Wir danken M. Boysen für Kommentare zum Manuskript. Dieses Projekt wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (: Cellnetworks EXC 81/1 SFB638 und MA 1278/4-1 MPM und Exzellenzcluster) finanziert. MPM ist Investigator des Exzellenzclusters: Cellnetworks.

1. Herstellung von Puffern und Protein-Proben <ol><li> Bereiten H 2 O-Puffer. Verwendung Hsp90 Standardpuffer (40 mM HEPES / KOH, pH 7,5, 50 mM KCl, 5 mM MgCl 2, 10% Glycerin) und H 2 O-Puffer. Hinweis: Wenn die Probe vor der Analyse dialysiert, verwenden Sie den Dialysepuffer als H 2 O-Puffer. Es ist wesentlich, daß die D 2 O-Puffer unterscheidet sich von der H 2 O-Puffer nur in der Wasserstoffisotop. Flüchtige Puffer wie NH 4 CO 3 oder NH 4-Acetat-oder Pufferkomponenten sind nicht geeignet! </li><li> Bereiten D 2 O-Puffer durch Gefriertrocknung von Hsp90 Standardpuffer mit Hilfe eines Vakuum-Konzentrator. Nach vollständiger Verdampfung von H 2 O hinzufügen reines D 2 O an das Rohr, um die anfängliche Volumen (zB 1 ml mit 15% Glycerin Puffer erfordern die Zugabe von 850 ul D 2 O) zu erreichen. Wiederholen Sie die vollständige Verdampfung des Puffer abgeblasen, und der Puffer / Salz-comKomponenten in D 2 O 2x. </li><li> Vorbereitung Quench-Puffer (0,4 M KH 2 PO 4 / H 3 PO 4 pH 2,2). Hinweis: Um die Effizienz des Magen-Darm-Digest von sehr stabilen Proteinen, 4 M Guanidin-Hydrochlorid und 0,5 M Tris (2-carboxyethyl) phosphin (TCEP-HCl) zugegeben werden, zu verbessern. </li><li> Bereiten Sie 100% Kontrolle Probe (6 M Guanidin-Hydrochlorid, D 2 O). Hinzufügen Guanidinhydrochlorid zu einem Hsp90-Aliquot auf eine Endkonzentration von 6 M zu erreichen vollständig verdampfen H 2 O aus der Probe und fügen D 2 O, um das Rohr um die anfängliche Volumen (z. B. 100 &amp;mgr; l Probe mit 10% Glycerin erreichen die Zugabe 90 &amp;mgr; l D 2 O). Wiederholen Sie die vollständige Verdampfung des Puffer abgeblasen, und der Puffer / Salzkomponenten in D 2 O. Hinweis: 20-100 pmol der Probe für jede Injektion erforderlich. Bereiten Sie genügend Probe, um eine 100%-Kontrolle für jeden Tag des HX-MS-Experimente zu haben. </li><li> Bereiten 50 pmol Hsp90 in 5 ul Hsp90 Standardpuffer. Hinweis: Ein Betrag in Höhe von 20-100 pmol Probe wird für jeden Punkt der Rohdaten erforderlich. Das Volumen der Probe in der Reaktion ist 1-5 &amp;mgr; ideal. Stellen Sie die Konzentration, um diese Anforderungen zu passen. Jeder Puffer kann, solange es keine Reinigungsmittel oder flüchtige Bestandteile enthalten, verwendet werden. </li></ol> 2. Vorbereitung von immobilisiertem Pepsin auf Aldehyd-Aktivperlen <ol><li> Man löst 80 mg frischem Pepsin in 2 ml 50 mM Natriumcitrat (pH 5). </li><li> Lösen Sie 20 mg Natriumcyanoborhydrid, mit Vorsicht hand (sehr giftig!) In 1 ml 2 M Na 2 SO 4 und in den Pepsin-Lösung. </li><li> Inkubieren Gemisch 10 min bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren (z. B. Kopfschüttler). </li><li> Hinzufügen von 600 mg Kügelchen mit immobilisierten Aldehydgruppen zu der Mischung und Inkubation für 5-10 min bei Raumtemperatur. </li><li> Hinzufügen von 2,2 ml 2 M Na 2 SO4 (pH 5) in 100 &amp;mgr; l Aliquots alle 3 min über eine Stunde langsam Salz aus dem Pepsin. Vorsichtig mischen die Probe zwischen den Zugaben in einem Überkopfschüttler bei Raumtemperatur. </li><li> Die Pepsin Perlen Inkubation bei 4 ° C für 14-16 h / über Nacht in einem Überkopfschüttler. </li><li> Die Reaktion wird durch Zugabe von 1 ml 1 M Ethanolamin und Inkubation bei Raumtemperatur für 2 Stunden. </li><li> Spin down die Perlen in einem 50 ml Falcon-Röhrchen bei 500 Upm, den Überstand verwerfen und resuspendieren die Perlen in 0,1% Ameisensäure. Wiederholen Sie diesen Schritt 2x. Nach dem letzten Zentrifugationsschritt, Überstand verwerfen und schätzen Volumen von Perlen. In eine gleichwertige Menge von 0,1% Ameisensäure und speichern bei 4 ° C </li></ol> 3. Herstellung von Säulen für Amid Wasserstoff-Austausch <ol><li> Verwenden Vorsäule mit einem Innendurchmesser von 1 mm zum Einfangen und Spalten mit 2 mm für Pepsin Spalten. </li><li> Lösen Sie eine Seite der Schutzsäule und den Filter zu entfernen. Schrauben Sie die Verpackung funnel auf das offene Ende der Säule. Verwenden eine 1/16 Zoll-Adapter und Schlauch eine leere Spritze (5 ml) zu dem unteren Auslass der Säule zu befestigen. Stellen Sie sicher, dass es gasdicht auf den Guard-Säule befestigen. </li><li> Geben Sie einige Tropfen von Gülle Perlenmaterial auf der Oberseite des Trichters. Ziehen Sie den Kolben der Spritze, um den Schlamm durch den Trichter in die Guard-Säule saugen. Bewerben mehr Gülle Perlenmaterial auf den Trichter und das Verfahren fortsetzen, bis die Schutzsäule ist komplett mit Perlenmaterial gefüllt. Nehmen Sie den Trichter und legen Filter und Filterring auf das offene Ende. Schrauben Sie die Spalte Kappe auf den Guard-Säule und entfernen Sie die Spritze von der anderen Seite. Schließen Sie beide Enden der Schutzsäulen mit Steckern, um das Trocknen von Säulenmaterial zu vermeiden. </li></ol> 4. Einrichten des Systems für die Wasserstoffwechsel-Massenspektrometrie (HX-MS) <ol><li> Man verbindet die Falle Spalte mit dem HPLC-System (Fig. 1). Äquilibrieren der Säule durch Einstellen der Strömungsrate desPumpe A auf 0,4 ml / min mit 0,1% iger Ameisensäure als Lösungsmittel. Sie das Pepsin Spalte noch die analytische Säule noch nicht an. </li><li> Kalibrieren des Massenspektrometers und verbinden den Ausgang der HPLC mit der Quelle des Massenspektrometers. </li></ol> 5. Bestimmung der Dynamic Range von Exchange <ol><li> Bereiten hochreines Lösungsmittel A (0,1% Ameisensäure in Wasser) und hochreines Lösungsmittel B (0,1% Ameisensäure in Acetonitril); fertig gemischte Lösungsmittel sind im Handel erhältlich. Spülen Sie die HPLC-Pumpen. Richten Sie die Chromatographie und Massenspektrometrie-Methoden in der Steuersoftware, indem Sie ein Programm mit einem Stufengradienten nach kurzer Entsalzungsschritt. Für voller Länge verwenden Hsp90 eine 1-2 min Entsalzungsschritt, gefolgt von Einschalten der 6-Port-Ventil von entsalzen / LOAD zur Elution und einen Schritt Gradienten von 90% Lösungsmittel A/10% Lösungsmittel B zu 5% Lösungsmittel A/95% Lösungsmittel B. Vor der Injektion gesetzt das Einspritzventil zu laden und den 6-Wege-Ventil zum / Ladeposition zu entsalzen. Anmerkung: Verwenden Sie kein Pepsin oder analytische Säule während dieses Experiments. </li><li> Bereiten 100-200 pmol von Hsp90 in 1-10 ul H 2 O-Puffer und Inkubation für 10 min bei 30 ° C Hinzufügen Temperatur eingestellt D 2 O-Puffer, um das Probenvolumen bis zu 100 &amp;mgr; l zu bringen und Inkubieren für eine genau definierte Zeitspanne (z. B. 10 Sekunden, 100 Sekunden, 1000 Sekunden). 100 l Puffer Quench zugeben und durch Auf-und Abpipettieren. Spritzen die 200 ul Probe in die Einspritzöffnung des Einspritzventils mit einer Hamilton-Spritze. Starten Sie das Programm-Chromatographie und schalten Sie das Einspritzventil in INJECT-Position. Nach 2 min schalten Sie die 6-Port-Ventil von entsalzen / LADEN zu eluieren. Wiederholen Sie dies für mindestens drei Zeitpunkten. