Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem NIH (DC007681, AB), CT Stem Cell Zuschuss (AB), Pardee Stiftung (AB), Predoctoral Ruth L. Kirschstein National Research Service Awards (NRSA) (SZY) und einer NSF Graduate Research unterstützt Fellowship (BL). Wir danken den Bordey lab Mitglieder für ihre hilfreichen Kommentare zum Manuskript. Das vorliegende Material ist auf der Arbeit teilweise durch den Staat Connecticut unter dem Connecticut Stem Cell Research Grants Program unterstützt werden. Die Inhalte sind allein in der Verantwortung der Autoren und stellen nicht notwendigerweise die offizielle Meinung des Staates Connecticut, Incorporated das Department of Public Health des Staates Connecticut oder CT Innovationen.

Ein. Herstellung von Lösungen, Dissection und Vibratom <ol><li> Die Lösungen müssen in der richtigen Osmolarität und pH-Wert (Tabelle 1) hergestellt werden. Verglichen mit künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF) wird Dissektion Lösung mit niedrigeren Konzentrationen von Natrium und Calcium, und höhere Konzentrationen an Magnesium hergestellt. Dies ist zu Exzitotoxizität Effekte während des Schneidens zu minimieren. </li><li> Beide Dissektion und ACSF Lösungen müssen mit 95% O 2/5% CO 2 durch Einblasen von mindestens 10 min, um den gewünschten pH-Wert von 7,3 zu erreichen. Gesättigt sein </li><li> Bereiten Sie ein Eisbad in einem Tablett. Legen Sie eine Dissektion Platte im Eisbad und füllen mit Dissektion Lösung. Blase die Dissektion Platte. </li><li> Bereiten Sie die Vibratom durch die Schaffung eines Eisbad. Legen Sie das Schneiden Gericht im Eisbad, füllen Sie die Schale mit Dissektion Lösung und Blase. </li><li> Füllen Sie das Slice-Aufnahmekammer mit ACSF und Blase, diese Lösung zu gewährleisten ausreichend belüftet unabhängigvon denen Scheiben angeordnet sind. </li></ol> 2. Removal of Brain Tissue Akute Hirnschnitten tendenziell gesünder mit jüngeren Mäusen. Die postnatale SVZ die zelluläre Architektur in Nagetieren ist reif rund postnatalen Tag (P) 20 1. Deshalb versuchen wir, unseren Experimenten zu Maus Alter von P20-P30 zu begrenzen, aber wir haben erfolgreiche Versuche bei Mäusen so alt wie die 3 Monate durchgeführt. Während der gesamten Handhabung des Gewebes, muss man darauf achten, die mechanischen Bewegungen und Druck auf das Gehirn zu minimieren, halten gekühlten Bedingungen, und setzen die SVZ zur Lösung so schnell wie möglich nach der Tötung. <ol><li> Nach Injektion von Pentobarbital wird die Maus schnell enthauptet. Das Fell wird entfernt und Einschnitte durch die Basis des Schädels hergestellt. Der Kopf wird dann in eine Schale mit Dissektion Lösung gefüllt war. </li><li> Während Stabilisierung des Kopfes mit einer Pinzette, kontinuierliche Schnitte um den Schädel gemacht und manchmal bis zur Mittellinie mit Microscissors. Seien Sie vorsichtig, um den Kontakt mit dem Gewebe zu minimieren. Da der Riechkolben ist das endgültige Ziel der neugeborenen Neuronen aus dem SVZ, muss man darauf achten, bewahren diese Region, vor allem während Knochenentfernung in dieser Gegend. Microscissor Schnitten um den Schädel sollten auf der dorsalen Seite zu sein, um für ein leichtes Entfernen des Schädels zu ermöglichen. </li><li> Entfernen des Schädels über dem Gehirn wird nun aus den Knochen unterhalb des Gehirns getrennt. Wenn Schnitte im vorherigen Schritt richtig gemacht sind, kann dies darüber liegenden Knochen leicht mit einer Pinzette oder einer Pinzette entfernt werden. </li><li> Halten Sie den Kopf mit einer Pinzette, kann man einem Skalpell sauber zu entfernen mehrere Stücke von Hirngewebe vor Slicing, wie die folgenden. Ein koronalen Schnitt kann auf der Ebene der Lambda erfolgen. Sagittalen Schnitte auf beiden Seiten des Gehirns lateral der SVZ erfolgen. Eine konservative Schätzung würde ~ 2,5 mm von der Mittellinie liegen. Falls gewünscht, kann das Gehirn auch hier hemisected werden. Diese Kürzungen werden sowohl facilitate Befestigung des Gewebes und damit die SVZ mehr schnell erreicht werden beim Gehirn schneiden. Es ist wichtig, sich zu erinnern, die minimale Menge von mechanischen Kräften auf das Gehirn (zB nicht Schieben oder Ziehen) auszuüben. </li></ol> 3. Akute Hirnschnitt Vorbereitung <ol><li> Um für die weiteren Schritte vorzubereiten, sicherzustellen, dass die Super-Klebstoff verwendet werden, um das Gewebe zu montieren frei von Verstopfungen und bereit für die Vibratom Platte anzuwenden. Es ist wichtig, möglichst schnell gehen, ohne Schädigung