Die Membranfusion vermittelt viele biologische Funktionen. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Erkennung der Fusionsporenöffnung und der Transmitterfreisetzungsdynamik und zur Unterscheidung von drei Fusionsmodi: Close Fusion, Stay Fusion und Shrink Fusion. Die Kombination aus konfokalem Mikroskop und der Patch-Clamp-Aufzeichnung erleichtert die Visualisierung der Öffnung und des Verschlusses der Fusionsporen und die Bestimmung ihrer Kinetik.
Obwohl für Chromaffinzellen beschrieben, kann das Prinzip der hier beschriebenen Methode weit über Chromaffinzellen hinaus auf viele sekretorische Zellen angewendet werden. Die erfolgreiche Implementierung dieser Methode hängt von mehreren allgemeinen Schritten ab, wie der Erzeugung einer gesunden primären Chromaffinzellkultur, einer ausreichenden Plasmidtransfektionseffizienz und einer hohen elektrophysiologischen Aufzeichnungserfolgsrate. Wählen Sie drei intakte Drüsen ohne Schnitte oder Blutungen an der Oberfläche und entfernen Sie das Fettgewebe mit einer Schere.
Waschen Sie die Drüsen durch Durchblutung mit Lockes Lösung, bis kein Blut mehr herauskommt. Zur Verdauung injizieren Sie die Enzymlösung durch die Nebennierenvene mit einer 30-Millimeter-Spritze, die mit einem 0,22-Mikrometer-Filter befestigt ist, bis die Drüse anschwillt. Dann lassen Sie die Drüsen bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten.
Erneut injizieren und die Drüsen bei 37 Grad Celsius für weitere 10 Minuten stehen lassen. Nach der Verdauung schneiden Sie die Drüse längs von der Nebennierenvene bis zum anderen Ende mit einer Schere, um die Drüse zu entfalten. Isolieren Sie das weiße Mark, indem Sie es in Stücke zu einer 10 Zentimeter großen Petrischale mit Lockes Lösung herauspressen.
Schneiden und zerkleinern Sie die Medulla mit einer Schere. Filtern Sie die Medulla-Suspension mit einem 80 bis 100 Mikrometer langen Nylonnetz in ein Becherglas. Das Filtrat in ein 50 Milliliter konisches Röhrchen geben und bei 48 x g Raumtemperatur drei Minuten lang mit einer Verzögerung von drei Minuten zentrifugieren.
Entfernen Sie nach der Zentrifugation den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet mit Lockes Lösung durch Pipettieren. Filtern Sie die Zellsuspension mit einem 80 bis 100 Mikrometer langen Sieb und zentrifugieren Sie bei 48 x g Raumtemperatur für drei Minuten mit Verzögerung drei. Entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Zellpellet mit 30 Millilitern Kulturmedium.
Bestimmen Sie die Zellzahl mit einer Hämozytometer-Zählkammer. Übertragen Sie 2.800.000 Zellen in ein 15-Milliliter-Rohr. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 48 x g für zwei Minuten mit der Verzögerung von drei.
Fügen Sie dem Zellpellet 100 Mikroliter Transsektionspuffer hinzu, der vom Hersteller zur Verfügung gestellt wird. Und dann fügen Sie zwei Mikrogramm PH-mNG-Plasmid hinzu. Mischen Sie die Suspension vorsichtig, indem Sie die Lösung auf und ab leiten und die Mischung unverzüglich in eine Elektroporationsküvette überführen.
Übertragen Sie die Küvette sofort auf den Elektroporator, wählen Sie das Programm 005 in der Bildschirmliste aus und drücken Sie die Eingabetaste, um die Elektroporation durchzuführen. Nach der Elektroporation sofort 1,8 Milliliter Medium in die Küvette geben und vorsichtig mit einer Mikropipette mischen, die mit einer sterilen Spitze ausgestattet ist. Fügen Sie 300 Mikroliter der Suspension der elektropolierten Zellen auf den Deckzettel in jeder Schalenbeschichtung von insgesamt fünf bis sechs Schalen für eine Elektroporationsreaktion hinzu.