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 5.2 sondern fügen 2-3x Überschuss STI1 zum Hsp90-Probe vor der Inkubation für 10 min bei 30 ° C. </li><li> Bestimmen Sie die in voller Länge Proteinmassen durch Entfaltung von Spektren in der Massenspektrometrie-Software. Berechnen Sie die Anzahl der Incorporated Deuteronen durch Vergleichen des Molekulargewichts von Hsp90 in voller Länge mit der beobachteten Masse nach jedem Durchlauf (z. B. 10 Sekunden, 100 Sekunden, 1000 Sekunden). </li><li> Zeichnen Sie die eingeDeuteRonen für Hsp90 in Abwesenheit und Gegenwart von STI1 (y-Achse) gegen die Zeit (x-Achse). Bestimmen den Zeitpunkt, in dem dynamischen Bereich, wo die Differenz zwischen den beiden Kurven ist maximal. Verwenden Sie diesen Wert für die Inkubationszeit in D 2 O bei der Identifizierung Hsp90-STI1 Schnittstelle und Dynamik auf Peptidebene. </li></ol> 6. Bestimmung der Magen Peptiden mithilfe der MS / MS-Spektren <ol><li> Verbinden des Pepsin-Säule und analytische Säule des Systems. </li><li> Stellen Sie die Parameter für die Chromatographie und Massenspektrometrie in der Steuerungssoftware, indem Sie Verlaufstyp und Massenspektrometrie-Methode. Wählen Sie ein langes Gefälle (zB mehr als 90 min), um eine gute chromatographische Auflösung zu gewährleisten. Aktivieren MS / MS-Spektren zu dem Massenspektrometer. Hinweis: Gute Auflösungtion auf der HPLC und hohe Massengenauigkeit haben die höchste Priorität in diesem Schritt. </li><li> Bereiten 100-200 pmol von Hsp90 in 100 ul H 2 O-Puffer. 100 l Puffer Quench zugeben und durch Auf-und Abpipettieren. Spritzen die 200 ul Probe in die Einspritzöffnung des Einspritzventils mit einer Hamilton-Spritze. Starten Sie das Programm-Chromatographie und schalten Sie das Einspritzventil in INJECT-Position. Nach 2 min schalten Sie die 6-Port-Ventil von entsalzen / LADEN Position eluieren. Hinweis: Wenn mehr als ein Protein in HX-MS (dh Protein-Protein-Interaktionsschnittstellen) analysiert werden die Peptide für jedes Protein haben individuell bestimmt werden. </li><li> Identifizieren Magen Peptiden von Hsp90 durch Durchsuchen einer Datenbank (dh Maskottchen) für die resultierenden Peptide. Hinweis: Es ist möglich, eine benutzerdefinierte Datenbank verwenden, da es das Ziel ist, so viele Magen-Darm-Peptide wie möglich zu bestimmen, und die Analyse wird mit gereinigtem Protein getan. Probenreinheit wird have berücksichtigt werden. </li><li> Wiederholen diesen Schritt ohne MS / MS und der Gradient für die eigentliche HX Experiment verwendet wird. Für Hsp90 und STI1 verwenden eine 10 min-Gradienten von 90% Lösungsmittel A/10% Lösungsmittel B auf 45% Lösungsmittel A/55% Lösungsmittel B Hinweis: Farbverläufe sind in der Regel zwischen 5-15 min und stark abhängig von der Komplexität und der Probe HX Systemspezifikationen. </li><li> Bestimmen Sie die Retentionszeiten der Magen-Darm-Peptide in 6,4 im Gradienten in 6,5 verwendet, identifiziert und erstellt eine Liste mit 1.) Peptid-Sequenz 2). Peptid Ladezustand und 3). Retentionszeit. Dies wird verwendet, um jedes Peptid nach HX-Experimente zu identifizieren. Hinweis: Beachten Sie, dass Peptide mit kleinen m / z Unterschiede, gleiche Ladezustand und identische Retentionszeit kann eine Quelle der Zweideutigkeit. </li></ol> 7. Identifizierung von Protein-Protein-Interaktionsschnitt <ol><li> Stellen Sie den Gradienten und Massenspektrometrie-Methode in der Steuer SoftwarE. Verwenden Sie eine 10 min linearen Gradienten von 90% Lösungsmittel A/10% Lösungsmittel B auf 45% Lösungsmittel A/55% Lösungsmittel B Legen Sie eine Massenspektrometrie-Methode, die für die Erkennung von Massen zwischen 300-1.500 m / z optimiert ist, obwohl die meisten Die Peptide werden unter 1000 m / z sein. Stellen Sie das Einspritzventil in LOAD-Position, der 6-Wege-Ventil in LADE / Entsalzung Position. Die Durchflussrate der Ladepumpe auf 0,4 ml / min. Hinweis: Länge und Art des Gradienten sind Beispielabhängig und können optimiert werden. Längere Steigungen verbessern die Auflösung der Chromatographie, sondern verringern die Aufnahme von Deuteronen in Proteine ​​durch Back-Austausch. Die gewählten Methoden müssen die gleichen sein für alle Experimente verglichen werden. </li><li> Für die nicht ausgetauschten Referenz vorbereiten 20-100 pmol von Hsp90 in 100 ul H 2 O-Puffer. 100 l eiskaltem Quenchpuffer, Pipette und zweimal nach unten und injizieren Probe in das Einspritzventil der HPLC. Sofort die Chromatographie-Programm und starten swjucken das Einspritzventil in INJECT-Position. Nach 2 min schalten Sie die 6-Port-Ventil von entsalzen / LADEN Position eluieren. Dies für Hsp90 und STI1 einzeln und für die Mischung von Proteinen. </li><li> Vorbereitung 20-100 pmol von Hsp90 in einem Volumen von 1-5 ul. In Temperatur angepasst D 2 O-Puffer, das Probenvolumen bis zu 100 ul zu bringen und genau Inkubation für einen definierten Zeitraum (zB 30 sec; für Konformationsdynamik siehe Hinweis). 100 l eiskaltem Quenchpuffer, Pipette auf und ab und zweimal schnell spritzen die 200 ul in die Einspritzventil der HPLC. Sofort die Chromatographie-Programm zu starten und schalten Sie das Einspritzventil in INJECT-Position. Nach 2 min schalten Sie die 6-Port-Ventil von entsalzen / LADEN Position eluieren. Tun Sie dies für jedes Protein einzeln, um die Deuteronen Einbau in jedes Peptid in Abwesenheit des interagierenden Proteins zu bestimmen. Hinweis: Bei der Untersuchung der Dynamik der KonMational Änderungen, wiederholen Sie das Experiment mit unterschiedlichen Inkubationszeiten von Hsp90 in D 2 O-Puffer. Versuchen Sie, eine große Zeitskala durch die Wahl Inkubationszeiten logarithmisch (zB 10 Sek., 30 Sek., 100 Sek., 300 Sek., 1.000 sec, usw.). D 2 O-Puffer und Probenpuffer exakt identisch mit Ausnahme des Wasserstoffisotops sein. </li><li> Bereiten Sie eine gleiche Menge von 100% Kontrollprobe (20-100 pmol) und fügen D 2 O-Puffer, das Probenvolumen bis zu 100 ul zu bringen. 100 l eiskaltem Quenchpuffer, Pipette auf und ab und zweimal schnell spritzen die 200 ul in die Einspritzventil der HPLC. Sofort die Chromatographie-Programm zu starten und schalten Sie das Einspritzventil in INJECT-Position. Nach 2 min schalten Sie die 6-Port-Ventil von entsalzen / LADEN Position eluieren. </li><li> Um die Interaktionsfläche bestimmen mischen Hsp90 mit einer mindestens 2-fachen Überschuß an STI1 das Gleichgewicht auf dem gebundenen Zustand zu wechseln (siehe Hinweis) und Inkubationauf die gewünschte Temperatur, bis die Komplexbildung im Gleichgewicht. Hinzufügen Temperatur eingestellt D 2 O-Puffer, um das Probenvolumen bis zu 100 &amp;mgr; l zu bringen und Inkubieren für eine genau definierte Zeitspanne (z. B. 30 Sekunden). 100 l eiskaltem Quenchpuffer, Pipette auf und ab und zweimal schnell spritzen in die Einspritzventil der HPLC. Nach 2 min schalten Sie die 6-Port-Ventil von entsalzen / LADEN Position eluieren. Wiederholen Sie diesen Versuch mit 20-100 pmol STI1 und überschüssige von Hsp90. Hinweis: Die absoluten Konzentrationen hängen von der Dissoziation Gleichgewichtskonstante der Wechselwirkung. Idealerweise nach der Verdünnung in D 2 O die Konzentration des Proteins im Überschuß zugegeben mindestens 10x K D (entsprechend&gt; 85% der unteren konzentrierten Protein gebunden) sein. </li><li> Analysieren Sie die erfassten Daten mit einer geeigneten Software und verwenden Sie die Retentionszeiten in Schritt 6.5 festgelegt, jede Peptid in der Analyse zu finden. Berechnungente der Schwerpunkt des Isotopenverteilung für die nicht ausgetauschten Protein (Schritt 7.2) und für die Experimente HX (Schritt 7.3). Hinweis: Obwohl die Isotopenmuster der Peptide ausgetauscht sehen anders aus als ihre nicht ausgetauschten Gegenstücke, sowohl das Wissen über Ladezustand des Peptids und die hohe Massengenauigkeit des Massenspektrometers ermöglicht die einfache Bestimmung der Schwerpunkte. </li><li> Vergleichen Einbau von Deuteronen an Zielprotein allein und mit mehr als Bindungspartner. Dies kann automatisch mit kommerzieller Software oder manuell mit einem Tabellenkalkulationsprogramm durchgeführt werden. Die 100% Kontrolle Probenwerte bezeichnen den maximalen Wechsel für jedes Peptid und kann verwendet werden, um die Menge von D 2 O Etikett verloren während des Experiments durch Rückaustausch bestimmen. </li></ol>

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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+detection+and+analysis+of+bimodal+isotope+peak+distributions+in+H/D+exchange+mass+spectrometry+using+HeXicon.">Automated detection and analysis of bimodal isotope peak distributions in H/D exchange mass spectrometry using HeXicon.</a> Intl. J. mass spectrom. 302 (1-3), 125-131 (2011).</li><li>Walters, B. T., Ricciuti, A., Mayne, L., Englander, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimizing+back+exchange+in+the+hydrogen+exchange-mass+spectrometry+experiment.">Minimizing back exchange in the hydrogen exchange-mass spectrometry experiment.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 23 (12), 2132-2139 (2012).</li><li>Weis, D. D., Wales, T. E., Engen, J. R., Hotchko, M., Ten Eyck, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+EX1+kinetics+in+H/D+exchange+mass+spectrometry+by+peak+width+analysis.">Identification and characterization of EX1 kinetics in H/D exchange mass spectrometry by peak width analysis.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 17 (11), 1498-1509 (2006).</li><li>Fang, J., Rand, K. D., Beuning, P. J., Engen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=False+EX1+signatures+caused+by+sample+carryover+during+HX+MS+analyses.">False EX1 signatures caused by sample carryover during HX MS analyses.</a> Intl. J. Mass Spectrom. 302 (1-3), 19-25 (2011).</li><li>Deng, Y., Smith, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+unfolding+domains+in+large+proteins+by+their+unfolding+rates.">Identification of unfolding domains in large proteins by their unfolding rates.</a> Biochem. 37 (18), 6256-6262 (1998).</li><li>Wales, T. E., Engen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+unfolding+of+diverse+SH3+domains+on+a+wide+timescale.">Partial unfolding of diverse SH3 domains on a wide timescale.</a> J. Mol. Biol. 357 (5), 1592-1604 (2006).</li><li>Pan, Y., Piyadasa, H., O'Neil, J. D., Konermann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+dynamics+of+a+membrane+transport+protein+probed+by+h/d+exchange+and+covalent+labeling:+the+glycerol+facilitator.">Conformational dynamics of a membrane transport protein probed by h/d exchange and covalent labeling: the glycerol facilitator.</a> J. Mol. Biol. 416 (3), 400-413 (2012).</li><li>Hebling, C. M., Morgan, C. R., Stafford, D. W., Jorgenson, J. W., Rand, K. D., Engen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+analysis+of+membrane+proteins+in+phospholipid+bilayer+nanodiscs+by+hydrogen+exchange+mass+spectrometry.">Conformational analysis of membrane proteins in phospholipid bilayer nanodiscs by hydrogen exchange mass spectrometry.</a> Anal chem. 82 (13), 5415-5419 (2010).</li><li>Abzalimov, R. R., Kaplan, D. A., Easterling, M. L., Kaltashov, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+conformations+can+be+probed+in+top-down+HDX+MS+experiments+utilizing+electron+transfer+dissociation+of+protein+ions+without+hydrogen+scrambling.">Protein conformations can be probed in top-down HDX MS experiments utilizing electron transfer dissociation of protein ions without hydrogen scrambling.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 20 (8), 1514-1517 (2009).</li></ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Bindung eines Interaktionspartners zu einem Protein führt unweigerlich zu Veränderungen der Lösungsmittelzugänglichkeit an der Bindungsstelle. Darüber hinaus haben viele Proteine ​​werden dynamisch Konformationsänderungen bei der Bindung, die anderen Regionen beeinflussen als die tatsächliche Bindung Schnittstelle. HX-MS ist eine robuste Methode, um diese Änderungen zu überwachen und ist sogar in der Lage, enthüllt Konformationsänderungen in Proteinen auf Zeitskalen, dass andere Verfahren nicht abdecken k...