des Gehirns. </li><li> Das Hirngewebe kann dann von unten, die das Gewebe trennt sich von den darunter liegenden Knochen gleichzeitig trennt Nerven geschöpft werden. </li><li> Das Gewebe wird fertig verklebt auf einer Platte und auf dem Vibratom. Aufgrund der rostral-kaudale Anatomie des SVZ, haben wir uns darauf sagittale Schichten, wie es die wandernden Weg der Neuroblasten, die Gliazellen Scheide und das Gefäßsystem, die weitgehend in diese Richtung ausgerichtet sind konserviert konzentriert. Man kann entweder mount das Gewebe an der Mittellinie oder auf der flachen Oberfläche, indem sie sagittalen Schnitte quer zur SVZ erstellt. Ein optionaler Schritt ist, eine 3% Agarose Block hinter dem Gewebe zu platzieren, um als Anschlag zu der Klinge dienen als die Scheiben abgehen. Wir bevorzugt Cyanoacrylat-Basis Superkleber verwendet. </li><li> Spülen Sie die Klinge mit Ethanol zur Beseitigung von Ölen und spülen mit destilliertem Wasser. Zeigen die Klinge am Klingenhalter. Montieren Sie den Messerhalter der Vibratom. </li><li> Passen Vibratom Einstellungen, um Gewebe in einer Dicke von 250 bis 350 um pro Scheibe geschnitten. Es ist wichtig, um den Vorgang mit hochfrequenten Schwingungen und mit geringer Geschwindigkeit. </li><li> Abschnitt progressiv durch das Gewebe. Das Aussehen der Riechkolben ist ein guter Indikator dafür, dass ein in der Nähe des SVZ in sagittaler Scheiben als die meisten seitlichen Scheiben weder Region enthalten wird, ist. Weitere Sehenswürdigkeiten zu suchen sind die Herzkammer und die Verdickung des Corpus callosum, unter dem die SVZ befindet. Die SVZ erscheint in mehreren seitlichen Sagit erstental Scheiben schneiden. Das RMS wird im medialen sagittalen Schnitte zeigen. </li><li> Entfernen Sie Scheiben mit der SVZ mit einem Kunststoff-Pasteurpipette mit der Spitze abgeschnitten. Übertragen auf die Scheibe Aufnahmeraum. Wir erhalten oft mehr Scheiben als wir in einem Werk Tag nutzen können. Allerdings werden Scheiben von der Menge der Zellen, die das SVZ variieren. Es ist manchmal notwendig, um durch mehrere Scheiben schauen, um ein für die Bildgebung gewünschte zu finden. </li></ol> 4. Vorbereitung Mikroskop und Farbstoffe Die Scheiben müssen eine Stunde Inkubationszeit in ACSF von der Dissektion und Schneiden erholen. Mehrere Schritte können während dieser Scheibe Erholungsphase durchgeführt werden. <ol><li> Vorbereitung von Pipetten für Calcium Farbstoff und / oder Drug Application <ol class="lalpha"><li> Glaspipetten benötigen, um eine Spitze von 2-3 um Durchmesser und einer Spitze Länge (~ 2 mm) und Winkel (~ 16 ° für den Pipettenhalter), die Kontakt mit dem verhindert Perfusionskammer haben und erlaubt eine Platzierungdas Ziel. </li><li> Man kann in der Regel bereiten 6-8 Druck Pipetten für jeden Tag der Experimente. </li></ol></li><li> Calcium Farbstoffzubereitung <ol class="lalpha"><li> Bei der Herstellung der Arbeitslösung (4-5 uM durch Bad, 250 uM durch Druck-Anwendung), ist es am besten, um die minimale Menge an DMSO, um Zellen aussetzen. Dies kann durch hochkonzentrierte Bestände erreicht werden kann. Zum Beispiel für Fluo-4, ist ein Rohr, enthaltend 50 g pro Tag verwendet wird. Man kann eine 10 mM Vorratslösung dieses Aliquot durch Zugabe von 4,6 ul Pluronic F-127 20% ige Lösung in DMSO machen. </li></ol></li><li> Vorbereitung Mikroskop-Setup (Abbildung 2). <ol class="lalpha"><li> Verwendung einer peristaltischen Pumpe für einen Lösungsfluß half Bilddrift minimieren. Führen Sie die Schlauchpumpe vor, damit ACSF durch die Perfusion verlaufen und sicherzustellen, dass es blasenfrei ist. </li><li> Röhren-Einlass auf der Perfusionskammer und sicherzustellen, dass keine Leckagen. </li><li> Positionieren Sie den Vakuum-Spitze ensure, dass die Lösung, die ausgewählt ist aus der Perfusionskammer abgesaugt. Sicherzustellen, dass er auf einem adäquaten Niveau ist so, dass das Ziel die richtige Arbeitshöhe Abstand eingetaucht wird, aber nicht so hoch, so daß Lösung kann über die Kammer gelangt. Ein niedriges Niveau der Lösung minimiert auch Flow Verzerrungen. Eine ständige Streben können auch durch das Hören für Stabilität überprüft werden. </li></ol></li></ol> 5. Dye Loading Dieses Verfahren ist im Detail in einer anderen Manuskript 2 beschrieben. Bitte siehe Abbildungen darin. <ol><li> Bath Ladefarbstoff <ol class="lalpha"><li> Machen Sie eine 1-2 ml Arbeitslösung des Farbstoffes. Für Fluo-4 AM, ist eine Konzentration von 4-5 uM ausreichend für die Kennzeichnung SVZ Neuroblasten. </li><li> Scheiben werden zunächst für eine 35 mm Kulturschale mit einem Siebeinsatz, das bereits mit ACSF gefüllt übertragen. Ersetzen Sie die Lösung unter Verwendung eines 3 ml Kunststoff-Pipette vorsichtig entfernen ACSF, während gleichzeitige Zugabe des calcium Farbstoff funktionierende Lösung. </li><li> Inkubieren bei 37 ° C für 30-60 min in einer 5% CO 2-Gas-kontrollierten Umgebung. </li><li> Legen Sie die Scheibe wieder in den ACSF gefüllte Vorratskammer abzuwaschen Farbstoff, keine Zellen eingegeben hat. Alternativ kann man sie direkt auf den Mikroskop Perfusionskammer, auf dem ACSF wird. Diese Wäsche beträgt 30-45 min. </li><li> Übertragen Sie das Slice der Perfusionskammer. </li></ol></li><li> Druckbeaufschlagung von Farbstoff <ol class="lalpha"><li> Übertragen der Scheibe von der Haltekammer zum Perfusionskammer am Mikroskop Setup. </li><li> Füllen Sie ein Glas Pipette mit eine funktionierende Lösung, die 250 uM und auf den Mikromanipulator ist. </li><li> Senken Sie die Pipette in die Region von Interesse. Die Pipette kann derart platziert werden, dass die Spitze entweder mehrere Mikrometer über der Scheibenoberfläche oder vergraben mehrere Mikrometer unterhalb der Scheibenoberfläche, aber entfernt von der aufgenommenen Region. Der Winkel der Pipette nicht Affect das Laden Effizienz. Bei der Abbildung unterhalb der Scheibenoberfläche, finden wir, dass die Platzierung der Pipettenspitze unterhalb der Bildebene wird von uns gewünschten Bildbereich besser kennzeichnen. </li><li> Wenn der Druck der Farbstoff Anwendung, stellen Sie den Picospritzer so dass es &lt;3 psi ist. Wir haben nicht das Volumen der Farbstoffdiffusion geschätzt, weil diese unterliegt Schwankungen der Pipettenspitze Durchmesser, angelegten Druck, und der Dichte des Gewebes, wo der Farbstoff injiziert. Wir wenden einfach, bis wir unsere gewünschte Beladung zu erreichen, wie mit dem Auge beurteilt. Minimieren Beschädigung der Scheibe während der Applikation, insbesondere, wenn die Spitze unterhalb der Scheibenoberfläche angeordnet ist. Bewerben Sie sich für 1-2 min. Manchmal wiederholten Anwendungen notwendig sind je nach Kennzeichnung als mit dem Auge beurteilt. Aus diesem Konzentration und Anwendungsdauer, finden wir, dass Oberflächen Anwendung der Farbstoff bevorzugt beschriftet Neuroblasten, während unter der Oberfläche Anwendung bevorzugt beschriftet Astrozyten. Allerdings wird&gt; 3 min Anwendung bei 500 uM auch benennen Neuroblastenunabhängig davon, ob die Spitze oberhalb oder unterhalb der Scheibenoberfläche (JC Platel, unveröffentlichte Beobachtung). Lassen Sie für Wasch-und Slice-Recovery für 30-45 min. </li></ol></li></ol> 6. Konfokalen Imaging von Calcium Activity <ol><li> Finden Sie die Region von Interesse zunächst mit einer geringeren Leistung Ziel wie 4x oder 10x. Platz in der Mitte des Feldes vor dem Wechsel zu einer höheren Macht Ziel. An diesem Punkt kann ein allgemeiner slice Gesundheit mit der Feststellung, das Aussehen der SVZ-Zellen unter Differential-Interferenz-Kontrast (DIC) zu beurteilen. Gesunde Zellen erscheinen rund und plump. Darüber hinaus werden gesunde Zellen anzuzeigen schwachen Fluo-4 Belastung wie zu keiner Belastung bei allen oder helle Fluoreszenz (eine sterbende Zelle) angenommen. </li><li> Senken Sie das Wasser-Immersions-Objektiv auf die Region von Interesse, welche nun farbstoffbeladenen. Entweder ein 40x oder 60x Ziel war für unsere Bedürfnisse ausreichend, obwohl 40x bietet ein breiteres Sichtfeld und ermöglicht eine größere Pipette Zugang. Bei der Abbildung unterhalb derOberfläche, wir gehen oft mindestens 15 &amp;mgr; m unterhalb der Scheibe Oberfläche, wo die 3-dimensionale Architektur und Zell Gesundheit besser erhalten bleiben. </li><li> Stellen Sie sicher, dass die Perfusion und Vakuum werden angemessen funktioniert. </li><li> Richten Sie das Mikroskop, so dass Zeitraffer-Auflösung und räumliche Auflösung gewünschten Raten eingestellt sind. Für die konfokale Mikroskopie, müssen diese Faktoren als Erhöhung Zeitauflösung ausgeglichen werden gewöhnlich zu einem Verlust an räumlicher Auflösung aufgrund der Scanbewegung Natur des Systems. Für Calcium Aktivität haben wir einen Rahmen etwa jede zweite mit einem 512x512 Bildpunkten abgebildet. Wenn mehrere Kanäle separat erworben notwendig sind, wird sich dies auch auf Abtastraten. Stellen Dauer der Film (2-10 min). </li><li> Initiieren laufen. Wenn die Durchführung pharmakologischer Studien, auf Antagonisten oder nicht-desensibilisierenden