Diese Methode ermöglicht die Erfassung und Quantifizierung der neuronalen Aktivität über die bilateralen kortikalen Regionen der Maus über einen längeren Zeitraum in vivo. Die beiden Photonentechnik hat den Vorteil, dass sie die Aktivität gleichzeitig in großen oder dispergierten neuronalen Populationen über einen längeren Zeitraum erkennt. Die Implikationen dieser Technik erstreckten sich auf die Untersuchung von Aktivitätsmustern in definierten neuronalen Populationen in verschiedenen Regionen des lebenden Gehirns.
12 Stunden vor Beginn des Verfahrens, wärmen Sie die optischen Fenster bei 50 Grad Celsius in 70% Ethanol. Ein optisches Fenster besteht aus einem runden Deckelglas mit fünf Millimetern Durchmesser und einem unteren Teil, der ein rundes Deckglas mit drei Millimeterdurchmessern enthält. Bestätigen Sie am Ende der wärmenden Inkubation einen Mangel an Reaktion auf Zehenkniff auf eine anästhesierte 20 bis 25-Gramm 1 1/2 bis 2 1/2 Monate alte Thy1 GCaMP6s Maus, und tragen Sie Salbe auf die Augen des Tieres auf.
Legen Sie die Maus auf ein Heizkissen, das mit einem sterilen Vorhang bedeckt ist, und verwenden Sie einen Kopfhalter für Mäuse, um den Kopf zu stabilisieren. Rasieren Sie den größten Teil der Kopfhaut mit einem zweischneidigen Rasiermesser, und reinigen Sie die exponierte Haut mit sequenziellen sterilen AlkoholvorbereitungPads und Povidon-Jod-Lösung Peelings. Dann verwenden Sie eine Schere, um eine rechteckige zwei mal drei Millimeter in der Kopfhaut auf der rechten Seite des Schädels geschnitten zu machen.
Mit einem Wattestäbchen schieben Sie die Haut zur Seite, um eine Belichtungsfläche von mehr als drei Millimetern Durchmesser zu schaffen, und verwenden Sie eine stumpfe mikrochirurgische Klinge, um das am Schädel befestigte Bindegewebe sanft zu entfernen. Mit einem Zahnbohrer einen Kreis von drei Millimetern Durchmesser um den S1-Bereich sanft markieren. Nachdem Sie einen ähnlichen Kreis auf der linken Seite des Schädels gemacht haben, wenden Sie eine dünne Schicht Cyanoacrylat-Superkleber auf beide Seiten des Knochens an, um eine Basis für eine zahnärztliche Zementanwendung zu bieten.
Verwenden Sie unter einem Sezierendes Mikroskop einen Hochgeschwindigkeits-Mikrobohrer, um eine kreisförmige Nut in der rechten Seite des Schädels um den S1-Bereich zu verdünnen, um eine glatte Kante zu erzeugen, wobei die Knochenreste bei Bedarf mit einem Vakuum ansaugt werden. Nachdem eine ca. 2/3 Knochentiefe erreicht wurde, die restlichen 1/3 Knochen langsam und vorsichtig ausdünnen, bis eine kreisförmige Knochenklappe vollständig aus dem umgebenden Schädel befreit ist. Verwenden Sie ein Paar 5/45 Zangen, um langsam und vorsichtig das kreisförmige Stück Knochen zu entfernen, um die Dura zu belichten, wobei darauf zu achten ist, dass die Pialgefäße nicht beschädigt werden.
Nachdem Sie eine Knochenklappe von der linken Seite des Schädels auf die gleiche Weise entfernt haben, spülen Sie das optische Fenster für die rechte Seite des Schädels mit steriler Saline ab und überprüfen Sie unter einem Stereomikroskop auf Unvollkommenheiten. Installieren Sie das optische Fenster über dem Craniotomie-Bereich mit dem oberen Teil des Fensters, der auf dem Schädel ruht, und dem unteren Teil innerhalb der craniotomisierten Öffnung, die auf der Dura ruht, in Gegenwart von zerebraler Rückenmarksflüssigkeit. Verwenden Sie den Cyanoacrylat-Superkleber, um den oberen Teil der optischen Fensterkante zum Schädel zu versiegeln.
Wenn der Kleber getrocknet ist, tragen Sie schwarzen Zahnzement auf den Rand des Glases, den Rest der rechten Seite des freiliegenden Schädels und die Wundränder, um das Licht zu blockieren. Dann installieren Sie das linke optische Fenster und lassen Sie das Tier mit Überwachung bis zur vollen Rekrementigkeit erholen. Sieben bis zehn Tage nach dem Eingriff legen Sie das anästhesierte Tier in den Kopfhalter auf einem Heizkissen unter einem Zwei-Photonen-Mikroskop und achten darauf, dass das optische Fenster und die rechte Seite des Schädels senkrecht zur optischen Achse des Mikroskops ausgerichtet sind.
Erfassen Sie ein erstes Referenzkartenbild des Schädelfensters mit Hellerfeldbeleuchtung bei der vierfachen Vergrößerung. Nach dem Erfassen mehrerer Bilder derselben Interessensregion, bilde die Kalziumdynamik innerhalb des S1-Bereichs in der linken Hemisphäre ab und kalkuliere die Veränderungen der Fluoreszenz aus jeder Region, die auf beiden Seiten des Schädels von Interesse sei. In diesen repräsentativen Bildern wurden dendriten und ein Blutgefäß innerhalb einer EGFP-exezierenden Maus einen Tag nach der Installation des optischen Fensters in verschiedenen Tiefen in Schicht zwei der S1-Region visualisiert.
Die Z-Projektionsbilder wurden an den Tagen eins und sieben nach der optischen Fensterimplantation aufgenommen, was eine bemerkenswert stabile Anzahl und Lage der dendritischen Zweige und Stacheln während des Versuchszeitraums veranschaulicht. Die Messung des intrazellulären Kalziumtransienten in Thy1 GCaMP6s transgenen Mäusen ermöglicht die Quantifizierung der spontanen Kalziumaktivität und der Populationen der Schicht fünf pyramidalen Neuronen, die sich so tief wie 500 Mikrometer unter der Pia befinden, sowie die Berechnung der durchschnittlichen Anzahl spontaner Reaktionen im Laufe der Zeit. Ein Forscher, der sowohl in der Schädelfenstervorbereitung als auch in vivo in zwei photonen calcium-Imaging-Techniken geschult ist, sollte in der Lage sein, Aufnahmen von 100 bis 200 Neuronen auf beiden Seiten des Schädels bei ein bis zwei Tieren pro Tag zu erhalten.
Mit einem offenen optischen Fenster auf jeder Seite des Schädels ermöglicht die Methode die Aufzeichnung der neuronalen Aktivität über symmetrische Säugetierhirnregionen hinweg für eine längere und stabile Kalziumbildgebung in vivo. Diese Methode kann auch verwendet werden, um kortikale Aktivität und Plastizität nach einseitigen Verletzungen des peripheren oder des zentralen Nervensystems zu studieren. Nachdem Sie sich dieses Video angeschaut haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie bilaterale Schädelfenster zur Messung der Kalziumdynamik mit einem Zwei-Photonen-Mikroskop in transgenen Thy1 GCaMP6s-Mäusen installieren können.