Die Anzahl von Kristallstrukturen von Proteinen und Proteinkomplexen schnell erhöht in den letzten Jahren. Sie präsentieren unschätzbare Schnappschüsse von der strukturellen Organisation dieser Proteine ​​und eine Grundlage für die Struktur-Funktions-Analyse. Jedoch die Dynamik von Proteinen und Konformationsänderungen, die für ihre Funktionen sind, werden selten durch Röntgenkristallographie ergab. Cryo-Elektronenmikroskopie, auf der anderen Seite, ist in der Lage, Protein-und Protein-Komplexe in verschiedenen Konformationen zu erfassen, aber im Allgemeinen können Konformationsänderungen nicht lösen auf Sekundärstrukturebene ein. Konformationsdynamik von Proteinen in Lösung in atomarer Informationen sind nur für NMR gelöst werden, aber dieses Verfahren ist immer noch relativ kleine Proteine ​​von Größen (in der Regel ≤ 30 kDa) beschränkt und erfordert hohe Konzentrationen von Proteinen (≥ 100 &amp;mgr; M), die Experimente mit behindert Oligomerisierung oder Aggregation neigen Proteine ​​2. Eine Methode, dieder Lage ist, zwischen hochauflösende Röntgen-Kristallographie und Kryo-Elektronenmikroskopie und die Brücke nicht durch Größe oder Protein-Konzentration begrenzt ist Amid-Wasserstoff-1 H / 2 H-Austausch (HX) in Kombination mit der Massenspektrometrie (MS). In den letzten Jahren hat dieses Verfahren einen wertvollen analytisches Werkzeug für die Analyse von Proteindynamik, Proteinfaltung, der Proteinstabilität und Konformationsänderungen 3-5 entwickelt. Die molekulare Grundlage dieses Verfahrens ist die Labilität Rückgrat Amidwasserstoffe in Proteinen, die durch Deuteriumatome austauscht, wenn das Protein in D 2 O-Lösung gegeben. Die anschließende Erhöhung der Proteinmasse im Laufe der Zeit wird mit hochauflösenden MS gemessen. Kurz unstrukturierten Peptiden HX hängt nur von der Temperatur, Katalysatorkonzentration (OH -, H 3 O +, dh pH-Wert, siehe Abbildung 3) und Aminosäure-Seitenketten der benachbarten Resten durch induktive, Katzekatalytische und sterische Effekte. Diese Auswirkungen auf die intrinsische chemischen Austauschrate k ch wurden elegant von Bai et al. 6 quantifiziert und ein Programm zur Verfügung (mit freundlicher Genehmigung Z. Zhang), die k ch für jede Aminosäure in einem Polypeptid abhängig von pH-Wert und Temperatur berechnet. Bei neutralem pH-Wert und Umgebungstemperaturen ch k in der Größenordnung von 10 1 bis 10 3 sec -1. Ionen in das Innere einer eng gefalteten Protein - in gefalteter Proteine ​​HX 2-9 Größenordnungen langsamer hauptsächlich auf Wasserstoffbrückenbindung in der Sekundärstruktur und aufgrund eingeschränkter Zugangs hydratisierter OH geringem Ausmaß sein. HX in nativen Proteinen impliziert daher teilweise oder globale Entfaltung, chemischen Austausch und die Rückfaltung in den nativen Zustand nach Gleichung (1) und die beobachteten Wechselkurse k obs abhängig von der Öffnungsrate k op, die Schlussrate k cl und der intrinsischen chemischen Austausch rate ch k gemäß Gleichung (2). <img alt="Gleichungen 1-2" src="/files/ftp_upload/50839/50839eq1-2.jpg" /> Unter nativen Zustand Bedingungen k op ist viel kleiner als k ch und kann im Nenner vernachlässigt werden. Es gibt zwei extreme Wechsel Regime genannt EX1 und EX2. Wenn der k Cl ist viel kleiner als k CH (EX1) die beobachtete Geschwindigkeit praktisch gleich der Öffnungsrate und HX unmittelbare Beobachtung der Entfaltung eines Strukturelements. Ein solcher Austausch Regime, in dem alle Amidprotonen Austausch auf einmal beim Öffnen des Strukturelements ist leicht beobachtbaren MS durch eine bimodale Verteilung der Isotopenpeaks 7. Wenn k Cl ist viel größer als k CH (EX2) die beobachtete Rate ist proportional zu k ch wobei die Proportionalitätskonstante gleich dem Faltungs-Entfaltungs-Gleichgewichte ist die Konstante K u = K op </sub&gt; K / cl. Unter diesen Bedingungen sind viele Öffnungs-und Schließereignisse notwendig, bevor alle Amidprotonen gegen Deuteronen, was zu einem allmählichen Anstieg der Durchschnittsmasse, während die Isotopenverteilung etwa gleich bleibt. Die EX2 Regime ermöglicht die Bestimmung der freien Energie der Entfaltung &amp;Dgr; G u und damit der Stabilität eines Strukturelements. Unter nativen Zustand Zustand der EX2-Regime ist am häufigsten. Erhöhung des pH-Wertes und Zugabe von chaotropen Mitteln können die Austauschmechanismus zu EX1 verschieben. Daher kann HX-MS verwendet werden, um thermodynamische erkunden sowie kinetischen Parameter der Proteinfaltung und Konformationsänderungen werden. Wie oben erwähnt ist HX eigen pH-und temperaturabhängig und der Austausch Halbwertszeit von einer völlig löse ausgesetzt Protonen des Rückgrats Amidgruppe zwischen 5-400 ms bei einem physiologischen pH-Wert (pH 7,6) und 30 ° C, aber mindestens 10 min auf&gt; 15 Stunden mit einem Mittelwert von&gt; 2 h bei pH 2,9 und 0 °C (mit Ausnahme des Protons des ersten Gerüst-Amidbindung eines Polypeptids, das mit einer Halbwertszeit von ca. 1-2 min austauscht). Unter solchen langsamen Austausch Bedingungen ist es möglich, die Probe zu verdauen Proteasen (z. B. Pepsin), die aktiv sind, unter diesen Bedingungen mit verlieren sich alle in den eingeDeuteRonen enthaltenen Informationen. Seit der Einführung des Magen-Darm-Verdauung unter langsamem Austausch Bedingungen kann nicht nur die Gesamt HX Kinetik der vollständigen Proteine ​​analysiert werden, aber HX kann auf bestimmte Regionen 8,9 lokalisiert werden. Ortsauflösung wird noch auf die Größe der Fragmente Magen erzeugt, die im allgemeinen zwischen 10-30 Reste beschränkt. Jedoch könnte überlappende Fragmente aufgrund der unspezifischen Art der Spaltung durch Pepsin erzeugt eine Erhöhung der räumlichen Auflösung führen. Darüber hinaus wurden mehrere andere Proteasen gefunden unter Abschrecken Bedingungen aktiv zu sein, aber viel weniger effizient als Pepsin 10. Weitere zunehse der räumlichen Auflösung können durch Fragmentierung von Peptiden in der Gasphase durch Methoden, die Deuterierung Muster wie Elektroneneinfang-Dissoziation (ECD), Elektronentransfer-Dissoziation (ETD) und Infrarot-Multiphoton-Dissoziation (IRMPD) 11-13 erhaltenen erreichen. Diese Methoden verhindern den Verlust an räumlicher Auflösung durch intramolekulare Protonenwanderung (&quot;Scrambling&quot;), die durch stoßinduzierte Dissoziation (CID) zu beobachten ist die am häufigsten verwendeten Fragmentierungstechnik. Allerdings erfordern diese Verfahren die Optimierung für jedes einzelne Peptid und ist damit immer noch ziemlich schwierig. HX-MS wurde verwendet, um Protein-Liganden und Protein-Protein-Wechselwirkungen, einschließlich virale Kapsid-Zusammensetzung 14-17 analysieren. Protein-Entfaltung und Rückfaltung sowie temperaturinduzierte Konformationsänderung untersucht 7,18,19. Phosphorylierung und einzigen Aminosäure mutationsbedingte Konformationsänderungen 16,20 und nucleotide-induzierten Veränderungen wurden analysiert 21,22. Daher scheint diese Methode ideal geeignet zur Montage und Dynamik von molekularen Maschinen zu analysieren. Ein attraktiver Kandidat, dessen Mechanismus ist von großem allgemeinem Interesse ist das Hsp90-Chaperon-Komplex.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagent/Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>maXis QTOF</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nanoAcquity UPLC</td>
			<td>Waters Corp.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shimadzu 10AD-VP</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-port Valve EPC6W with microelectric actuator</td>
			<td>Valco</td>
			<td>#EPC6W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection valve (manual)</td>
			<td>Rheodyne</td>
			<td>#7725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poros AL20 media</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>#1-6029-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poros R2</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>#1-1118-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#P6887</td>
			<td>use fresh pepsin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbore (1 mm)</td>
			<td>IDEX</td>
			<td>#C-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbore (2 mm)</td>
			<td>IDEX</td>
			<td>#C-130B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquity UPLC BEH C8 Column</td>
			<td>Waters Corp.</td>
			<td>#186002876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>#5355000.011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing (various diameters)</td>
			<td>IDEX</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fittings</td>
			<td>IDEX</td>
			<td>#PK-110 with PK-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing protein dynamics using hydrogen exchange mass spectrometry