Agonisten waschen für mindestens 5-10 min, und dann noch einen Film von 5-10 min. Agonisten, die Rezeptoren desensibilisieren kann akut können angewendet werden, wie beispielsweise durch Verwendung einer prEssure Pipette durch einen Mikromanipulator gesteuert. </li></ol> 7. Calcium Analyse Analyse folgt Standardverfahren, dass wir in pervious Veröffentlichungen beschrieben 2-4. F 0 (dh Baseline) und F sind die mittleren Fluoreszenzintensitäten über alle Regionen von Interesse (ROI) und in jedem ROI gemessen. Eine Änderung in der Fluoreszenz wurde als ein Ca 2 + Erhöhung sein, wenn es&gt; 15% war F / F 0 erhöhen. Intrazellulärer Ca 2 + Veränderungen wurden anhand Calsignal 5. 8. Repräsentative Ergebnisse Wir waren in der Lage, um eine selektive Beladung von SVZ Zellen in Abhängigkeit von den Farbstoff Belastungsprotokolle oben beschrieben und anderswo 2-4,6 erhalten. Bath Belastung oder Druck-Anwendung auf dem Scheibenoberfläche Fluo-4 AM (4-5 oder 250 uM, jeweils) Etiketten meist Neuroblasten. Während der Druck-Anwendung laden können neurobdauert schneller als Badbelastung in einer einzigen Scheibe, ermöglicht Badbelastung die gleichzeitige Laden von mehreren Scheiben. Wir bestätigen die Identität von markierten Zellen als Neuroblasten durch (1), ob sie Zugverhalten 4,7, (2) ihre Morphologie, (3) eine negative Färbung des Sulforhodamin 101, eine Astrozyten-spezifischen Farbstoff 3 oder (4) eine positive Färbung mit Display DCX-DsRed Ausdruck (JC Platel, unveröffentlichte Beobachtung). Neuroblasten schnell migrieren (durchschnittlich 60 um / h) bei physiologischen Temperaturen 4,7-9, aber ihre Bewegung kann leicht beobachtet werden, selbst bei Raumtemperatur. Die Bewegung der Neuroblasten nicht stellen ein Problem in Bezug auf Platzierung regions-of-interest (ROI) von Calcium-Aktivitäten zu verfolgen, da unsere Filme sind in der Regel von kurzer Dauer. Doch während lange Wartezeiten, wie zum Beispiel während Arzneimittellösung Austausch, müssen die Ermittler vorsichtig sein, um ROIs in Kontroll-und Behandlungsgruppen Zeiträume entsprechen. Es ist nicht ungewöhnlich für Neuroblasten in das oder aus dem i migrieren<html> Maging Feld oder Brennebene. Pressure Anwendung von Fluo-4 AM (250 uM) tief in die Scheibe und für begrenzte Dauer (&lt;2 min) bevorzugt beschriftet SVZ Astrozyten 2. Astrocyten Etikettierung durch positive Markierung mit Sulforhodamin 101 und ihre Morphologie verifiziert worden, insbesondere durch das Vorhandensein von Vorsprüngen und endfeet auf Blutgefäße, die neu 3 beschrieben haben. Mit diesen Methoden haben wir spontane Aktivität sowohl in der SVZ Neuroblast und Astrozyten Population (Abbildung 1) beobachtet. Die Aktivität in Astrozyten nimmt oft die Form von Wellen, die Blutgefäß 3 eingreifen. Darüber hinaus mit Calcium-Imaging als Assay wurde die Anwendung von pharmakologischen Agonisten offenbart oder bestätigt Expression von GABA A-Rezeptoren auf Neuroblasten und Astrozyten 6, Rezeptoren AMPA und NMDA auf Neuroblasten 4. Figures 1 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/4071/4071fig1.jpg &quot;/&gt; Abbildung 1. Propagierung von Calcium Aktivität in Astrozyten. (A) Repräsentative gemittelt Bild aus einer Zeitraffer-Aufnahme von Kalzium Aktivität. Astrozyten im SVZ wurden mit Druck Anwendung von Fluo-4 geladen Uhr in die Scheibe tief. Filme wurden bei 0,75 s Zeit-Schritten erworben. Regions of Interest (ROI) über Zellen, die eine Tätigkeit gelegt. (B) von Spuren platziert ROIs über Zellen, die aus dem Film in (A) dargestellt. Spuren wurden mit einem gleitenden Durchschnitt und normalisierte gefiltert. Die vertikale Skala repräsentiert 2 x &amp;Dgr; F / F 0, wobei F die Signalintensität und F 0 der mittlere Ausgangswert-Signal und AF = FF 0. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/4071/4071fig2.jpg" /> Abbildung 2. Bild des Perfusionssystem. Ein Ende der Röhre wird in 95% O 2/5% CO 2-Gas-p untergetauchterfused Lösung. Die Lösung wird dann durch das Rohr und der Badkammer durch eine peristaltische Pumpe (nicht dargestellt) perfundiert. Das andere Ende ist in die Lösung Einlass der Badkammer montiert auf einer Plattform eingefügt. Die Absaugspitze wird dann zu der Lösung Auslass der Kammer angeschlossen und auf einer Ebene zur Lösung Höhe zu bestimmen. Aus der Steckdose, ist die Absaugspitze mit der Vakuumleitung, welche die Lösung ansaugt aus der Kammer in einen Abfallbehälter verbunden ist. Die Perfusion wird aus dem Mikroskoptisch für visuelle Klarheit dargestellt.

