Das Wachstum pflanzlicher Zellen wird durch die mechanischen Eigenschaften ihrer Zellwände gesteuert. Daher ist es wichtig, diese Eigenschaften in verschiedenen Organen und Geweben der Pflanzen zu kennen. Die hier vorgestellte Methode ermöglicht die biomechanische Charakterisierung von nicht fixierten und nicht dehydrierten Zellwänden im inneren Gewebe junger Pflanzen.
Beginnen Sie mit der Vorbereitung der Lösungen und der Probe für die Vibratomschnitte. Gießen Sie eine vier Millimeter dicke Schicht geschmolzener 3%Agarose auf den Boden der Petrischale und lassen Sie sie leicht abkühlen, um thermische Schäden an der Probe zu vermeiden. Legen Sie etwa fünf Millimeter lange drei oder vier Stücke des Pflanzenorgans horizontal auf die Agarose.
Etwa 30 bis 60 Sekunden später erscheint ein dünner halbfester Film auf der ersten Agaroseschicht. Dann gießen Sie vorsichtig eine zweite Schicht darüber. Nachdem die Agarose vollständig erstarrt ist, schneiden Sie den Block mit der Probe aus.
Formen Sie den Block zu einer sechseckigen Pyramidenstumpfpyramide, um seine Stabilität während des weiteren Schneidens zu gewährleisten. Bevor Sie mit dem Probenschnitt mit dem Vibratom beginnen, kleben Sie den Block mit Cyanacrylatkleber auf die Vibratomstufe. Stellen Sie die Bühne in das Vibratom, so dass eine der Pyramidenecken der Klinge des Vibratoms zugewandt ist, und gießen Sie Wasser in das Vibratombad.
Stellen Sie die Schnittparameter wie Profildicke, Schaufelgeschwindigkeit und Vibrationsfrequenz ein und schneiden Sie die Probe. Bewegen Sie den Abschnitt mit einer feinen Bürste aus dem Wasserbad auf einen Glasobjektträger und legen Sie einen Tropfen Wasser auf den Abschnitt, um ein Austrocknen zu verhindern. Nachdem Sie die Qualität des Schnitts unter einem Lichtmikroskop überprüft haben, wählen Sie den richtigen Abschnitt mit einer Zellwand senkrecht zur Schnittebene.
Dann immobilisieren Sie den Abschnitt für Rasterkraftmikroskopie-Messungen, indem Sie eine Schicht von einem Milliliter 1% geschmolzener Agarose mit einer Pipette auf den Boden der Petrischalenkappe gießen. Nachdem die Agarose erstarrt ist, entfernen Sie überschüssiges Wasser aus dem Abschnitt, indem Sie Filterpapier an den Rand bringen. Übertragen Sie den Abschnitt vom Objektträger vorsichtig mit einem Pinsel in die Mitte der Petrischalenkappe.
Dann geben Sie vorsichtig 1% Agarose mit einer 20-Mikroliter-Pipette um den Abschnitt und gießen Sie das Wasser oder eine andere Lösung für die Rasterkraftmikroskopie in die Petrischale mit dem immobilisierten Abschnitt. Führen Sie die Probe unter dem Rasterkraftmikroskop mit dem Lichtmikroskop. Klicken Sie auf die Schaltfläche Anflug und dann auf die Schaltfläche Lande, um sich der Probe im Kontaktmodus mit einem Sollwert von einem Nanoampere zu nähern.
Klicken Sie auf die Schaltfläche Scannen und dann auf die Schaltfläche Bereich. Wählen Sie die Bereichsgröße von 50 Mikrometern mal 50 Mikrometern zum Scannen aus. Klicken Sie auf die Schaltfläche Move Probe und überprüfen Sie den gesamten Scanbereich, indem Sie den Scanner darüber bewegen und den höchsten Punkt basierend auf dem Grad des Scannervorsprungs finden.
Öffnen Sie die Registerkarte Ansatz. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche Entfernen, um das Beispiel zurückzuziehen. Wenn Sie den höchsten Punkt als Ziel verwenden, klicken Sie auf die Schaltfläche Landing, um sich der Probe erneut zu nähern.
Überprüfen Sie dann die Oberfläche erneut, indem Sie auf die Schaltfläche Move Probe klicken und den Scanner darüber bewegen. Stellen Sie die Scanrate auf 0,5 Hertz, die Scangröße auf 50 Mikrometer x 50 Mikrometer und den Scanpunkt auf 64 x 64 ein. Klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen und scannen Sie, um die Oberfläche der Probe und ihre mögliche Kontamination mit Agarose zu überprüfen.
Nachdem Sie auf die Schaltfläche Ein geklickt haben, wählen Sie den HDPlus-Modus im Dropdown-Menü im Hauptfenster des Programms und stellen Sie den Sollwert im Hauptprogrammfenster auf 0,1 Nanoampere ein. Stellen Sie auf der Hauptregisterkarte des HD-Fensters die Scanparameter entsprechend der untersuchten Probe ein. Öffnen Sie dann die Registerkarte Geräusche im HD-Fenster und geben Sie die Resonanzfrequenz des Auslegers ein.