Alle zellulären Prozesse abhängig von der Funktionalität der Proteine. Obwohl die Funktionalität eines gegebenen Proteins ist die direkte Folge der einzigartigen Aminosäuresequenz wird nur durch die Faltung der Polypeptidkette in einer einzigen definierten dreidimensionalen Anordnung oder häufiger in einem Ensemble von Konformationen ineinander Umwandeln realisiert. Die Untersuchung der Verbindung zwischen Protein-Konformation und seine Funktion ist für ein komplettes Verständnis davon, wie Proteine ​​in der Lage sind, ihre große Vielfalt von Aufgaben zu erfüllen daher unerlässlich. Eine Möglichkeit, ein Protein Konformationsänderungen erfährt, während voran durch seine Funktionszyklus studieren Wasserstoff-1 H / 2 H-Austausch in Kombination mit hochauflösender Massenspektrometrie (HX-MS). HX-MS ist eine vielseitige und robuste Methode, die eine neue Dimension der Strukturinformationen, zB durch Kristallographie gewonnen erstellt. Es wird verwendet, um Protein zu studieren und Ausklappen Bindung von kleinen molkül Liganden, Protein-Protein-Wechselwirkungen, Konformationsänderungen verbunden Enzymkatalyse und Allosterie. Zusätzlich wird HX-MS häufig verwendet, wenn die Menge an Protein ist sehr begrenzt oder Kristallisation des Proteins nicht möglich ist. Hier stellen wir ein allgemeines Protokoll für die Untersuchung der Proteindynamik mit HX-MS und zu beschreiben als ein Beispiel, wie man die Interaktionsschnittstelle von zwei Proteinen in einem Komplex zu offenbaren.

