Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Stoffwechselbereich zu beantworten, wie, wie metabolische Aktivität während des Alterungsprozesses verändert wird. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Verwendung eines intakten Körpersegments, das Daten enthält, die dem natürlichen und physiologischen Zustand im Vergleich zur klassischen mitochondrialen Isolation sehr ähnlich sind. Demonstrieren das Verfahren werden Anuroop und Annika, eine Grad-Studentin in meinem Labor.
Um das Protokoll zu beginnen, schalten Sie die Maschine eine Stunde vor Beginn des Experiments ein, damit genügend Zeit bleibt, um die gewünschte Temperatur zu erreichen und stabil zu bleiben. Wählen Sie dann im Software-Setup im Administrationsmodus die Länge der Patronenkalibrierung und die gewünschte Temperatur aus. Geben Sie dann das folgende Protokoll ein:Je nach versuchsweisem Entwurf fügen Sie nach einem ausgewählten Messschritt Injektionsschritte von den Ports A nach D hinzu.
Um die Qualität und die Bestimmung des Basal-OCR zu überprüfen, stellen Sie das Protokoll für mindestens drei Messzyklen ein, bevor Sie die Injektion des ersten Medikaments über Port A. vorkalibrieren. Bedecken Sie die Patrone mit Parafilm, wenn sie für mehr als 24 Stunden hydratisiert werden soll, um Verdunstung zu verhindern. Lagern Sie die Patrone bei 37 Grad Celsius ohne CO2, über Nacht.
Als nächstes stellen Sie sicher, dass die experimentellen Medikamente gründlich in frischem Medium gelöst werden, plus 2,5% Glukose. Messen und passen Sie den pH-Wert der Arzneimittellösung bei der gewünschten Temperatur auf den pH-Wert des Fahrzeugs an. Pipette die Medikament Lösung in es ist Injektionshafen zugeordnet.
Dann laden Sie die Patrone in die Maschine und beginnen Sie mit der Kalibrierung. Frisch zubereitete Medien plus 2,5% Glukose mit einem normalen HCl auf den gewünschten pH-Wert einstellen. Als nächstes bereiten Sie eine Eiskiste vor und legen Sie eine Metallplatte auf das Eis.
Öffnen Sie das Ösenplattenpaket. Tauchen Sie die Netze in Medien um 16 Millimeter Petrischale. Sammeln Sie ein Netz mit dem Inserter und lassen Sie den Inserter neben dem Mikroskop aufstehen.
Fügen Sie dem Netz, das an den Einfügeer angeschlossen ist, einen kleinen Tropfen Medien hinzu. Dann befeuchten Sie die Fliegen, indem Sie sie auf eine eiskalte Metallplatte legen. Mit Zangen, greifen Sie den Bauch einer Fliege und tauchen Sie sie in die Medien in eine Petrischale unter dem Mikroskop.
Entfernen Sie mit einem zweiten Zangenpaar vorsichtig den Kopf der Fliege. Platzieren Sie den Kopf in der Mitte des Netzes, das am Inserter befestigt ist, und überprüfen Sie, ob der Kopf in Medien eingetaucht ist. Entfernen Sie überflüssige Flüssigkeit, bevor Sie die Köpfe zentrieren, um Köpfe zu verlieren, während Sie sie in den Brunnen legen.
Wenn es 16 Köpfe im Netz gibt, zentrieren Sie sie. Platzieren Sie das Netz mit dem Inserter in den Brunnen. Stellen Sie sicher, dass die Köpfe unter dem Netz gefangen sind und fügen Sie langsam 700 Mikroliter Medien plus 2,5% Glukose hinzu.
Stellen Sie sicher, dass die leeren Brunnen, die für den Hintergrund verwendet werden, auch ein Netz mit 700 Mikroliter n des Puffers plus 2,5% Glukose enthalten. Überprüfen Sie die Brunnen auf Luftblasen unter den Netzen über das Mikroskop. Pipette sanft nach oben und unten mit einer ein Millimeter Pipette, um alle Blasen zu entfernen.
Halten Sie die Köpfe zentriert für eine zuverlässige OCR-Lesung. Fügen Sie dann die Platte zur Maschine hinzu und starten Sie die Messung. Entfernen Sie am Ende des Protokolls die Patrone.
Bestätigen Sie visuell, dass sich keine sichtbaren Reste in den Portfüllungen befinden. Als nächstes entsorgen Sie die Patrone und die Platte, wenn die Köpfe nicht für die Proteinextraktion verwendet werden sollen. Denken Sie daran, den Sauerstoff- und den pH-Wert zu betrachten, um vor der Analyse ungewöhnliche Brunnen zu erkennen.
Darüber hinaus ist es wichtig, die geeignete Berechnung des Sauerstoffverbrauchs zu wählen, basierend auf dem Sauerstoffgehalt. Bei der Durchführung des Protokolls wurde beobachtet, dass der Sauerstoffgehalt der Midlife Heads schneller abfiel als junge Fliegenköpfe. Wenn der Bereich des Sauerstoffgehalts zwischen den Bedingungen ähnlich ist, ist es besser, den AKOS-Algorithmus zu verwenden, um automatisch die Sauerstoffverbrauchsrate zu erzeugen, oder OCR, die die Sauerstoffgehaltsänderungen während einer Messung zwischen jungen und Midlife Heads zuverlässig widerspiegelt.
Die Zugabe von Natriumbutyrat, oder SB, einem KDAC-Hemmer, verändert vorübergehend die Dynamik des Sauerstoffgehalts. Während die Fahrzeugsteuerungen während der ersten und letzten Zecken einen konstanten Sauerstoffgehalt aufweisen, verursacht die SB-Zugabe einen erheblichen und vorübergehenden Rückgang des Sauerstoffgehalts in diesen Zecken. Da die AKOS-Berechnung alle Ticks berücksichtigt und einen anoxischen Zustand ignoriert, erzeugt sie eine irreführende OCR, wie sie in den nicht-normalisierten AKOS-basierten OCR-Werten beobachtet wird, die bei der Injektion von Port A wenig Veränderung zeigen.
Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, mit zwei Personen zusammen zu arbeiten, um eine relativ kurze Zeit zu gewährleisten, um eine einzelne Platte vorzubereiten. Nach diesem Verfahren können andere biochemische Methoden, wie Western Blot und Massenspektrometrie durchgeführt werden, um Fragen im Zusammenhang mit molekularen Mechanismen zu beantworten, zum Beispiel, die metabolische Veränderungen mäßigen.
