gliareaktionen basierend auf Kaliumchlorid oder ATP-Reizen zu differenzieren. Kalzium ist ein wichtiger zweiter Botenstoff, der an mehreren zellulären Prozessen beteiligt ist, einschließlich Neurotransmission, Plastizität und Apoptose. Das Aufkommen von hochselektiven fluoreszierenden Kalziumfarbstoffen wie Fura-2 AM, verbunden mit der Entwicklung besserer Fluoreszenzmikroskope und Berechnungsmethoden, lieferte hochauflösende optische Daten mit einem hohen Maß an räumlicher und zeitlicher Auflösung, um Kalziumsignale auf lebenden Zellen und Organismen abzubilden.
Dieses Protokoll kann an angereicherte Neuronen, gereinigte Glia- oder Mischpopulationskulturen angepasst werden. Es verfolgt, welche Zelltypen auf bestimmte Reize reagierten, basierend auf der differentiellen Reaktion auf Kaliumchlorid und ATP. Kaliumchlorid verändert das Membranpotential der Zelle.
Und dies öffnet spannungsgesteuerte Kalziumkanäle, die im Wesentlichen von Neuronen ausgedrückt werden. Auf der anderen Seite aktiviert ATP den P2X7-Großteilkanal, der hauptsächlich in Gliazellen vorhanden ist. Durch die Kopplung von Kaliumchlorid und ATP-Stimuli mit anderen Medikamenten ist es möglich zu sehen, welches Kompartiment des Nervensystems auf sie reagiert, basierend auf der Erhöhung der intrazellulären Kalziumkonzentration.
Für dieses Verfahren benötigen Sie einige chirurgische Instrumente oder eine Pinzette. Verwenden Sie eine Biosicherheitswerkbank und führen Sie Best Practices durch, um Kontaminationen zu vermeiden. Um die Hühnernetzhautkultur zu beginnen, öffnen Sie vorsichtig ein befruchtetes Ei am Boden, wo sich die Luftzelle befindet.
Entfernen Sie den Inhalt in eine Petrischale und fahren Sie mit der Embryonenabgabe durch Enthauptung mit einer Pinzette fort. Sobald der Kopf entfernt ist, bringen Sie ihn in eine saubere Petrischale und fügen Sie etwas kalzium- und magnesiumfreie Lösung hinzu. Als nächstes entfernen Sie die Augen und achten Sie darauf, sie dabei nicht zu beschädigen.
Bringen Sie das Auge zu einer anderen Petrischale mit CMF-Lösung. Beginnen Sie mit einer Pinzette, das Auge zu sezieren, indem Sie die Linse entfernen. Dann, beginnend mit dem Loch, das die Linse hinterlassen hat, machen Sie drei oder vier Längsschnitte im Auge.
Entfernen Sie den transparenten Glaskörper mit Vorsicht. Stellen Sie sicher, dass die Netzhaut nicht daran gebunden ist. Als nächstes lösen Sie vorsichtig die Netzhaut vom pigmentierten Epithel.
Entfernen Sie das verbleibende Epithelgewebe. Wenn die Netzhaut völlig klar ist, schneiden Sie sie in kleine Stücke. Nehmen Sie das gesamte Netzhautgewebe mit Hilfe einer automatisierten Pipette ein.
Zentrifugieren Sie kurz die Netzhaut, um das gesamte CMF zu entfernen. Fügen Sie 1 ml 0,25% Trypsin hinzu. Und inkubieren Sie das Gewebe bei 37 ° C für 10 Minuten.
Stoppen Sie die Trypsinreaktion, indem Sie 1 ml Medium hinzufügen, das 10% fetales Kälberserum enthält. Zentrifugieren Sie die Netzhaut, um das gesamte Trypsin zu entfernen. Waschen Sie die Zellen zwei- oder dreimal mit einem Medium, das 10% FCS enthält.
Als nächstes fügen Sie 2 ml Medium pro Netzhaut hinzu und dissoziieren Sie es sanft mechanisch. Verdünnen Sie die Zellen, damit Sie sie mit einem Hämozytometer richtig zählen können. Verwenden Sie 15-mm-Deckgläser, die mit Poly-L-Lysin und Laminin geschützt sind, um die Zelladhäsion zu unterstützen.
Pipette 50 L Ihrer verdünnten Zellen auf jedem Deckglas. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C in 5%CO2-Atmosphäre. Und kühlen Sie sie, um das Glas zu befestigen.
Dies sollte etwa ein bis zwei Stunden dauern. Fügen Sie 1 ml Medium hinzu und bringen Sie es bis zum Tag des Experiments in den Inkubator zurück. Bei Bedarf wechseln Sie alle zwei bis drei Tage die Hälfte des Mediums.
Rekonstituieren Sie eine 50 g Fläschchen Fura-2 AM mit 50 L DMSO. Krebslösung ist eine gute Option, um Zellen während des Experiments zu übertragen, da sie die Fluoreszenzmessung nicht stört. Die Lösung vor Beginn auf 37 vorheizen.
Poloxamer 407 hinzufügen. Fügen Sie Fura-2 AM und DMSO hinzu. Beschallen Sie es sieben Minuten lang in einem Wasserbad.