Hsp90 ist ein Chaperon in Hefe und Mitglied der Hsp90-Chaperon-Familie. Indem wir durch eine komplexe ATPase-Zyklus hilft es spät Klapptritt vieler Protein Kunden. Effiziente Faltung erfordert Transfer von Clients von Hsp70 und Wechselwirkung des Co-Chaperon Sti1/Hop. STI1 direkt bindet an Hsp90 und erleichtert die Client-Bindung durch die Hemmung von Hsp90-ATPase-Aktivität. Interaktion von Hsp90 mit STI1 wurde vor kurzem mit HX-MS-23 untersucht. Hier stellen wir repräsentative Ergebnisse der zugrunde lieg...

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Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

Protein-Konformation und Dynamik sind der Schlüssel zum Verständnis der Beziehung zwischen Struktur und Funktion. Wasserstoffaustausch gekoppelt mit hochauflösender Massenspektrometrie ist eine vielseitige Methode, um die Konformationsänderungen Dynamik von Proteinen als auch studieren Charakterisierung von Protein-Ligand und Protein-Protein-Wechselwirkungen, einschließlich Kontaktschnittstellen und allosterische Effekte.

Analyse von Proteindynamik mit Wasserstoffwechsel Massenspektrometrie

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

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18.3K Aufrufe.  University of Heidelberg.  Protein-Konformation und Dynamik sind der Schlüssel zum Verständnis der Beziehung zwischen Struktur und Funktion. Wasserstoffaustausch gekoppelt mit hochauflösender Massenspektrometrie ist eine vielseitige Methode, um die Konformationsänderungen Dynamik von Proteinen als auch studieren Charakterisierung von Protein-Ligand und Protein-Protein-Wechselwirkungen, einschließlich Kontaktschnittstellen und allosterische Effekte. 

Serie: Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

Real-time Breath Analysis by Using Secondary Nanoelectrospray Ionization Coupled to High Resolution Mass Spectrometry

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental exposure in a non-invasive manner. In this work, we present a protocol to characterize the exhaled VOCs in real time by using secondary nanoelectrospray ionization coupled to high resolution mass spectrometry (Sec-nanoESI-HRMS). The homemade Sec-nanoESI source was readily set up based on a commercial nanoESI source. Hundreds of peaks were observed in the background-subtracted mass spectra of exhaled breath, and the mass accuracy values are -4.0-13.5 ppm and -20.3-1.3 ppm in the positive and negative ion detection modes, respectively. The peaks were assigned with accurate elemental composition according to the accurate mass and isotopic pattern. Less than 30 s is used for one exhalation measurement, and it takes approximately 7 min for six replicated measurements.

A protocol for characterizing chemical composition of exhaled breath in real time by using secondary nanoelectrospray ionization coupled to high resolution mass spectrometry is demonstrated.

Echtzeit-Atem-Analyse mithilfe von sekundären Nanoelectrospray Ionisation mit hochauflösenden Massenspektrometrie gekoppelt

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental ...

Forschung

Chemie

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have been thought of as a type of molecular information storage. Mass spectrometry analysis has been considered the method of choice for sequencing peptoids. Peptoids can be synthesized via solid phase chemistry using a repeating two-step reaction cycle. Here we present a method to manually synthesize oligo-peptoids and to analyze the sequence of the peptoids using tandem mass spectrometry (MS/MS) techniques. The sample peptoid is a nonamer consisting of alternating N-(2-methyloxyethyl)glycine (Nme) and N-(2-phenylethyl)glycine (Npe), as well as an N-(2-aminoethyl)glycine (Nae) at the N-terminus. The sequence formula of the peptoid is Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, where Ac is the acetyl group. The synthesis takes place in a commercially available solid-phase reaction vessel. The rink amide resin is used as the solid support to yield the peptoid with an amide group at the C-terminus. The resulting peptoid product is subjected to sequence analysis using a triple-quadrupole mass spectrometer coupled to an electrospray ionization source. The MS/MS measurement produces a spectrum of fragment ions resulting from the dissociation of charged peptoid. The fragment ions are sorted out based on the values of their mass-to-charge ratio (m/z). The m/z values of the fragment ions are compared against the nominal masses of theoretically predicted fragment ions, according to the scheme of peptoid fragmentation. The analysis generates a fragmentation pattern of the charged peptoid. The fragmentation pattern is correlated to the monomer sequence of the neutral peptoid. In this regard, MS analysis reads out the sequence information of the peptoids.

A protocol is described for the manual synthesis of oligo-peptoids followed by sequence analysis by mass spectrometry.

Synthese- und Massenspektrometrie der Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...

Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing metabolic reactions, DNA repair and replication. Therefore, a detailed understanding of these processes provides critical information on how cells function. Integrative structural MS methods offer structural and dynamical information on protein complex assembly, complex connectivity, subunit stoichiometry, protein oligomerization and ligand binding. Recent advances in integrative structural MS have allowed for the characterization of challenging biological systems including large DNA binding proteins and membrane proteins. This protocol describes how to integrate diverse MS data such as native MS and ion mobility-mass spectrometry (IM-MS) with molecular dynamics simulations to gain insights into a helicase-nuclease DNA repair protein complex. The resulting approach provides a framework for detailed studies of ligand binding to other protein complexes involved in important biological processes.