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Calcium Bildgebung SVZ Zellen verwendet wurde, um Muster in spontaner Aktivität in Neuroblasten 10, Rezeptorkanals Expression in beiden Neuroblasten und Astrozyten und 4,6,8 astrozytären Calciumwellen 3 studieren. Da Zellen in der SVZ entweder unreif sind oder glialen Eigenschaften, sie nicht feuern Aktionspotentiale 11,12, was bedeutet, dass Millisekunde Veränderungen in Spannungspotential indikativ Aktivität in reifen Netzen nicht anwendbar ist in dieser Region. Daher er...

<table border="1"><tbody><tr><td> Solute </td><td> Firma </td><td> Catalog Number </td><td> Dissection (mM) </td></tr><tr><td> Saccharose </td><td> Sigma </td><td> S0389 </td><td> Dissection: 147 mM ACSF: 0 mM </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma </td><td> S9888 </td><td> Dissection: 42 mM ACSF: 126 mm </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Sigma </td><td> P3911 </td><td> Dissection: 2,5 mM ACSF: 2,5 mM </td></tr><tr><td> MgCl 2 .6 H 2 O </td><td> Sigma </td><td> M9272 </td><td> Dissection: 4,33 mM ACSF: 1 mM </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4. H 2 O </td><td> Sigma </td><td> S8282 </td><td> Dissection: 1,25 mM ACSF: 1,25 mM </td></tr><tr><td> Glucose </td><td> Sigma </td><td> G8270 </td><td> Dissection: 10 mM ACSF: 10 mM </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Sigma </td><td> S6014 </td><td> Dissection: 26 mM ACSF: 26 mM </td></tr><tr><td> CaCl 2 .2 H 2 O </td><td> Sigma </td><td> C3306 </td><td> Dissection: 1,33 mM ACSF: 2 mM </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Chemical Liste und Rezepte der Dissektion Lösung und ACSF. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> [Header] </td></tr><tr><td> Name </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Vibratom </td><td> Leica </td><td> VT 1000S </td><td></td></tr><tr><td> Super Glue </td><td> Surehold oder 3M </td><td> Surehold 3G Super Glue oder 3M Vet-Bond </td><td></td></tr><tr><td> Dissection Tools </td><td> Roboz oder Ted Pella </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Fluo-4 AM Calcium-sensitiven Farbstoffes </td><td> Invitrogen </td><td> F14201 </td><td></td></tr><tr><td> Oregon Green BAPTA-01.00 Calcium-sensitiven Farbstoffes </td><td> Invitrogen </td><td> O6807 </td><td></td></tr><tr><td> Pluronic F-127 20% ige Lösung in DMSO </td><td> Invitrogen </td><td> P3000MP </td><td></td></tr><tr><td> Aufrechte Konfokalmikroskop </td><td> Olymp </td><td> FV300 oder FV1000 </td><td></td></tr><tr><td> Wasser-Immersions-Objektive </td><td> Olymp </td><td> LUMPlanFl 40 x W / IR (NA 0,80); LUMPlanFl 60 x W / I (NA 0,90) </td><td></td></tr><tr><td> Mikromanipulatoren </td><td> Sutter </td><td> MPC-200/MPC-325/MPC-385 </td><td></td></tr><tr><td> Druckregler &lt;/ Td&gt; <td> Parker Hannifin </td><td> Picospritzer </td><td> &lt;3 PSI während der Anwendung </td></tr><tr><td> Pipette puller </td><td> Sutter oder Narshige </td><td> Sutter P-97 oder Narshige PP-830 </td><td></td></tr><tr><td> Glaspipetten </td><td> Sutter </td><td> BF150-110-10 </td><td> ID: 1,10, OD: 1,50 </td></tr><tr><td> Schlauchpumpe </td><td> Harvard Apparatus </td><td> Modell 720 </td><td> Fließgeschwindigkeit: 1 ml / min </td></tr><tr><td> Chamber Bad </td><td> Warner Instruments </td><td> RC-26 GLP </td><td> Low-Profil ermöglicht eine objektive Abstand </td></tr><tr><td> Rohr </td><td> Tygon </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Temperaturregler </td><td> Warner Instruments </td><td> TC-324B/344B </td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Materialien / Geräte Liste.