Gießen Sie das Geschirr vorsichtig für 30 Minuten in einen befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 9% Kohlendioxid und geben Sie nach 30 Minuten vorsichtig zwei Milliliter vorgewärmtes Medium zu jedem Gericht. Bereiten Sie Patchpipetten aus Borosilikatglaskapillaren vor, indem Sie sie mit einem Pipettenzieher ziehen, ihre Spitzen mit flüssigem Wachs beschichten und mit einer Mikroschmiede polieren. Schalten Sie den Patch-Clamp-Aufnahmeverstärker ein und starten Sie die Software.
Stellen Sie die entsprechenden Kalziumstrom- und Kapazitätsaufzeichnungsparameter der Software ein. Legen Sie ein Aufzeichnungsprotokoll von insgesamt 60 Sekunden Dauer fest, bei dem die Stimulation bei 10 Sekunden beginnt. Stellen Sie das Haltepotential für die Spannungsklemmenaufzeichnung auf 80 Millivolt ein.
Stellen Sie eine einsekündige Depolarisation von minus 80 Millivolt auf 10 Millivolt als Stimulus ein, um den Kalziumeinstrom und den Kapazitätssprung zu induzieren. Schalten Sie das konfokale Mikroskopsystem ein und stellen Sie die entsprechenden Parameter in der Software ein. Schalten Sie die Laser ein, einschließlich 458 Nanometer, 514 Nanometer und 633 Nanometer, und legen Sie den Emissionssammelbereich für jeden Laser entsprechend jeder Fluoreszenzsonde fest.
Wählen Sie eine Schale mit gutem Zellzustand und richtiger Expression und fügen Sie zwei Mikroliter Fluoreszenz-falschen Neurotransmitter FFN511 in das Medium in der Schale hinzu. Stellen Sie das Gericht für 20 Minuten zurück in den Inkubator. Nach dem Laden von FFN511 bereiten Sie die Aufzeichnungskammer vor und geben Sie zwei Mikroliter Fluoreszenzfarbstoff A655 in 50 Mikroliter Badelösung.
Den Deckbecher von der Schale mit einer Pinzette in die Aufnahmekammer geben und sofort die A655 enthaltende Badelösung hinzufügen. Legen Sie einen Tropfen Öl auf das 100X Öl-Tauchobjektiv. Montieren Sie die Kammer im Mikroskop und verwenden Sie den Einstellknopf, damit das Öl einfach den Boden des Deckglases berührt.
Bringen Sie die Zellen in den Fokus und verwenden Sie hellfeld- und konfokale Bildgebung, um eine geeignete Zelle mit mNG-Expression zu finden. Vergrößern Sie die ausgewählte Zelle und zentrieren Sie sie im Sichtfeld, wodurch leere Bereiche minimiert werden. Legen Sie Parameter für die konfokale Bildgebung der XY-Ebene an einer festen Z-Ebene von FFN511, PH-mNG und A665 mit einem minimierten Zeitintervall fest.
Richten Sie den Fokus mit einem Feineinstellungsknopf auf die Unterseite der Zelle ein. Stellen Sie die Anregungslaserleistung in der Software ein, um eine Einstellung zu finden, um das beste Signal-Rausch-Verhältnis zu erhalten und eine signifikante Fluoreszenzbleiche zu vermeiden. Fügen Sie neun Mikroliter interne Lösung in eine Patch-Pipette hinzu und befestigen Sie die Pipette an der Halterung der Patch-Clamp-Verstärkerstufe.
Wenden Sie mit einer Spritze eine kleine Menge Überdruck an und bewegen Sie die Pipettenspitze, um die Badelösung mit einem Mikromanipulator zu berühren. Stellen Sie sicher, dass der Verstärker anzeigt, dass der Pipettenwiderstand ungefähr zwischen zwei und vier Megaohm liegt, mit einem Spannungsimpulstest. Drücken Sie LJ/Auto, um die Flüssigkeitsverbindung abzubrechen.
Bewegen Sie die Pipette mit einem Mikromanipulator in Richtung der ausgewählten Zelle. Um einen Zellanfügemodus zu bilden, bewegen Sie die Pipettenspitze, um die Zelle zu berühren. Ändern Sie das Haltepotenzial von null auf minus 80 Millivolt, während Sie mit einer Spritze einen sanften Unterdruck ausüben.
