Extrazelluläre Vesikel werden zunehmend als diagnostischer Biomarker und potenzielles therapeutisches Werkzeug in vielen Bereichen eingesetzt. Flow Cytometric ist die geradlinigste Analysemethode zur Charakterisierung durch anzuggerichtete Marker, bei der die Analyse eines assized Partikels verwendet werden kann, ist schnell und eignet sich für herkömmliche Seismometer, ohne dass eine spezielle Einstellung oder das dedizierte Instrument erforderlich ist. Obwohl dieses Protokoll verwendet wird, um extrazelluläre Vesikel aus diesem Zustand und Medium zu kategorisieren, kann es in Richtung Kategorisierung von Blut angekommenEn AVs erweitert werden, um invasive Gewebebiopsien bei Patienten zu ersetzen.
Für Forscher, die neu im Protokoll sind, ist es wichtig, die im Abschnitt der Einrichtungsmethode beschriebenen Schritte durchzuführen und die demonstrierten Strategien genau zu verfolgen, indem 55 Zentimeter quadratische Petri-Gerichte mit 02%porcine Hautgelatine in PBS beschichtet werden. Nach 15 Minuten die Schale und den Teller 4,4 mal 10 auf die fünfte Herzvorläuferzellen in 7 Millilitern von Iscoves modifiziertem Dulbecco-Medium oder IMDM, ergänzt mit 20% fetalem Rinderserum, und 1% Penicillin und Streptomycin für ihre Inkubation bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid, waschen. Wenn die Zellen etwa 80% Konfluenz erreichen, waschen Sie die Kulturen zweimal mit Dulbeccos PBS ohne Kalzium und Magnesium und füttern Sie die Zellen mit 10 Milletern serumfreiem Exosomen-Produktionsmedium.
Nach 7 Tagen das konditionierte Medium von jeder Platte in ein einzelnes Polypropylen-Zentrifugenrohr bündeln und das Medium zentrifugieren, um Zellablagerungen zu entfernen. Übertragen Sie den Überstand in ein 100 Kilodalton Zentrifugenfilterrohr und konzentrieren Sie das gereinigte, konditionierte Medium mit einer zusätzlichen Zentrifugation. Übertragen Sie das Konzentrat für eine abschließende Tischzentrifugierung in ein Mikrozentrifugenrohr und fügen Sie den Überstand in ein polykarbonat dickes Wand-Mikrozentrifugenrohr ein.
Füllen Sie das Rohr mit PBS, bis zu einem Endvolumen von 3,2 Milileter, und laden Sie die Probe in einen Titan festen EngelRotor. Dann den Rotor zur Ultrazentrifugation in eine Tischplatte ultrazentrifugieren und das Pellet in 100 Mikroliter frischer PBS wieder aufhängen. Zur Nanopartikelverfolgung und Analysequantifizierung 1 Mikroliter der ultrazentrifugierten Probe in 999 Mikroliter PBS verdünnen und die Probe ohne Blasen in eine 1-Milileter-Spritze laden.
Legen Sie die Spritze in den Einlassanschluss der Untersuchungskammer und schalten Sie den Laser ein. Verwenden Sie die Aufnahmetaste, um die Kamera zu öffnen und den Fokus anzupassen. Zeichnen Sie dann mindestens drei verschiedene Frames mit jeweils 60 Sekunden auf, und verwenden Sie die Batch-Prozessoption in der Software, um die drei verschiedenen Erfassungen zu analysieren.
Um die Probe für den Erwerb vorzubereiten, fügen Sie zunächst die entsprechenden experimentellen monoklonalen Antikörper konjugierten Aufnahmeperlen im Verhältnis 1:1:1 in ein Mikrozentrifugenrohr ein und wirbeln den resultierenden Erfassungsperlenpool. Als nächstes fügen Sie das entsprechende Probenvolumen zu 1 Mikroliter Fangperlenpool hinzu, um 1 mal 10 zu den 8 Partikeln plus 1,2 mal 10 bis zu den 5. Perlen pro Testkonzentration zu erzeugen. Fügen Sie 1 Mikroliter Perlen in eine Tube mit etikettierten Perlen als Negativkontrolle hinzu und passen Sie das Volumen in jedem Rohr auf 100 Mikroliter mit frischem PBS an.
Dann legen Sie die Rohre in einem Thermomischer, mit Schütteln, bei 400 Umdrehungen pro Minute und 4 bis 10 Grad Celsius, über Nacht. Am nächsten Tag, übertragen Sie die Proben auf eine runde untere 96 Brunnenplatte, und fügen Sie die entsprechenden Blütenstand konjugierte Antikörper zu jedem Brunnen. Nach einer 1 Stunde Inkubation bei 4 bis 10 Grad Celsius, fügen Sie 100 Mikroliter PBS zu jedem Brunnen hinzu, und öffnen Sie die Erfassungssoftware.
