CRISPR-geprüfte Drop-Out-Screens bieten Forschern eine einfache, effiziente und kostengünstige Methode, um die Kettenfunktion auf genomweiter Ebene zu überprüfen. Der Vorteil von CRISPR ist seine Geschmeidigkeit, jedes Gen zu bearbeiten, indem es einfach die Führungssequenz ändert. CRISPR-Leitbibliotheken ermöglichen es Forschern, das gesamte Genom eines jeden Organismus in einem Experiment unvoreingenommen und systematisch zu befragen.
Derzeit werden CRISPR-Screens verwendet, um wesentliche Gene über Hunderte von menschlichen Krebsarten zu identifizieren und genetische Wechselwirkungen abzubilden. Bildschirme können auch umfassende Profile Drogen, um Drogen-Wirk-Mechanismen der Aktion zu offenbaren. Die hier beschriebenen CRISPR-Bibliotheken zielen auf menschliche Zellen ab.
Führungsbibliotheken, die auf andere Arten wie die Maus abzielen, sind jedoch verfügbar und können auf ähnliche Weise überprüft werden. Die Durchführung genomweiter Bildschirme in menschlichen Zellen kann in der Praxis entmutigend sein, da es sich um den Umgang mit zig Millionen in Zellen handelt und die Analyse großer Datensätze erfordert. Stellen Sie vor dem Starten eines Bildschirms sicher, dass die Zelllinien sorgfältig charakterisiert werden.
Dazu gehören das Wissen um die Reinheit Ihrer Zelllinie, verdoppelende Zeit, Lentivirus-Transduktionseffizienzen und Empfindlichkeiten gegenüber Antibiotika-Selektionserregern. Eine visuelle Demonstration wird ein Bild davon liefern, wie man praktisch mit den Millionen von Zellen umgeht, die auf einem Bildschirm benötigt werden, und Tausende von Störungen systematisch verfolgen kann. Demonstriert wird das Verfahren von Andrea Habsid, Kamaldeep Aulakh und Ryan Climie, allesTechniker aus meinem Labor.
Beginnen Sie mit der Umwandlung des vorgefertigten CRISPR sgRNA Plasmids in elektrokompetente Zellen und wachsen sie nach Manuskriptanweisungen. Wenn Sie bereit sind, die Kolonien zu ernten, fügen Sie sieben Milliliter LB mit Carbenicillin auf jede Platte und kratzen Sie die Kolonien mit dem Zellstreuer ab. Verwenden Sie eine 10-Milliliter-Pipette, um die zerkratzten Zellen in einen sterilen Ein-Liter-Konuskolben zu übertragen, und spülen Sie die Platte mit fünf Millilitern LB mit Carbenicillin ab.
Übertragen Sie die Spüllösung erneut auf den Kolben. Zentrifugieren Sie die Zellen nach Manuskriptrichtungen und bestimmen Sie dann das Gewicht des nassen Pellets. Reinigen Sie die Plasmid-DNA mit einem Maxi- oder Mega-Plasmid-Reinigungskit.
Bereiten Sie Zellen für die Transfektion vor, indem Sie 293 T-Zellen aussäen und über Nacht inkubieren. Am nächsten Tag die drei Transfektionsplasmid-Mischungen für 15-Zentimeter-Platten vorbereiten. Berechnen Sie die Menge an Plasmid, die für eine Transfektion benötigt wird, und erstellen Sie eine Mischung von Plasmiden für die Anzahl der Platten, plus eine, die transfiziert werden soll.
Als nächstes bereiten Sie ein lipidbasiertes Transfektionsreagenz für jede Transfektion und aliquot-reduzierte Serummedien in einzelne 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhren für die Anzahl der zu transfizierenden Platten vor. Das Transfektionsreagenz hinzufügen, sanft mischen und bei Raumtemperatur fünf Minuten brüten. Fügen Sie dem Transfektionsreagenz nach der Inkubation DNA in einem Verhältnis von Transfektionsreagenz zu Mikrogramm des DNA-Komplexes hinzu.
Mischen Sie die Lösung vorsichtig und lassen Sie bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Fügen Sie die Transfektionsmischung zu Verpackungszellen hinzu und inkubieren Sie sie nach Manuskriptanweisungen. Überprüfen Sie am Tag der viralen Ernte die Zellen auf abnormale und verschmolzene Morphologie als Hinweis auf eine gute Virusproduktion und ernten Sie das Lentivirus, indem Sie den Überstand sammeln und in ein steriles Zentrifugenrohr übertragen.
Wählen Sie zunächst die CRISPR-Guide-RNA-Bibliotheksabdeckung aus, die auf dem gesamten Bildschirm beibehalten werden soll. Bestimmen Sie anhand der Bibliotheksabdeckung die Anzahl der Zellen, die für die Aufrechterhaltung pro Führungs-RNA erforderlich sind, und die Anzahl der Zellen, die für eine Infektion bei MOI 0,3 erforderlich sind. Als nächstes bestimmen Sie die Anzahl der Platten, die erforderlich sind, um die Infektion einzurichten, und ernten und säen Sie dann die Zellen auf jeder Platte.
Hexadimethrinbromid zu allen Platten hinzufügen und das erforderliche Virusvolumen zum Screening und zur Kontrolle von zwei Platten hinzufügen. Fügen Sie keinen Virus hinzu, um einen zu kontrollieren. Ersetzen Sie dieses Volume durch Medien.
