Dies ist ein Videoprotokoll für elektroporationsvermittelte RNA-Interferenzmethode in Odonata. Libellen und Damselflies, Mitglieder des Ordens Odonata, gehören zu den angestammtesten Insekten. Adult Odonata zeigen eine bemerkenswerte Vielfalt in Körperfarben und -mustern, und viele ökologische und Verhaltensstudien wurden durchgeführt.
Molekulargenetische Studien an Odonata fehlten jedoch, da die genfunktionelle Analyse sehr schwierig ist. Beispielsweise ist die herkömmliche RNAi-Methode bei Odonata-Arten nicht wirksam. Kürzlich haben wir eine RNM-Methode in Kombination mit In-vivo-Elektroporation eingeführt.
Hier stellen wir ein Videoprotokoll für die elektroporationsvermittelten RNAi sowohl bei Libellen als auch bei Damselflies zur Verfügung. Als unsere repräsentativen Damselflies-Arten verwenden wir den Blauschwanz-Damm selbst. Ischnura senegalensis.
Dies ist eine der häufigsten damselfly Arten und oft in sonnigen Teichen in Japan gefunden. Zuerst zeigen wir das RNAi-Protokoll, das auf den Bauch eines verdammten Ischnura senegalensis abzielt. Nach eiskalter Anästhesie an diesem beiden Stifte auf beiden Seiten des Prothorax und fixieren Sie die Larve auf einen festen Stand.
Ziehen und dehnen Sie die segmentübergreifende Membran zwischen dem siebten und achten Bauchsegment mit Zangen. Halten Sie die segmentübergreifende Membran von Hand gestreckt. Setzen Sie die Spitze der vorbereiteten Kapillare in die gestreckte intersegmentale Membran ein.
Injizieren Sie 1 Mikroliter siRNA- oder dsRNA-Lösung. Tragen Sie zwei Tröpfchen Ultraschallgel mit Zangen auf die Larvenoberfläche auf. Legen Sie Elektroden auf das Ultraschallgel, mit der positiven Elektrode auf der Seite der Injektion.
Generieren Sie 10-fache Elektroporationsimpulse mit einem Elektroporator. Das restliche Gel auf der Oberfläche mit einem Papiertuch abwischen. Entfernen Sie Insektenstifte und halten Sie die behandelten Larven für etwa einen Tag auf einem nassen Papiertuch, um sich zu erholen.
Als nächstes zeigen wir das RNAi-Protokoll, das auf den Thorax einer verdammten Ischnura senegalensis abzielt. Nach eiskalter Anästhesie zwei Stifte auf beiden Seiten des Prothorax befestigen und die Larve an einem festen Ständer fixieren. Ziehen und dehnen Sie die intersegmentale Membran zwischen Prothorax und Synthorax mit der Hand.
Setzen Sie die Spitze der vorbereiteten Kapillare in die gestreckte intersegmentale Membran ein. Injizieren Sie einen Mikroliter siRNA- oder dsRNA-Lösung. Tragen Sie zwei Tröpfchen Ultraschallgel mit Zangen auf die Oberfläche der Larve auf.
Legen Sie Elektroden auf das Ultraschallgel, mit einer positiven Elektrode auf der Seite der Injektion. Generieren Sie 10-fache Elektroporationsimpulse mit einem Elektroprolator. Das restliche Gel auf der Oberfläche mit einem Papiertuch abwischen.
Entfernen Sie Insektenstifte und halten Sie die behandelten Larven für etwa einen Tag auf einem nassen Papiertuch, um sich zu erholen. Als repräsentative Libellenart verwenden wir die Pied Skimmer Libelle. Pseudothemis zonata.
Dies ist eine der häufigsten Libellenarten und häufig in schattigen Teichen in Japan gefunden. Schließlich zeigen wir das RNI-Protokoll, das auf den Bauch einer Libelle, Pseudothemis zonata, abzielt. Dehnen Sie die intersegmentale Membran zwischen dem vierten und fünften Bauchsegment.
Machen Sie ein kleines Loch mit einer feinen Nadel zwischen dem vierten und fünften Bauchsegment. Setzen Sie die Spitze der vorbereiteten Kapillare in das vorbereitete Loch ein. Injizieren Sie einen Mikroliter siRNA- oder dsRNA-Lösung.
Befestigen Sie die Larve mit Stiften an einem festen Ständer. Tragen Sie zwei Tröpfchen Ultraschallgel mit Zangen auf die Larvenoberfläche auf. Legen Sie Elektroden auf das Ultraschallgel mit der positiven Elektrode auf der Seite der Injektion.
Generieren Sie 10-fache Elektroporationsimpulse mit einem Elektroporator. Das restliche Gel auf der Oberfläche mit einem Papiertuch abwischen. Entfernen Sie Insektenstifte und halten Sie die behandelten Larven für etwa einen Tag auf einem nassen Papiertuch, um sich zu erholen.
Hier wählten wir ein Melanin-Synthesegen MCO2 als Zielgen und EGFP oder bla als negatives Kontrollziel. MCO2 ist wichtig für die schwarze Farbbildung bei verschiedenen Insekten. Zuerst zeigen wir die Ergebnisse im Bauch von Ischnura senegalensis.
Weiße Pfeilspitzen zeigen die Bereiche der unterdrückten schwarzen Pigmentierung an, in denen die positive Elektrode auf elektroporation gelegt wurde. Die Inkubation der Pigmentierung wurde sowohl durch siRNA-Behandlung als auch durch dsRNA-Behandlung beobachtet. Größe und Lage des RNI-Phänotyps variierten erheblich bei den Individuen.
Ohne Elektroporation wurden keine RNI-Phänotypen beobachtet, was darauf hindeutet, dass Elektroporation für RNI bei dieser Art unerlässlich ist. Als nächstes zeigen wir die Ergebnisse im Thorax von Ischnura senegalensis. In ähnlicher Weise wurde eine Hemmung der schwarzen Pigmentierung in der Region beobachtet, in der die positive Elektrode auf die Elektroporation gelegt wurde.
Schließlich zeigen wir die Ergebnisse im Bauch von Pseudothemis zonata. Wie erwartet wurde der RNI-Phänotyp in der Region nachgewiesen, in der die positive Elektrode auf elektroporation gelegt wurde. Wir bestätigen, dass die elektroprorationsvermittelte RNAi-Methode in Odonata sehr nützlich ist.
Es kann lokale Genunterdrückung fast 100% Effizienz induzieren. Zumindest in epidermis, wenn wir geeignete Entwicklungsstadien auswählen. Diese Methode hat mehrere über die CRISPR/Cas9-Methode.
Beispielsweise kann der Bereich, in dem die RNAi-Phänotypen auftreten, durch die Position der positiven Elektrode bei der Elektrisierung gesteuert werden, und die RNA-Phänotypen können leicht mit den Kontrollphänotypen nebeneinander im selben Individuum verglichen werden. Darüber hinaus erfordert diese Methode keine Mikroinjektion in winzige Eier. So ist es viel einfacher und schneller, den Phänotyp schneller zu beobachten als die CRISPR/Cas9-Methode.
Darüber hinaus kann diese Methode auf Insekten angewendet werden, deren neu gelegte Eier schwer zu sammeln sind. Zum Beispiel legen Weibchen von Pseudothemis zonata Eier während des Fluges. So ist es sehr schwierig, ihre neu gelegten Eier zu sammeln.
Wir gehen davon aus, dass dieses Protokoll allgemein auf Nicht-Modellorganismen anwendbar sein kann, wenn das herkömmliche RNI nicht effizient funktioniert.