Bereiten Sie eine 6-Well-Platte vor, indem Sie Krebs-Lösung zu drei Vertiefungen und die funktionierende Fura-2-Lösung zu einer anderen hinzufügen. Waschen Sie das Deckglas, das Ihre Zellen enthält, dreimal, bevor Sie es zum Fura-2-Brunnen hinzufügen. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C und 5% CO2-Atmosphäre für 30 Minuten in einem dunklen Inkubator.
Nach der Inkubation dreimal waschen. Übertragen Sie es auf einen anderen Empfänger, der Krebs enthält, und schützen Sie es vor dem Licht. Es ist möglich, den vorbereiteten Fura-2 wiederzuverwenden, um mehr Deckgläser mit Zellen zu inkubieren.
Fügen Sie vor jedem Durchlauf Silizium zur Deckglashalterung und -kammer hinzu, um ein Auslaufen der Lösung zu vermeiden. Nehmen Sie das Deckglas aus Krebs-Lösung heraus und waschen Sie den Boden vorsichtig mit destilliertem Wasser, um eine Salzkristallisation auf der Mikroskoplinse zu vermeiden. Setzen Sie den Decklack auf die Stütze und drücken Sie vorsichtig auf die Ränder.
Befestigen Sie die Deckglasstütze und die Kammer am Mikroskop und beginnen Sie, die Zellen mit Krebslösung zu durchbluten. Markieren Sie die entsprechenden Zellen und wählen Sie ein gutes Feld aus. Bestimmen Sie manuell die Regionen von Interesse, indem Sie Zellkörper basierend auf ihrer unterschiedlichen Morphologie auswählen.
Die Variationen der Calciumkonzentration wurden durch Quantifizierung des Verhältnisses der Fluoreszenz, die bei 510 nm nach abwechselnder Anregung bei 340 und 380 nm emittiert wurde, bewertet. Nach der Zugabe von Kaliumchlorid ist es möglich, viele Zellen leuchten zu sehen und die Fluoreszenzreaktion in der Grafik zu erhöhen. Kaliumchlorid öffnet spannungsgesteuerte Kalziumkanäle, die hauptsächlich in Neuronen vorhanden sind.
Jede einzelne Linie im Diagramm stellt die einzigartige Region von Interesse dar. Daher ist es möglich, einzelne Zellreaktionen während des Experiments zu verfolgen. ATP-Stimuli öffnen den P2X7-Rezeptor, der im Wesentlichen von Gliazellen exprimiert wird.
Dies ist eine angereicherte Neuronenkultur. Daher gibt es hier nur wenige Gliazellen. Dies ist der Grund, warum so wenige Zellen auf die ATP-Reize reagieren.
Die erfassten Werte wurden mit der Metafluor-Software verarbeitet. Experimentelle Ergebnisse werden in einer Excel-Tabelle ausgedrückt, in der jede Zeile eine einzelne Zelle und jede Zeile einen Zeitpunkt darstellt. Mit Excel-Software ist es möglich, Kalziumvariationen einzelner Zellen separat oder von allen im selben Diagramm darzustellen.
Um die Menge an reaktiven Zellen für einen Stimulus zu quantifizieren, legen Sie einen Grenzwert von 30% fest, der den Kalzium-Ausgangswert erhöht. Hier verwenden wir Netzhautzellen in Kultur ab embryonalen Küken des 8. Tages, um zu untersuchen, wie Neuronen und Glia in Bezug auf Kalziumverschiebungen signalisieren, nachdem sie 50 mm Kaliumchlorid und 1 mm ATP-Reize erhalten haben. In jedem Experiment wurden etwa 100 Zellen leicht analysiert.
Abbildung A stellt eine Mischkultur dar, die sowohl Neuronen als auch Glia enthält und eine Woche lang aufrechterhalten wurde. Wenn wir die Antworten quantifizieren, ist es möglich zu sehen, dass etwa die Hälfte der analysierten Zellen Kaliumchlorid antwortet und die andere Hälfte auf ATP reagiert. Abbildung B bezieht sich auf eine mit Neuronen angereicherte Kultur.
Es wurde nur drei Tage lang inkubiert, daher haben sich die meisten Gliazellen noch nicht differenziert. In diesem Fall antworten 89% der Zellen auf Kaliumchlorid und verstärken die Prävalenz von Neuronen. Abbildung C zeigt eine gereinigte Gliakultur.
Diese Zellen wurden 10 Tage lang mit mittleren Änderungen alle drei Tage aufrechterhalten. Nach dieser Zeit sterben die meisten Neuronen und hinterlassen nur noch Glia. Tatsächlich wurde diese Kultur ausschließlich von ATP aktiviert.
Diese Methodik wurde aufgrund der universellen Eigenschaften von Kalzium als Second Messenger breit angewendet. Die phänotypische Analyse kann verbessert werden, indem diese Methodik mit der Immunchemie fester Zellen nach der Kalziumbildgebung ergänzt wird. Dieses Protokoll könnte auch an andere Mischzellsysteme angepasst werden, die andere Kalziumkanäle exprimieren.
Der wichtige Tipp ist, selektive Reaktionen verschiedener Zelltypen zu finden, die mit ihrer phänotypischen Expression korrelieren.