Mass spectrometry (MS) has emerged as an important tool for the investigation of structure and dynamics of macromolecular assemblies. Here, we integrate MS-based approaches to interrogate protein complex formation and ligand binding.

Analyse von Protein-Architekturen und Protein-Ligand-komplexen durch Integrative strukturelle Massenspektrometrie

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing ...

Large-scale Top-down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis Tandem Mass Spectrometry

Capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS) has been recognized as a useful tool for top-down proteomics that aims to characterize proteoforms in complex proteomes. However, the application of CZE-MS/MS for large-scale top-down proteomics has been impeded by the low sample-loading capacity and narrow separation window of CZE. Here, a protocol is described using CZE-MS/MS with a microliter-scale sample-loading volume and a 90-min separation window for large-scale top-down proteomics. The CZE-MS/MS platform is based on a linear polyacrylamide (LPA)-coated separation capillary with extremely low electroosmotic flow, a dynamic pH-junction-based online sample concentration method with a high efficiency for protein stacking, an electro-kinetically pumped sheath flow CE-MS interface with extremely high sensitivity, and an ion trap mass spectrometer with high mass resolution and scan speed. The platform can be used for the high-resolution characterization of simple intact protein samples and the large-scale characterization of proteoforms in various complex proteomes. As an example, a highly efficient separation of a standard protein mixture and a highly sensitive detection of many impurities using the platform is demonstrated. As another example, this platform can produce over 500 proteoform and 190 protein identifications from an Escherichia coli proteome in a single CZE-MS/MS run.

A detailed protocol is described for the separation, identification, and characterization of proteoforms in protein samples using capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS). The protocol can be used for the high-resolution characterization of proteoforms in simple protein samples and the large-scale identification of proteoforms in complex proteome samples.

Groß angelegte Top-Down-Proteomik mit Kapillare Zone Elektrophorese Tandem-Massenspektrometrie

Capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS) has been recognized as a useful tool for top-down ...

High-throughput and Comprehensive Drug Surveillance Using Multisegment Injection-Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug crisis in public health. Conventional urine drug testing based on a two-tier immunoassay screen followed by a gas chromatography-tandem mass spectrometry (GC-MS/MS) or liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method are expensive and prone to bias while being limited to targeted panels of known drugs of abuse (DoA). Herein, we outline an improved method for drug surveillance that allows for the resolution and detection of an expanded panel of DoA and their metabolites when using multisegment injection-capillary electrophoresis-mass spectrometry (MSI-CE-MS). Multiplexed separations of ten urine samples with a quality control by CE (&lt; 3 min/sample) in conjunction with full-scan data acquisition using a time-of-flight mass spectrometer (TOF-MS) under positive ion mode detection allows for the identification and quantification of DoA above recommended cut-off levels. An excellent resolution of drug isomers and isobars, including background interferences, are achieved when using MSI-CE-MS with an electrokinetic spacer between sample segments, where accurate mass/molecular formula together with the comigration of a matching deuterated internal standard and the detection of one or more bio-transformed metabolites facilitate DoA identification over a wider detection window. Additionally, urine samples can be analyzed directly without enzyme deconjugation for the rapid screening without complicated sample workup. MSI-CE-MS enables the surveillance of a broad spectrum of DoA that is required for the treatment monitoring of high-risk patients, including confirming prescribed drug adherence, revealing illicit drug use/substitution, and evaluating optimal dosage regimes as required for new advances in precision medicine.

Here we describe a high-throughput method for comprehensive drug surveillance that allows for the improved resolution and detection of large panels of drugs of abuse and their metabolites, with quality control based on multisegment injection-capillary electrophoresis-mass spectrometry.

High-Throughput und umfassende Droge-Überwachung mittels Massenspektrometrie Multisegment-Injektion-Kapillar-Elektrophorese

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug ...

Imaging Corrosion at the Metal-Paint Interface Using Time-of-Flight Secondary Ion Mass Spectrometry

Corrosion developed at the paint and aluminum (Al) metal-paint interface of an aluminum alloy is analyzed using time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS), illustrating that SIMS is a suitable technique to study the chemical distribution at a metal-paint interface. The painted Al alloy coupons are immersed in a salt solution or exposed to air only. SIMS provides chemical mapping and 2D molecular imaging of the interface, allowing direct visualization of the morphology of the corrosion products formed at the metal-paint interface and mapping of the chemical after corrosion occurs. The experimental procedure of this method is presented to provide technical details to facilitate similar research and highlight pitfalls that may be encountered during such experiments.

Time-of-flight secondary ion mass spectrometry is applied to demonstrate the chemical mapping and corrosion morphology at the metal-paint interface of an aluminum alloy after being exposed to a salt solution compared with a specimen exposed to air.

Bildkorrosion an der Metal-Paint-Schnittstelle mit zeitweiliger Ionenmassenspektrometrie

Corrosion developed at the paint and aluminum (Al) metal-paint interface of an aluminum alloy is analyzed using time-of-flight secondary ion mass ...

3D Depth Profile Reconstruction of Segregated Impurities Using Secondary Ion Mass Spectrometry

The presented protocol combines excellent detection limits (1 ppm to 1 ppb) using secondary ion mass spectrometry (SIMS) with reasonable spatial resolution (~1 &#181;m). Furthermore, it describes how to obtain realistic three-dimensional (3D) distributions of segregated impurities/dopants in solid state materials. Direct 3D depth profile reconstruction is often difficult to achieve due to SIMS-related measurement artifacts. Presented here is a method to identify and solve this challenge. Three major issues are discussed, including the i) nonuniformity of the detector being compensated by flat-field correction; ii) vacuum background contribution (parasitic oxygen counts from residual gases present in the analysis chamber) being estimated and subtracted; and iii)&#160;performance of all steps within a stable timespan of the primary ion source. Wet chemical etching is used to reveal the position and types of dislocation in a material, then the SIMS result is superimposed on images obtained via scanning electron microscopy (SEM). Thus, the position of agglomerated impurities can be related to the position of certain defects. The method is fast and does not require sophisticated sample preparation stage; however, it requires a high-quality, stable ion source, and the entire measurement must be performed quickly to avoid deterioration of the primary beam parameters.