Öffnen Sie die Registerkarte Quant des HD-Fensters und geben Sie IOS, Cantilever-Steifigkeit, Spitzenradius und Winkel ein. Wählen Sie das Kontaktmodell aus, das für Berechnungen in Abhängigkeit von der Spitzengeometrie verwendet wird. Öffnen Sie anschließend die Registerkarte Scan des HD-Fensters und wählen Sie die Signale sowie die Richtung aus, in der das Signal aufgezeichnet wird.
Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Kraftlautstärke, um eine Aufzeichnung aller Kraftkurven zu erhalten, und klicken Sie auf die Schaltfläche Aus oben im Hauptprogrammfenster, um die Rückkopplungsschleife einzuschalten. Klicken Sie auf die Schaltfläche Phase Core im HD-Hauptfenster, um die Empfindlichkeit des optischen Systems zu korrigieren. Auf der Registerkarte "Versus Time" des HD-Hauptfensters wird die Funktion des DFL-Signals "Versus Time" in Echtzeit angezeigt. Wählen Sie die Teile dieser Funktion aus, die für die Ermittlung der Basisebene verwendet werden und das Kontaktmodell für weitere Berechnungen anpassen sollen.
Stellen Sie nun den Scanpunktwert im Hauptfenster des Programms auf 256 x 256 ein. Stellen Sie dann die Scanrate auf 0,2 Hertz ein und klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen, um die Probe zu scannen. Nachdem der Scanvorgang beendet ist, klicken Sie auf die Schaltfläche Ein oben im Hauptfenster, um die Rückkopplungsschleife auszuschalten.
Wählen Sie im Dropdown-Menü Kontaktmodus, öffnen Sie die Registerkarte Ansatz und klicken Sie auf die Schaltfläche Entfernen, um das Beispiel zurückzuziehen. Klicken Sie auf die Schaltfläche Daten, um die Analysesoftware zu öffnen und die Ausgabe zu speichern. Öffnen Sie die gespeicherte Datei in der Analysesoftware.
Wählen Sie den HD-Force-Lautstärkerahmen aus. Halten Sie die Strg-Taste gedrückt und wählen Sie einen visuellen Rahmen aus, der in derselben Scanrichtung angezeigt wird. Klicken Sie auf die Schaltfläche Externe Karte laden, um zu sehen, wo sich die Zellwände befinden.
Überprüfen Sie die Werte für InvOptSens- und Cantilever-Steifigkeit in der Hauptregisterkarte. Öffnen Sie die Registerkarte Erweitert und überprüfen Sie die Tippparameter und das Kontaktmodell. Klicken Sie auf verschiedene Punkte an den Zellwänden des visuellen Rahmens und wählen Sie nur die Kurven aus, die vom Modell gut beschrieben werden.
Die weißen Bereiche in der Modulkarte entsprechen einer fehlerhaften Überschätzung des Elastizitätsmoduls, da der Scanner seine Grenze in Z-Richtung erreicht. Dieses Bild eignet sich nicht als externe Karte für eine weitere Auswahl zufriedenstellender Kraftkurven. Hier ist jedoch die rechts dargestellte DFL-Signalkarte besser geeignet.
Verschiedene Instrumente können DFL-Signale als Durchbiegungs- oder Fehlersignale bezeichnen. Der Scanner, der beim Versuch, den Boden der Probe zu erreichen, vollständig ausgefahren wurde, kann zu fehlerhaften Messungen und sogar zu unterbrochenen Scans führen. Das Vorhandensein von Agarose kann während des ersten Scans im Kontaktmodus überprüft werden, da die Zellwände und einige Zellböden auf solchen Scans sichtbar sind.
Im Falle einer ungenauen Immobilisierung kann die Oberfläche jedoch mit Agarose bedeckt sein, die die Probentopographie maskiert. Von vier verschiedenen Kraftkurven, die an verschiedenen Punkten derselben Zellwand aufgezeichnet wurden, zeigt die bei 0,1 aufgezeichnete Kurve keine Basislinie, d.h. keine Trennung der Cantileverspitze von der Zellwand. Die bei 0,3 aufgezeichnete Kurve zeigt eine Schulter auf dem sich nähernden Teil, die eine Biegung der Zellwand anzeigt.
Die Punkte zwei und vier zeigen zufriedenstellende Kraftkurven mit ähnlichen Modulwerten. Probenvorbereitung und -untersuchung erfordern Übung, können aber gemeistert werden. Ein entscheidender Teil dieses Protokolls ist das Filtern der resultierenden Kurven.
Verlassen Sie sich nicht auf Moduli, die automatisch berechnet wurden. Die gleiche Technik kann verwendet werden, um die Adhäsionskräfte oder die Energiedissipation zu messen. Es kann auch wichtig für die Beschreibung des viskosen oder viskoelastischen Verhaltens einiger Materialien sein.
