Das Protokoll bietet eine einfache Möglichkeit, amerikanische Kakerlaken zu studieren. Ein häufiger Hygieneschädling und ein nützliches Insekt für die traditionelle chinesische Medizin. Es wird helfen, die molekularen Mechanismen mehrerer Lebensaktivitäten amerikanischer Kakerlaken zu erforschen, indem bestimmte Gene niedergeschlagen werden.
Der Hauptvorteil dieser Technologie ist, dass sie Gene in amerikanischen Kakerlaken oder anderen ähnlichen Insekten niederschlagen kann, die nicht für die Genbearbeitung geeignet sind. Diese Technologie kann verwendet werden, um verschiedene Bereiche wie die genetische und epigenetische Regulation, den Entwicklungsprozess von Geweben, die Regeneration von Anhängseln, das Paarungsverhalten und andere interessante Seiten der amerikanischen Kakerlake zu erforschen. Diese Technologie ist einfach zu bedienen und vielseitig.
Wir empfehlen, die Tiere während der DSRA-Injektionsbehandlung gesund zu halten. Ich glaube, dass Anfänger diese Technik nach mehreren Übungssitzungen leicht beherrschen können. Trennen Sie zunächst die geschlüpften Nymphen mit einem vier Millimeter großen Öffnungssieb von den Ootheken.
Wählen Sie die weiße, frisch gemälzte P.americana mit einer Glasröhre aus. Legen Sie die P.americana in neue Behälter und warten Sie auf das richtige Stadium der Behandlung. Im Reaktionssystem fügen Sie 10 Mikroliter T7 2X-Puffer, 2 Mikroliter des T7 Express-Enzymmixes und zwei Mikrogramm PCR-Produkt hinzu.
Schließlich machen Sie das Gesamtvolumen auf 20 Mikroliter mit doppelt destilliertem Wasser aus. Vorsichtig kopfüber manuell mischen und bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten inkubieren, dann 70 Grad Celsius für 10 Minuten. Verdünnen Sie 4 Mikrogramm pro Mikroliter RNase A-Lösung mit DEPC-Wasser in einem Verhältnis von 1 zu 200.
Dann fügen Sie dem System 1 Mikroliter einer Einheit pro Mikroliter RQ1 RNase Free Dnase und 1 Mikroliter verdünnte RNase A-Lösung hinzu. Bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten inkubieren. Dann fügen Sie 10% des Gesamtvolumens von Natriumacetat und drei Volumina des Gesamtvolumens von Isopropanol hinzu.
Vorsichtig auf dem Kopf stehend manuell mischen, dann fünf Minuten auf Eis legen und bei 13.000 g für 10 Minuten bei 4 Grad Celsius zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette. Als nächstes waschen Sie den Rückstand mit 75% Ethanol, mit 25% DEPC-behandeltem Wasser und zentrifugieren Sie dann bei 13.000 g für 5 Minuten bei 4 Grad Celsius.
Überstände wieder entfernen, das Pellet 15 Minuten bei Raumtemperatur an der Luft trocknen. Anschließend die doppelsträngige RNA mit etwa 100 Mikrolitern DEPC-Wasser auflösen und auf die Endkonzentration von 2 Mikrogramm pro Mikroliter verdünnen. Richten Sie das Programm in der Mikroinjektionspumpe ein, um sicherzustellen, dass das Volumen jeder Injektion konsistent ist.
Dann reinigen Sie die Spritze, indem Sie sie 8 bis 10 Mal mit DEPC-Wasser füllen. Installieren Sie die 10-Mikroliter-Spritze auf der Mikroinjektionspumpe. Starten Sie dann die Pumpe und füllen Sie die Spritze mit 10 Mikrolitern doppelsträngiger RNA-Lösung.
Anästhesieren Sie die Kakerlaken mit Kohlendioxid, nehmen Sie sie dann vorsichtig mit einer Pinzette auf und bringen Sie die Kakerlake von Hand in Richtung der Nadel. Als nächstes führen Sie die Nadel über den Spalt zwischen zwei abdominalen Somiten horizontal gegen die Epidermis ein. Injizieren Sie die doppelsträngige RNA-Lösung in die Kakerlake und stellen Sie sicher, dass die Nadelspitze so nah wie möglich an der Epidermis ist, um eine Schädigung der inneren Organe zu vermeiden.
Zum Schluss die Nadelspitze herausziehen. Geben Sie die injizierten Kakerlaken in saubere Bioassay-Behälter. Warten Sie etwa 10 bis 20 Minuten, damit sie sich von den Auswirkungen von Kohlendioxid erholen können.
Beschriften Sie die Behälter mit dem Injektionsdatum, der Art und der Dosis der doppelsträngigen RNA und dem Alter der P.americana. Ddc- oder DOPA-Decarboxylase- und Dpp- oder decapentaplegische Gene wurden als zwei Beispiele ausgewählt, um den Phänotyp der gemälzten Kakerlaken nach doppelsträngiger RNA-Injektion zu beobachten, und dsMocK, das kein Ziel bei den Tieren hat, wurde als Negativkontrolle genommen. Die RNAi-Effizienz wurde mittels qRT PCR nachgewiesen.
Die Gene wurden signifikant mit einem P-Wert von weniger als 0,01 für dsDdc und weniger als 0,05 für dsDpp niedergeschlagen. P.americana mit Knockdown-DDC-Genen hatte die weiße Epidermis aufgrund einer blockierten Melanisation. Im Experiment mit dsDpp-Injektionen störte die RNAi die Regeneration der Gliedmaßen.
Die Insekten sollten gesund sein und ohne Schaden injiziert werden. Diese Technologie bietet eine einfache Möglichkeit, Genfunktionen für Insekten zu erforschen, die nicht geneditiert werden können, wie z.B. amerikanische Kakerlaken.
