Obwohl unzählige Mikroben Pflanzenwurzeln besiedeln, sind diese Wechselwirkungen schwer zu analysieren, da sie unterirdisch stattfinden. Um dies zu erleichtern, bietet diese Protokollsammlung einen Überblick über Strategien zur Beimpfung von Pflanzenwurzeln mit bodenbürtigen Mikroben. Die Wurzelimpfung ist die Grundlage für die Untersuchung von Wurzelmikrobeninteraktionen, und durch die Verwendung der folgenden Techniken können Wechselwirkungen auf molekularer, zytologischer oder histologischer Ebene untersucht werden.
Wir erklären drei Impfsysteme mit Verticillium als wurzeleindringende Mikrobe und der Modellpflanze Arabidopsis. Eine Übertragung der Methoden auf andere Pflanzen wie Tomaten- oder Raps und auf andere Wurzelmikroben, zum Beispiel nützliche Serendipita, ist jedoch möglich. Bereiten Sie das Verticillium inoculum im Voraus vor, indem Sie die Myzelie in PDB kultivieren und Sporulation und Czapek Dextrosebrühe induzieren.
Beginnen Sie dann damit, das autoklavierte Medium in Petrischalen zu gießen. Nach dem Aushärten des Mediums die Petrischalen in einen sterilen Plastikbeutel umpacken und über Nacht kopfüber im Kühlschrank bei vier bis 10 Grad Celsius aufbewahren. Schneiden und entfernen Sie einen Infektionskanal im oberen Drittel des erstarrten Mediums mit einem Skalpell.
Vermeiden Sie es, während des Schneidens Flüssigkeit oder Luft unter das Agarmedium zu bekommen. Als nächstes verwenden Sie eine sterile Pipettenspitze, um 50 bis 100 oberflächensterilisierte Arabidopsis-Samen auf der geschnittenen Oberseite zu verteilen. Legen Sie die Samen in den Winkel, in dem die geschnittene Agaroberfläche die Petrischalenwand berührt, damit die Wurzeln zwischen ihnen wachsen können.
Schließen Sie die Petrischalen und verschließen Sie sie mit einem atmungsaktiven Klebeband, um den Gasaustausch zu ermöglichen. Halten Sie die Petrischalen zwei Tage lang bei vier Grad Celsius im Dunkeln, um eine synchronisierte und effiziente Keimung zu gewährleisten. Legen Sie dann die Platten vertikal in ein Rack und züchten Sie die Pflanzen in einer Wachstumskammer unter langen Tagesbedingungen.
Nach neun bis 11 Tagen, wenn die Wurzeln den Infektionskanal erreichen, legen Sie die Platten horizontal und öffnen Sie sie. Dann fügen Sie 500 Mikroliter frisch geerntete Verticillium-Konidien direkt in den Infektionskanal hinzu. Bereiten Sie Kontrollplatten vor, indem Sie 500 Mikroliter einer Scheinlösung anstelle von Sporen hinzufügen.
Inkubieren Sie sowohl Kontroll- als auch sporenbeimpfte Platten horizontal, bis die Flüssigkeit eingeweicht ist. Schließen Sie dann den Deckel und verschließen Sie die Platten mit atmungsaktivem Klebeband. Bedecken Sie die Wurzelteile mit schwarzen Papierkästen, um Wurzeln und bodenbürtige Pilze zu verdunkeln.
Inkubieren Sie die Platten vertikal in der Wachstumskammer. Führen Sie die Analysen zu den bevorzugten Zeitpunkten nach der Impfung durch. Sterilisieren Sie zunächst transparente 500-Milliliter-Plastikbecher für 20 Minuten in ein 70 bis 75% -Ethanolbad.
Trocknen Sie die Becher in der Lamina-Flow-Haube. Gießen Sie das autoklavierte Medium in die Plastikbecher. Bereiten Sie eine Kunststoffschicht mit fünf vorgefertigten Löchern vor, von denen eines groß in der Mitte und vier kleinere in jeder Ecke sind.
Legen Sie die Kunststoffschicht auf das Medium, bevor es erstarrt. Schneiden Sie das Agar mit einem Skalpell durch das vorgefertigte Mittelloch bis zu einer Tiefe von etwa 1,5 Zentimetern. Entfernen Sie den geschnittenen Agar, um einen Infektionskanal zu schaffen, um die Pilzsporen später hinzuzufügen.
Kratzen Sie das Agarmedium leicht mit einer Pipettenspitze in den vier kleineren Löchern, um die erstarrte Haut zu unterbrechen. Legen Sie die Samen mit einer Pipettenspitze in die kleineren Löcher. Schließen Sie den Plastikbecher mit einem zweiten umgedrehten Plastikbecher und verschließen Sie ihn mit atmungsaktivem Klebeband.