Sobald der Widerstand ein Gigaohm überschritten hat, warten Sie etwa 30 Sekunden, bis sich die Konfiguration stabilisiert hat. Drücken Sie C-fast/Auto, um die schnelle Kapazität zu kompensieren. Um einen Großhandelsmodus zu bilden, wenden Sie kurze, aber starke Unterdruckimpulse mit der Spritze an, bis die Membran reißt.
Drücken Sie C-slow/Auto, um die langsame Kapazität zu kompensieren. Passen Sie den Bildgebungsfokus leicht an, um sich auf den Zellboden zu konzentrieren. Starten Sie die konfokale Zeitrafferbildgebung und die Patch-Clamp-Aufzeichnung gleichzeitig, indem Sie mit zwei verschiedenen Softwareanwendungen auf die Schaltfläche Start klicken.
Stellen Sie nach der Aufzeichnung sicher, dass die Daten gespeichert sind. Ändern Sie das Haltepotenzial wieder auf null Millivolt. Bewegen Sie die Pipette aus der Badelösung und entsorgen Sie sie.
Öffnen Sie die Raw-Imaging-Dateien bei einem beliebigen Hersteller oder einer mitgelieferten Software. Gehen Sie zu Prozess, klicken Sie auf ProcessTools und verwenden Sie die Tools, um gleitende Durchschnittsdateien für jedes Zeitrafferbild zu generieren. Speichern Sie diese Dateien.
Gehen Sie unter Quantifizieren zu Tools und klicken Sie auf die Schaltflächen Stack Profile, um die Zeitpunkte vor und nach der Stimulation zu überprüfen und Fluoreszenzänderungen in jedem Kanal zu identifizieren. Klicken Sie auf die Schaltfläche Ellipse zeichnen, um Bereiche zu kreisen, die für Fusionsereignisse von Interesse sind. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Bild und klicken Sie auf ROIs speichern, um zu speichern.
Klicken Sie auf Projekte öffnen, um die Rohdatei zu suchen. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Bild und klicken Sie auf ROIs laden, um die ROI-Datei in die Rohbilddatei zu laden und die Fluoreszenzintensitäten zu messen. Gehen Sie zu Tools und klicken Sie in der Software auf ROIs sortieren und zeichnen Sie die Spuren für alle drei Kanäle jedes ROI.
Klicken Sie auf Bericht, um die ROI-Daten, einschließlich digitaler Daten und Imaging-Traces für jeden ROI, in einem Dateiordner zu speichern. Die Ganzzellen-Patch-Clamp-Aufzeichnung und Anwendung einer einsekündigen Depolarisation von 80 bis 10 Millivolt wurde durchgeführt, um Exo und Endozytose hervorzurufen. Die angewandte Depolarisation induzierte einen nach innen gerichteten Kalziumstrom, einen Kapazitätssprung, der auf eine Exozytose hinweist, und einen Kapazitätsabfall nach dem Sprung, was auf eine Endozytose hinweist.
Mit Zeitraffer-Bildgebung am Zellboden wurden Fusionsereignisse, die durch das einsekündige Depolarisationsprotokoll induziert wurden, als FFN-Abnahme angezeigt, die die FFN511-Freisetzung widerspiegelt, begleitet von FPH- und A655-Spotfluoreszenzzunahme, die die PH-mNG- und A655-Diffusion von der Plasmamembran und der Badelösung in das Schmelzvesikel widerspiegelt. Die Abbildung zeigt eine enge Fusion, die als F655-Dimmung identifiziert wurde, während FPH mit einer Verzögerung anhielt oder zerfiel. Die Abbildung stellt die Stay-Fusion dar, die durch das Vorhandensein von PH-mNG- und A655-Spots erkannt wurde.
Die Abbildung stellt die Schrumpffusion dar, die als paralleler FPH- und F655-Zerfall erkannt wurde, begleitet von einer parallelen Größenreduktion des PH-mNG-Spots und des A655-Spots. Die hier beschriebene Kombination aus Elektrophysiologie und Superauflösungsmikroskopie ist ein wertvolles Werkzeug zur Messung der Fusionsporendynamik und der Neuroschaltkreise.