Wählen Sie Zytometer und Systemstartprogramm, um das Instrument zu starten und ein neues Experiment zu öffnen. Erstellen Sie eine experimentelle Vorlage, und wählen Sie die Platte aus, und fügen Sie die Platte hinzu. Wählen Sie die Position der Proben auf der Platte aus, und klicken Sie auch auf Set als Probe.
Geben Sie den Beispielnamen in die Namensregeln ein, öffnen Sie die Kanalregisterkarte, und wählen Sie die entsprechenden Floreszenzsignalkanäle aus. Laden Sie nun die Platte in das Instrument. Klicken Sie auf Punktdiagramm, um einen neuen Vorwärtsstreubereich im Vergleich zum Seitenstreubereich-Punktdiagramm zu erstellen.
Wählen Sie Initialisieren aus, um den Laser und die Fluidik zu starten, und klicken Sie auf Ausführen, um die Erfassung zu starten. Passen Sie die Skala an, um die Grundgesamtheit in der Mitte des vorwärts- versus seitenseitigen Streudiagramms anzuzeigen, und zeichnen Sie ein Perlentor um die gesamte Stichprobenpopulation, um die Trümmer auszuschließen. Klicken Sie auf Stopp- und Punktdiagramm, um eine Vorwärtsstreuhöhe im Vergleich zum Punktdiagramm für den vorwärts gerichteten Streubereich zu erstellen und die Stichprobe auf die Perlenpopulation zu beenden.
Zeichnen Sie ein neues Tor um die größere Population und nennen Sie es Singlets, und klicken Sie auf Punktdiagramm, um ein fluoreszierendes Signal im Vergleich zu seitenstreuenden Punktdiagrammen zu erstellen, pro experimentellem Fluorophor. Tor das neue Punkt-Plot auf den Singlets. Wählen Sie dann die Anzahl der aufzuzeichnenden Ereignisse aus, und wählen Sie Datensatz aus, um die experimentelle Erfassung zu starten.
Laden Sie am Ende der Analyse die Erfassungsdateien in die entsprechende Analysesoftware, und öffnen Sie ein neues Protokoll. Erstellen Sie Punktdiagramme für jede Datei, wie gerade gezeigt, und legen Sie die gesamte Streuachse auf einen linearen Maßstab und die gesamte Floreszenzachse für die Protokollskalierung fest. Zeigen Sie dann den floreszenz geometrischen Mittelwert in den relevanten Signalkanälen, um die volle Veränderung der mittleren Blütensflorzintensität in den verschiedenen extrazellulären Vesikelpräparaten zu berechnen.
Nach dem Testen verschiedener Bedingungen, um die kleinste Gesamtmenge an extrazellulären Vesikeln festzulegen, um die frühe exponentielle Phase einer mittleren Blütenstoffintensitätskurve zu erreichen, wurde die minimale Anzahl von Partikeln auf 1 mal 10 bis zu den 8 Partikeln pro Färbung festgelegt. Die optimale Konzentration von Antikörpern für 1 mal 10 bis zu den 8 Partikeln, um das höchste Signal ohne unspezifische Antikörperbindung zu erreichen, wurde auf 10 Mikrogramm pro Milliliter sowohl für Anti-CD9_FITC- als auch für Anti-CD63_PE-Antikörper und fünf Mikrogramm pro Milliliter für den Anti-CD81_PE-Antikörper s. Um die Eignung der Methode zu bestätigen, zur Analyse von becherförmigen extrazellulären Vesikeln und nicht membranförmigen Ablagerungen, wurden die extrazellulären Vesikel beschallt, was zu einer Abnahme der mittleren Blütensfloritätsintensität nach nur 30 Sekunden Beschallung führte, ohne dass nach einer Minute mechanischer Störung überhaupt keine Blütenstand festgestellt wurde.
X eigene Reinigung aus Herzvorläuferzellen, wie gezeigt, ergibt extrazelluläre Vesikel, die niedrige Konzentrationen von CD9 und hohe Konzentrationen von CD63 und CD81 aus beiden Zellpopulationen ausdrücken. Während x eigene Oberflächenmarker ohne Ultrazentrifugation eindeutig identifizierbar sind, erhöht dieser Anreicherungsschritt die mittlere Blütenstandintensität dieser Marker erheblich. Bei der Arbeit mit extrazellulären Vesikeln gibt es mehr sorglose Nanopartikelpellets können leicht verpasst werden.
Daher ist es wichtig, alle Schritte zu befolgen, wie im Protokoll gezeigt. Die Verwendung extrazellulärer Vesikel als Biomarker ist heute eine der neuaufstrebendsten Feldforschungen. Und bald, kann in die klinische Diagnostik als alternatives Screening-Tool verwendet übersetzt werden.