Mischen Sie die Platten gründlich durch Kippen und legen Sie die Platten in einen Inkubator, um sicherzustellen, dass sie eben sind. Ernten Sie infizierte Zellen nach Manuskriptanweisungen und sammeln Sie drei Repliken von Zellpellets aus den gepoolten Zellen für die genomische DNA-Extraktion. Zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 500 mal g und waschen Sie sie mit PBS.
Beschriften Sie die Rohre und gefrieren Sie die Zellpellets bei minus 80 Grad Celsius. Teilen Sie den Pool infizierter Zellen in drei Replikationsgruppen auf, um sicherzustellen, dass die Bibliotheksabdeckung innerhalb jeder Replikation beibehalten wird. Säen Sie die Zellen mit einer Dichte, die normalerweise bei der Erweiterung verwendet würde.
Verwenden Sie die gleiche Anzahl von Zellen für jede Replikation und die gleiche Gesamtzahl von Zellen zwischen Replikationen. Fahren Sie fort, die Zellen zu durchlaufen und drei Wiederholungen von Zellpellets aus jeder Replikation von gepoolten infizierten Zellen für bis zu 15 bis 20 Zellverdoppelungen zu ernten. An jedem Durchgang ernten Sie die Zellen von allen Platten in jedem replizieren miteinander.
Beschriften Sie jedes Pellet mit der Zeit- und Nachbildungsbezeichnung. Richten Sie PCR1 nach Manuskriptanweisungen mit insgesamt 100 Mikrogramm genomischer DNA bei 3,5 Mikrogramm genomischer DNA pro 50-Mikroliter-Reaktion ein und richten Sie identische 50-Mikroliter-Reaktionen ein, um die gewünschte Abdeckung zu erzielen. Richten Sie eine PCR-Rohrreaktion nach Manuskriptanweisungen ein.
Verwenden Sie fünf Mikroliter des gepoolten PCR1-Produkts als Vorlage und verwenden Sie eindeutige Indexprimerkombinationen für jedes einzelne Beispiel, um das Pooling von Sequenzierungsbibliotheksbeispielen zu ermöglichen. Nach Abschluss der PCR führen Sie das PCR-Rohrprodukt auf einem 2%Agarose-Gel bei niedriger Spannung für ein bis 1 1/2 Stunden aus. Visualisieren Sie das Produkt auf einem Blaulichttransilluminator und verbrauchen Sie das 200 Basispaarband.
Reinigen Sie die DNA und messen Sie ihre Quantität und Qualität sowohl mit einem Spektralphotometer als auch mit einem Fluorometer. Eine ideale Guide-RNA-Bibliothek sollte jede einzelne Guide-RNA in ähnlichen Mengen dargestellt haben. Die Sequenzierung der nächsten Generation kann verwendet werden, um zu bestätigen, dass die Bibliothek über eine enge Verteilung von Führungs-RNAs verfügt.
Präzisions-Rückrufanalysen können verwendet werden, um die Bildschirmleistung zu bewerten. Ein leistungsstarker Bildschirm sollte eine große Anzahl von essentiellen Genen mit einem Basisfaktor größer als sechs und einer falschen Entdeckungsrate von weniger als 5% wiederherstellen. Der Bayes-Faktor stellt ein Vertrauensmaß dar, dass der Genknockout zu einem Fitnessfehler führt.
Hohe Werte deuten auf ein erhöhtes Vertrauen hin, während niedrige Werte darauf hindeuten, dass der Gen-Knockout Wachstumsvorteile bietet. Genomweite Knockout-Pools können in Gegenwart von überschüssigem Wirkstoff kultiviert werden, um nach Suppressorresistenzgenen zu suchen. Um einen positiven Selektionsbild für den Suppressor des Thymidinblocks durchzuführen, werden normalisierte Lesezahlen für alle Führungs-RNAs bei T0 gegen mittelnormalisierte Lesezahlen für Thymidin-behandelte Proben geplottet.
Ein wichtiges Detail für die erfolgreiche Durchführung von CRISPR-Bildschirmen ist die Aufrechterhaltung einer guten Verteilung jeder Führungs-RNA, angefangen bei der Transfektion des Plasmids bis zur Transduktion von Zellen. Dies minimiert die Wahrscheinlichkeit von Zufallseffekten, die die RNA-Darstellung verzerren und zu falschen positiven oder negativen Ergebnissen führen können. Nach einer Bildschirmvalidierung sollten Experimente durchgeführt werden, um Treffer zu bestätigen, da der primäre Bildschirm nur potenzielle Treffer identifiziert.
Je nach Biologie der Treffer können verschiedene Methoden eingesetzt werden. Die CRISPR-Bearbeitung in Kombination mit der Sequenzierung der nächsten Generation hat den Verlust von Funktionsbildschirmen im Genommaßstab in verschiedenen menschlichen Modellsystemen ermöglicht. Aufgrund der Einfachheit von CRISPR sind diese Arten von Bildschirmen nun für alle Forscher allgemein zugänglich, so dass mehr Wissenschaftler funktionelle genetische Methoden nutzen können, um biologische Prozesse und Krankheiten zu untersuchen.