preparation of acute subventricular zone slices for calcium imaging

Die subventrikulären Zone (SVZ) ist einer der beiden neurogenen Zonen in der postnatalen Gehirn. Die SVZ enthält dicht gepackten Zellen, einschließlich neuralen Vorläuferzellen mit astrozytären Funktionen (genannt SVZ Astrozyten), Neuroblasten und mittleren Vorläuferzellen. Neuroblasten in der SVZ geboren tangential migrieren eine große Entfernung zum Riechkolben, wo sie differenzieren sich in Interneuronen. Interzelluläre Signalisierung durch Adhäsionsmoleküle und diffusionsfähigen Signale spielen wichtige Rollen bei steuernden Neurogenese. Viele dieser Signale auslösen interzellulären Kalzium-Aktivität, die Informationen innerhalb und zwischen Zellen überträgt. Calcium-Aktivität ist deshalb reflektierenden der Aktivität von extrazellulären Signalen und ist eine optimale Möglichkeit, funktionelle interzellulären Signalisierung zwischen SVZ Zellen zu verstehen. Calcium-Aktivität wurde in vielen anderen Regionen und Zelltypen, einschließlich reife Astrozyten und Neuronen untersucht worden. Allerdings ist die traditionelle Methode, um load-Zellen mit Calcium-Indikator-Farbstoff (dh Badbelastung) war nicht beim Laden alle SVZ Zelltypen effizient. Tatsächlich schließt die Zelldichte in der SVZ Farbstoffdiffusion innerhalb des Gewebes. Darüber hinaus wird die Vorbereitung sagittalen Schnitten bessere Erhaltung der dreidimensionalen Anordnung SVZ Zellen, insbesondere der Strom der Neuroblast Migration auf dem rostralen-kaudalen Achse. Hier beschreiben wir Methoden, um Sagittalschnitten mit der SVZ, die Belastung der SVZ-Zellen mit Calcium-Indikator-Farbstoff und den Erwerb von Kalzium Aktivität mit Zeitraffer-Filme erstellen. Wir verwendeten Fluo-4 AM Farbstoff zum Laden SVZ Astrozyten unter Druck Anwendung innerhalb des Gewebes. Calcium-Aktivität wurde mit einem konfokalen Mikroskop ermöglicht eine genaue Auflösung zur Unterscheidung von einzelnen Zellen. Unser Ansatz ist auf andere Zonen einschließlich neurogener der erwachsenen hippocampalen subgranularen Zone und embryonalen neurogenen Zonen. Darüber hinaus können andere Arten von Farbstoffenunter Verwendung des beschriebenen Verfahrens werden.

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Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging

Eine Methode zur subventrikulären Zone (SVZ) Zellen mit Calcium-Indikator Farbstoffe für die Aufnahme Calciumaktivität laden beschrieben. Die postnatale SVZ enthält dicht gepackten Zellen, einschließlich neuralen Vorläuferzellen und Neuroblasten. Anstatt Badbelastung injizierten wir den Farbstoff durch Druck im Inneren des Gewebes eine bessere Farbstoffdiffusion.

Vorbereitung der akuten Subventrikulärzone Slices für Calcium Imaging

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.1K Aufrufe.  Yale University School of Medicine. Eine Methode zur subventrikulären Zone (SVZ) Zellen mit Calcium-Indikator Farbstoffe für die Aufnahme Calciumaktivität laden beschrieben. Die postnatale SVZ enthält dicht gepackten Zellen, einschließlich neuralen Vorläuferzellen und Neuroblasten. Anstatt Badbelastung injizierten wir den Farbstoff durch Druck im Inneren des Gewebes eine bessere Farbstoffdiffusion.

Serie: Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging

The Subventricular Zone En-face: Wholemount Staining and Ependymal Flow

The walls of the lateral ventricles contain the largest germinal region in the adult mammalian brain. The subventricular zone (SVZ) in these walls is an extensively studied model system for understanding the behavior of neural stem cells and the regulation of adult neurogenesis. Traditionally, these studies have relied on classical sectioning techniques for histological analysis. Here we present an alternative approach, the wholemount technique, which provides a comprehensive, en-face view of this germinal region. Compared to sections, wholemounts preserve the complete cytoarchitecture and cellular relationships within the SVZ. This approach has recently revealed that the adult neural stem cells, or type B1 cells, are part of a mixed neuroepithelium with differentiated ependymal cells lining the lateral ventricles. In addition, this approach has been used to study the planar polarization of ependymal cells and the cerebrospinal fluid flow they generate in the ventricle. With recent evidence that adult neural stem cells are a heterogeneous population that is regionally specified, the wholemount approach will likely be an essential tool for understanding the organization and parcellation of this stem cell niche.

The lateral ventricle walls contain the largest germinal region in the adult mammalian brain. Traditionally, studies on neurogenesis in this region have relied on classical sectioning techniques for histological analysis. Here we present an alternative approach, the wholemount technique, which provides a comprehensive, en-face view of this germinal region.

Die Subventrikularzone En-face: Wholemount Färbung und Ependymale Durchfluss

The walls of the lateral ventricles contain the largest germinal region in the adult mammalian brain. The subventricular zone (SVZ) in these walls is an ...

Forschung

Neurowissenschaften

Neonatal Subventricular Zone Electroporation

Neural stem cells (NSCs) line the postnatal lateral ventricles and give rise to multiple cell types which include neurons, astrocytes, and ependymal cells1. Understanding the molecular pathways responsible for NSC self-renewal, commitment, and differentiation is critical for harnessing their unique potential to repair the brain and better understand central nervous system disorders. Previous methods for the manipulation of mammalian systems required the time consuming and expensive endeavor of genetic engineering at the whole animal level2. Thus, the vast majority of studies have explored the functions of NSC molecules in vitro or in invertebrates.
Here, we demonstrate the simple and rapid technique to manipulate neonatal NPCs that is referred to as neonatal subventricular zone (SVZ) electroporation. Similar techniques were developed a decade ago to study embryonic NSCs and have aided studies on cortical development3,4 . More recently this was applied to study the postnatal rodent forebrain5-7. This technique results in robust labeling of SVZ NSCs and their progeny. Thus, postnatal SVZ electroporation provides a cost and time effective alternative for mammalian NSC genetic engineering.