Halten Sie die Pflanzen bei vier Grad Celsius für drei Tage im Dunkeln zur Schichtung. Anschließend die Bechersysteme in der Wachstumskammer inkubieren. Um Pflänzchen mit Verticillium zu impfen, fügen Sie einen Milliliter Konidienlösung in den Infektionskanal hinzu.
Für die Steuerung fügen Sie einen Milliliter keimfreies und viertes MS-Medium als Scheinlösung hinzu. Führen Sie die Analysen zu den bevorzugten Zeitpunkten nach der Impfung durch. Mischen Sie zunächst Erde und Sand gründlich in einem volumetrischen Verhältnis von drei zu eins, was das spätere Waschen des Substrats von den Wurzeln erleichtert.
Gießen Sie die Mischung in einen Autoklavenbeutel und dampfen Sie bei 80 Grad Celsius für 20 Minuten in einem Autoklaven. Füllen Sie Töpfe mit der Erde-Sand-Mischung und geben Sie sie in Schalen. Geben Sie Wasser in die Schalen, die etwa ein Drittel der Höhe eines Topfes haben, um die Erde-Sand-Mischung gleichmäßig einzuweichen.
Sprühen Sie die Mischung mit Wasser, um nasse Startbedingungen zu gewährleisten. Säen Sie drei bis vier Samen in jedem Topf in ausreichendem Abstand zueinander. Halten Sie sie zur Schichtung bei vier Grad Celsius für drei Tage im Dunkeln.
Lassen Sie die Sämlinge unter langen Tagesbedingungen mit regelmäßiger Bewässerung wachsen und pflücken Sie dann Pflanzen ähnlicher Größe und Alter, um die Wurzeldip-Impfung durchzuführen. Nehmen Sie die Erde aus den Töpfen und graben Sie die Wurzeln aus. Waschen Sie die Wurzeln vorsichtig in einem Wasserbehälter und halten Sie die Rosetten aus dem Wasser.
Die Wurzeln 60 Minuten lang in einer Petrischale inkubieren, die die Verticillium-Sporenlösung oder Scheinlösung enthält. Bereiten Sie neue Töpfe mit feuchtem, dampfsterilisiertem Boden ohne Sand vor. Verwenden Sie eine Pipettenspitze, um in jedem Topf ein Loch in der Mitte des Bodens zu machen.
Legen Sie die Wurzeln direkt in das Loch und füllen Sie die Löcher vorsichtig mit Erde auf, um zusätzlichen Stress für die Pflanzen zu vermeiden. Kultivieren Sie die Pflanzen unter langen Tagesbedingungen mit regelmäßiger Bewässerung. Führen Sie die Analysen zu den bevorzugten Zeitpunkten nach der Impfung durch.
Im auf der Petrischale basierenden System wurde eine erfolgreiche Infektion von Verticillium in den Wurzeln der Arabidopsis visualisiert. Zwei Tage nach der Impfung wurde das Markergen MYB51 in infizierten Wurzeln im Vergleich zur Kontrolle stark induziert, was durch die QRTPCR-Analyse bestätigt wurde. Im tassenbasierten System wurde eine hohe Menge an Pilz-DNA in den Blättern infizierter Pflanzen gefunden, wie die Grafik im Vergleich zur Scheinkontrolle nach 12 Tagen Impfung zeigt.
Die QRTPCR-Analyse zeigte eine angereicherte Transkripthäufigkeit des Markergens MYB51 in den Arabidopsis-Wurzeln. Mit diesem System wurde Verticillium auf andere Modellpflanzenarten geimpft. Bei Raps war die Pilz-DNA in Stammsegmenten nachweisbar, die 12 Tage nach der Impfung an den Wurzeln an der Basis der Sämlinge geschnitten wurden.
Pilz-DNA wurde auch in Tomatenstängeln nachgewiesen, was auf die Ausbreitung des Erregers innerhalb der Pflanze hinweist. 21 Tage nach der Impfung mit dem bodenbasierten System sahen die Rosetten der mit Mock behandelten Arabidopsis-Pflanzen gesund und grün aus, während infizierte Pflanzen gelbliche oder nekrotische Blätter zeigten und eine geringere grüne Blattfläche im Vergleich zu Mock aufwiesen, was auf eine erfolgreiche Infektion hinweist. Achten Sie beim Durchtrennen des Infektionskanals im Petrischalensystem darauf, dass der Agar nicht verrutscht.
Wenn Sie das bodenbasierte System anwenden, komprimieren Sie den Boden nicht um die Wurzeln herum, während Sie umtopfen, um weiteren Stress für die Pflanzen zu vermeiden. Nach der Wurzelimpfung können beispielsweise pathogene Tests, Analysen der Genexpression, funktionelle Genomik oder agrochemische Tests durchgeführt werden, die neue Einblicke in die Interaktionen von Wurzelmikroben und Werkzeuge zur Verbesserung der Landwirtschaft liefern.