The presented method describes how to identify and solve measurement artifacts related to secondary ion mass spectrometry as well as obtain realistic 3D distributions of impurities/dopants in solid state materials.

3D-Tiefenprofilrekonstruktion von segregierten Verunreinigungen mittels Sekundärionen-Massenspektrometrie

The presented protocol combines excellent detection limits (1 ppm to 1 ppb) using secondary ion mass spectrometry (SIMS) with reasonable spatial ...

Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials

The adsorption of biomolecules from surrounding biological matrices to the surface of nanomaterials (NMs) to form the corona has been of interest for the past decade. Interest in the bio-nano interface arises from the fact that the biomolecular corona confers a biological identity to NMs and thus causes the body to identify them as &#8220;self&#8221;. For example, previous studies have demonstrated that the proteins in the corona are capable of interacting with membrane receptors to influence cellular uptake and established that the corona is responsible for cellular trafficking of NMs and their eventual toxicity. To date, most research has focused upon the protein corona and overlooked the possible impacts of the metabolites included in the corona or synergistic effects between components in the complete biomolecular corona. As such, this work demonstrates methodologies to characterize both the protein and metabolite components of the biomolecular corona using bottom-up proteomics and metabolomics approaches in parallel. This includes an on-particle digest of the protein corona with a surfactant used to increase protein recovery, and a passive characterization of the metabolite corona by analyzing metabolite matrices before and after NM exposures. This work introduces capillary electrophoresis &#8211; mass spectrometry (CESI-MS) as a new technique for NM corona characterization. The protocols outlined here demonstrate how CESI-MS can be used for the reliable characterization of both the protein and metabolite corona acquired by NMs. The move to CESI-MS greatly decreases the volume of sample required (compared to traditional liquid chromatography &#8211; mass spectrometry (LC-MS) approaches) with multiple injections possible from as little as 5 &#181;L of sample, making it ideal for volume limited samples. Furthermore, the environmental consequences of analysis are reduced with respect to LC-MS due to the low flow rates (&#60;20 nL/min) in CESI-MS, and the use of aqueous electrolytes which eliminates the need for organic solvents.

Here we present a protocol to characterize the complete biomolecular corona, proteins, and metabolites, acquired by nanomaterials from biofluids using a capillary electrophoresis &#8211; mass spectrometry approach.

Kapillarelektrophorese Massenspektrometrie Ansätze zur Charakterisierung der protein- und metaboliten Korona, die von Nanomaterialien erfasst werden

The adsorption of biomolecules from surrounding biological matrices to the surface of nanomaterials (NMs) to form the corona has been of interest for the ...

Covalent Labeling with Diethylpyrocarbonate for Studying Protein Higher-Order Structure by Mass Spectrometry

Characterizing a protein&#39;s higher-order structure is essential for understanding its function. Mass spectrometry (MS) has emerged as a powerful tool for this purpose, especially for protein systems that are difficult to study by traditional methods. To study a protein&#39;s structure by MS, specific chemical reactions are performed in solution that encode a protein&#39;s structural information into its mass. One particularly effective approach is to use reagents that covalently modify solvent accessible amino acid side chains. These reactions lead to mass increases that can be localized with residue-level resolution when combined with proteolytic digestion and tandem mass spectrometry. Here, we describe the protocols associated with use of diethylpyrocarbonate (DEPC) as a covalent labeling reagent together with MS detection. DEPC is a highly electrophilic molecule capable of labeling up to 30% of the residues in the average protein, thereby providing excellent structural resolution. DEPC has been successfully used together with MS to obtain structural information for small single-domain proteins, such as &#946;2-microglobulin, to large multi-domain proteins, such as monoclonal antibodies.

The experimental procedures for performing diethylpyrocarbonate-based covalent labeling with mass spectrometric detection are described. Diethylpyrocarbonate is simply mixed with the protein or protein complex of interest, leading to the modification of solvent accessible amino acid residues. The modified residues can be identified after proteolytic digestion and liquid chromatography/mass spectrometry analysis.

Kovalente Markierung mit Diethylpyrocarbonat zur Untersuchung der Proteinstruktur höherer Ordnung durch Massenspektrometrie

Characterizing a protein&#39;s higher-order structure is essential for understanding its function. Mass spectrometry (MS) has emerged as a powerful tool ...

Capillary Electrophoresis-based Hydrogen/Deuterium Exchange for Conformational Characterization of Proteins with Top-down Mass Spectrometry

Resolving conformational heterogeneity of multiple protein states that coexist in solution remains one of the main obstacles in the characterization of protein therapeutics and the determination of the conformational transition pathways critical for biological functions, ranging from molecular recognition to enzymatic catalysis. Hydrogen/deuterium exchange (HDX) reaction coupled with top-down mass spectrometric (MS) analysis provides a means to characterize protein higher-order structures and dynamics in a conformer-specific manner. The conformational resolving power of this technique is highly dependent on the efficiencies of separating protein states at the intact protein level and minimizing the residual non-deuterated protic content during the HDX reactions. 
Here we describe a capillary electrophoresis (CE)-based variant of the HDX MS approach that aims to improve the conformational resolution. In this approach, proteins undergo HDX reactions while migrating through a deuterated background electrolyte solution (BGE) during the capillary electrophoretic separation. Different protein states or proteoforms that coexist in solution can be efficiently separated based on their differing charge-to-size ratios. The difference in electrophoretic mobility between proteins and protic solvent molecules minimizes the residual non-deuterated solvent, resulting in a nearly complete deuterating environment during the HDX process. The flow-through microvial CE-MS interface allows efficient electrospray ionization of the eluted protein species following a rapid mixing with the quenching and denaturing modifier solution at the outlet of the sprayer. The online top-down MS analysis measures the global deuteration level of the eluted intact protein species, and subsequently, the deuteration of their gas-phase fragments. This paper demonstrates this approach in differential HDX for systems, including the natural protein variants coexisting in milk.

Presented here is a protocol for a capillary electrophoresis-based hydrogen/deuterium exchange (HDX) approach coupled with top-down mass spectrometry. This approach characterizes the difference in higher-order structures between different protein species, including proteins in different states and different proteoforms, by conducting concurrent differential HDX and electrophoretic separation.

Kapillarelektrophorese-basierter Wasserstoff/Deuterium-Austausch zur Konformationscharakterisierung von Proteinen mit Top-down-Massenspektrometrie

Resolving conformational heterogeneity of multiple protein states that coexist in solution remains one of the main obstacles in the characterization of ...