We demonstrate a minimally invasive technique referred to as neonatal subventricular zone electroporation. The technique consists of injecting plasmid DNA into the lateral ventricles of neonatal pups and applying electrical current to deliver and genetically manipulate neural stem cells

Neonatal Subventrikulärzone Elektroporation

Neural stem cells (NSCs) line the postnatal lateral ventricles and give rise to multiple cell types which include neurons, astrocytes, and ependymal ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to neuroblasts able to move along the rostral migratory stream (RMS) towards the olfactory bulb (OB). This long-distance migration is required for the subsequent maturation of newborn neurons in the OB, but the molecular mechanisms regulating this process are still unclear. Investigating the signaling pathways controlling neuroblast motility may not only help understand a fundamental step in neurogenesis, but also have therapeutic regenerative potential, given the ability of these neuroblasts to target brain sites affected by injury, stroke, or degeneration.
In this manuscript we describe a detailed protocol for in vivo postnatal electroporation and subsequent time-lapse imaging of neuroblast migration in the mouse RMS. Postnatal electroporation can efficiently transfect SVZ progenitor cells, which in turn generate neuroblasts migrating along the RMS. Using confocal spinning disk time-lapse microscopy on acute brain slice cultures, neuroblast migration can be monitored in an environment closely resembling the in vivo condition. Moreover, neuroblast motility can be tracked and quantitatively analyzed. As an example, we describe how to use in vivo postnatal electroporation of a GFP-expressing plasmid to label and visualize neuroblasts migrating along the RMS. Electroporation of shRNA or CRE recombinase-expressing plasmids in conditional knockout mice employing the LoxP system can also be used to target genes of interest. Pharmacological manipulation of acute brain slice cultures can be performed to investigate the role of different signaling molecules in neuroblast migration. By coupling in vivo electroporation with time-lapse imaging, we hope to understand the molecular mechanisms controlling neuroblast motility and contribute to the development of novel approaches to promote brain repair.

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

Neuroblast migration is a fundamental event in postnatal neurogenesis. We describe a protocol for efficient labeling of neuroblasts by in vivo postnatal electroporation and subsequent visualization of their migration using time-lapse imaging of acute brain slices. We include a description for the quantitative analysis of neuroblast dynamics by video tracking.

In-vivo-Elektroporation und Postnatale Zeitraffer-Imaging Neuroblast von Migration in Maus Akute Hirnschnitten

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. They successively generate transit amplifying cells (TACs) and neuroblasts that differentiate into neurons once they integrate the olfactory bulbs. Emerging fluorescent activated cell sorting (FACS) techniques have allowed the isolation of NSCs as well as their progeny and have started to shed light on gene regulatory networks in adult neurogenic niches. We report here a cell sorting technique that allows to follow and distinguish the cell cycle dynamics of the above-mentioned cell populations from the adult SVZ with a LeX/EGFR/CD24 triple staining. Isolated cells are then plated as adherent cells to explore in details their cell cycle progression by time-lapse video microscopy. To this end, we use transgenic Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) mice in which cells are red-fluorescent during G1 phase due to a G1 specific red-Cdt1 reporter. This method has recently revealed that proliferating NSCs progressively lengthen their G1 phase during aging, leading to neurogenesis impairment. This method is easily transposable to other systems and could be of great interest for the study of the cell cycle dynamics of brain cells in the context of brain pathologies.

We report a Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)-based method to isolate neural stem cells (NSCs) and their progeny from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain. Applied to Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) transgenic mice, it allows the study of cell cycle progression by live imaging.

Zellsortierung von Neural Stamm- und Vorläuferzellen aus dem erwachsenen Maus Subventrikularzone und Live-Bildgebung ihrer Zellzyklus Dynamics

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have validated the utility of this method for enhancing neuronal preservation and overall brain slice viability. The implementation of this technique by early adopters has facilitated detailed investigations into brain function using diverse experimental applications and spanning a wide range of animal ages, brain regions, and cell types. Steps are outlined for carrying out the protective recovery brain slice technique using an optimized NMDG artificial cerebrospinal fluid (aCSF) media formulation and enhanced procedure to reliably obtain healthy brain slices for patch clamp electrophysiology. With this updated approach, a substantial improvement is observed in the speed and reliability of gigaohm seal formation during targeted patch clamp recording experiments while maintaining excellent neuronal preservation, thereby facilitating challenging experimental applications. Representative results are provided from multi-neuron patch clamp recording experiments to assay synaptic connectivity in neocortical brain slices prepared from young adult transgenic mice and mature adult human neurosurgical specimens. Furthermore, the optimized NMDG protective recovery method of brain slicing is compatible with both juvenile and adult animals, thus resolving a limitation of the original methodology. In summary, a single media formulation and brain slicing procedure can be implemented across various species and ages to achieve excellent viability and tissue preservation.

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol demonstrates the implementation of an optimized N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. A single media formulation is used to reliably obtain healthy brain slices from animals of any age and for diverse experimental applications.

Vorbereitung der akuten Gehirnscheiben mit einem optimierten N-Methyl-D-Glucamine-schützende Recovery-Methode

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the experimental time, and increases the number of animals that are utilized per study. This limitation specifically impacts protocols such as calcium imaging that require prolonged pre-incubation with bath-applied dyes. Exponential bacterial growth within 3 - 4 h after slicing is tightly correlated with a decrease in tissue health. This study describes a method for&#160;limiting the proliferation of bacteria in acute preparations to maintain viable neuronal tissue for prolonged periods of time (&#62;24 h) without the need for antibiotics, sterile procedures, or tissue culture media containing growth factors. By cycling the extracellular fluid through UV irradiation and keeping the tissue in a custom holding chamber at 15 - 16 &#176;C, the tissue shows no difference in electrophysiological properties, or calcium signaling through intracellular calcium dyes at &#62;24 h postdissection. These methods will not only extend experimental time for those using acute neuronal tissue, but will reduce the number of animals required to complete experimental goals, and will set a gold standard for acute neuronal tissue incubation.

