Dieses Protokoll umfasst die Herstellung eines Optrode-Systems zur gleichzeitigen optogenetischen Stimulation und elektrophysiologischen Aufzeichnung. Das vorgeschlagene LED-basierte System verbessert die Lichtkopplungseffizienz durch ein Mikrolinsenarray. Eine LED-Lichtquelle hat eine einfache Beleuchtungseinrichtung als eine Laserlichtquelle, so dass das System leicht auf das drahtlose System anwendbar ist.
Optogenetik ist eine Pfadtechnik zum Verständnis der Pathologie neurologischer Erkrankungen und Behandlungsmechanismen. Optogenetik kann angewendet werden, um Rückenmarksverletzungen, Epilepsie, Parkinson-Krankheit und Alzheimer-Krankheit zu behandeln. Unser LED-basiertes Gerät kann als drahtloses System mit mehreren Vorteilen wie geringer Systemkomplexität, Kosteneffizienz und geringem Stromverbrauch weiter implementiert werden.
Schließen Sie zunächst die 1,27-Millimeter-Pitch-Buchse an den Kopfstufenvorverstärker an. Platzieren Sie die LED im 3D-gedruckten Gehäuse. Messen Sie die Lichtintensität am Ende der Glasfaserspitze mit einer Fotodiode.
Tauchen Sie die Wolframelektroden und optischen Fasern 15 Minuten lang in Alkohol und trocknen Sie sie an der Luft. Rasieren Sie die Kopfhaut und legen Sie die betäubte Maus in den stereotaktischen Rahmen. Positionieren Sie den Kopf innerhalb des stereotaktischen Rahmens und führen Sie Ohrstangen in den Meatus ein.
Schalten Sie das im stereotaktischen Rahmen eingebettete Wärmekissen ein und halten Sie die Körpertemperatur während der gesamten chirurgischen Eingriffe bei 37 Grad Celsius. Stellen Sie die Inzisionsstange zum Einstellen der Höhe der Einschnittstange ein und ziehen Sie die Nasenklemme an der Schnauze fest. Decken Sie die Augen mit Vaseline ab, um Trockenheit zu vermeiden.
Heben Sie die Haut im Kopf mit einer Pinzette an, sichern Sie einen Injektionsraum und injizieren Sie 1% Lidocain unter die Kopfhaut. Führen Sie einen sagittalen Schnitt mit einem Skalpell und einer feinen Schere durch. Halten Sie die eingeschnittene Haut mit einer Mikroklemme, um die Sichtbarkeit des Operationsbereichs zu erweitern.
Entfernen Sie das Periost mit Wattestäbchen. Wenn es Blutungen gibt, kauterisiert der Schädel mit einem Bovie, um die Blutgefäße zu versiegeln. Reinigen Sie den Schädel mit Kochsalzlösung und markieren Sie die Kraniotomiestellen mit einem Manipulatorarm.
Bohren Sie ein Loch über dem Kleinhirn und setzen Sie eine Schraube für den Boden ein. Setzen Sie die Erdschraube mit einer Präzisionsschraube 0,5 Millimeter tief ein, bis sie die Oberseite des Kleinhirns erreicht. Bohren Sie den markierten Bereich und entfernen Sie ein Stück des Schädels mit einer Pinzette.
Biegen Sie eine 26-Gauge-Nadelspitze im Uhrzeigersinn in einem Winkel von 120 Grad und legen Sie den Gehirnbereich frei, indem Sie die abgeschrägte Seite der Nadel nach oben einführen. Fixieren Sie das Optrode-Array im Manipulatorarm und bewegen Sie sich in die Nähe des exponierten Bereichs. Setzen Sie das Optrode-Array langsam ein und verbinden Sie die Erdungsschraube mit dem am System befestigten Silberdraht.
Legen Sie Gelschaum zwischen das exponierte Gehirn und das Gerät ein, um Chemikalien vor direktem Kontakt mit dem Gehirn zu schützen. Tragen Sie vorsichtig Zahnzement auf den Schädel auf, um das Gerät zu fixieren und den Gelschaum abzudecken. Bevor der Zahnzement vollständig ausgehärtet ist, trennen Sie die Kopfhaut, wenn sie am Zahnzement befestigt ist.
Ziehen Sie die eingeschnittene Haut mit einer Pinzette ab, um den ausgehärteten Zahnzement zu bedecken, und nähen Sie die Kopfhaut. Platzieren Sie die betäubte Maus im stereotaktischen Rahmen. Stellen Sie das Lichtimpulsrezept auf 4% Tastverhältnis in 10 Hertz Frequenz ein.
Richten Sie die Lichtstimulation während der neuronalen Aufzeichnung für zwei Sekunden ein. Nehmen Sie die Kunststoffabdeckung ab und befestigen Sie den oberen Teil des Lichtabgabesystems mit der wiederverwendbaren LED in Schaltkreisen. Schließen Sie den Kopfstufenvorverstärker an den implantierten fünfpoligen Stecker an.
Öffnen Sie die Software und richten Sie die Softwarefilter ein. Klicken Sie als Nächstes auf und stellen Sie die Abtastrate des Verstärkers ein. Klicken Sie dann auf Bandbreite ändern.
Stellen Sie die niedrigere Bandbreite des Verstärkers und die obere Bandbreite des Verstärkers ein. Überprüfen Sie die Software DAC High-Pass Filter. Öffnen Sie das Spike-Scope und überprüfen Sie neuronale Signale mithilfe der Spannungsschwelle.
Klicken Sie auf Stopp und Aufnahme. Laden Sie die erfassten Daten mit MATLAB und prüfen Sie die Rohdaten. Führen Sie dann Spike-Sortiercode aus, der den Wave-Clust-Algorithmus enthält.
Überprüfen Sie sortierte Spitzen im Rasterdiagramm. Zeichnen Sie nun Spikes auf und überprüfen Sie die evozierten Spikes während der Lichtstimulation. Die Abbildung zeigt ganze aufgezeichnete Wellenformen mit genauen Bedingungen, einschließlich zwei Sekunden Licht auf Periode in der Mitte.
Die Anzahl der evozierten individuellen neuronalen Spikes nach jedem Lichtstimulationsimpuls nahm im Vergleich zur Baseline mit unterschiedlichen Zeitfächern von zwei Sekunden und 0,2 Sekunden signifikant zu. Die Abbildung zeigt ein Spike-Histogramm für jeden Kanal vor, während und nach der Lichtstimulation. Die Inset-Abbildung gibt die Position des implantierten Optrode-Arrays an.
Darüber hinaus zeigt die gezoomte Version ein Spike-Histogramm mit einem 100-Millisekunden-Zeitabstand. Der blaue Balken stellt den Zeitraum dar, in dem das LED-Licht eingeschaltet war, um die Antwort aufzuzeichnen. Um das Artefaktrauschen des LED-Antreibstromprozesses zu minimieren, sollte das System so ausgelegt sein, dass ein ausreichender Abstand zwischen dem Elektrosignalweg und der LED-Schaltung gewährleistet ist.
Das vorgeschlagene LED-basierte Optrode-System kann die verschiedenen Neurosignale im Zusammenhang mit dem Verhalten von Tieren untersuchen, da es eine optogenetische Stimulation liefern und die hervorgerufenen Neuroreaktionen aufzeichnen kann. Ein LED-Optrode-Array ist mit der drahtlosen Optogenetik-Schnittstelle kompatibel, die in frei beweglichen Tierversuchen eingesetzt werden kann.