Once removed from the body, neuronal tissue is greatly affected by environmental conditions, leading to eventual degradation of the tissue after 6 - 8 h. Using a unique incubation method, which closely monitors and regulates the extracellular environment of the tissue, tissue viability can be significantly extended for &#62;24 h.

Längerer Inkubation von Akute neuronales Gewebe für Elektrophysiologie und Calcium-Bildgebung

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

Zwei-Photonen-Kalzium Imaging in neuronalen Dendriten in Hirnschnitten

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms underlying sensory transmission, nociceptive regulation, and chronic pain or itch development. Implementations of electrophysiological recordings together with morphological studies based on the utility of acute spinal cord slices have further improved our understanding of neuronal properties and the composition of local circuitry in SG. Here, we present a detailed and practical guide for the preparation of spinal cord slices and show representative whole-cell recording and morphological results. This protocol permits ideal neuronal preservation and can mimic in vivo conditions to a certain extent. In summary, the ability to obtain an in vitro preparation of spinal cord slices enables stable current- and voltage-clamp recordings and could thus facilitate detailed investigations into the intrinsic membrane properties, local circuitry and neuronal structure using diverse experimental approaches.

Here, we describe the essential steps for whole-cell patch-clamp recordings made from substantia gelatinosa (SG) neurons in the in vitro spinal cord slice. This method allows the intrinsic membrane properties, synaptic transmission and morphological characterization of SG neurons to be studied.

Vorbereitung der akuten Rückenmark Scheiben auf Whole-Cell Patch-Clamp-Aufnahme in den Neuronen der Substantia Gelatinosa

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms ...

Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings

Epilepsy affects about 1% of the world population and leads to a severe decrease in quality of life due to ongoing seizures as well as high risk for sudden death. Despite an abundance of available treatment options, about 30% of patients are drug-resistant. Several novel therapeutics have been developed using animal models, though the rate of drug-resistant patients remains unaltered. One of probable reasons is the lack of translation between rodent models and humans, such as a weak representation of human pharmacoresistance in animal models. Resected human brain tissue as a preclinical evaluation tool has the advantage to bridge this translational gap. Described here is a method for high quality preparation of human hippocampal brain slices and subsequent stable induction of epileptiform activity. The protocol describes the induction of burst activity during application of 8 mM KCl and 4-aminopyridin. This activity is sensitive to established AED lacosamide or novel antiepileptic candidates, such as dimethylethanolamine (DMEA). In addition, the method describes induction of seizure-like events in CA1 of human hippocampal brain slices by reduction of extracellular Mg2+ and application of bicuculline, a GABAA receptor blocker. The experimental set-up can be used to screen potential antiepileptic substances for their effects on epileptiform activity. Furthermore, mechanisms of action postulated for specific compounds can be validated using this approach in human tissue (e.g., using patch-clamp recordings). To conclude, investigation of vital human brain tissue ex vivo (here, resected hippocampus from patients suffering from temporal lobe epilepsy) will improve the current knowledge of physiological and pathological mechanisms in the human brain.

The presented protocol describes the transport and preparation of resected human hippocampal tissue with the ultimate goal to use vital brain slices as a preclinical evaluation tool for potential antiepileptic substances.

Vorbereitung von akuten menschlichen Hippocampusscheiben für elektrophysiologische Aufnahmen

Epilepsy affects about 1% of the world population and leads to a severe decrease in quality of life due to ongoing seizures as well as high risk for ...

<meta charset="utf8"></head><body>Effiziente Nukleofektion von NSCs, die aus der subventrikulären Zone der Maus isoliert wurden

Isolation, Expansion, and Nucleofection of Neural Stem Cells from Adult Murine Subventricular Zone

Isolation and expansion of neural stem cells (NSCs) from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain can be achieved in a medium supplemented with basic fibroblast growth factor (bFGF) and epidermal growth factor (EGF) as mitogens, producing clonal aggregates known as neurospheres. This in vitro system is a valuable tool for studying NSC potential. Transfection of siRNAs or genes carried in plasmids can be used to induce perturbations to gene expression and study NSC biology. However, the exogenous nucleic acid delivery to NSC cultures is challenging due to the low efficiency of central nervous system (CNS) cells transfection. Here, we present an improved nucleofection system that achieves high efficiency of gene delivery in expanded NSCs from adult murine SVZ. We demonstrate that this relatively simple method enhances gene perturbation in adult NSCs, surpassing traditional transfection protocols with survival rates exceeding 80%. Moreover, this method can also be applied in primary isolated NSCs, providing a crucial advancement in gene function studies through gene expression manipulation via knockdown or overexpression in neurosphere cultures.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Verbesserte Nukleofektion für einen hocheffizienten Gentransfer in murinen subventrikulären Zonen abgeleiteten neuralen Stammzellkulturen

Here, we describe a nucleofection system designed to enhance gene delivery efficiency in expanded neural stem cells (NSCs) isolated from the adult murine subventricular zone. The findings demonstrate that this method significantly improves gene perturbation in NSCs, surpassing the effectiveness of traditional transfection protocols and enhancing cell survival rate.

Isolierung, Expansion und Nukleofektion von neuralen Stammzellen aus der adulten subventrikulären Zone der Maus

Isolation and expansion of neural stem cells (NSCs) from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain can be achieved in a medium supplemented ...