Diese Methode hilft zu verstehen, wie sich die Sekretionsraten mit der Zeit ändern und wie Zellen auf zeitlich variierende feste Signale reagieren. Die Hauptvorteile dieser Technik sind, dass ihre niedrigen Kosten wenig Training erfordern und der Aufbau des Füllsystems für neuartige Experimente angepasst werden kann. Füllen Sie zunächst eine Spritze mit einer Hintergrundlösung und laden Sie sie in die erste Spritzenpumpe.
Füllen Sie eine andere Spritze mit Tracerlösung und laden Sie sie in die zweite Spritzenpumpe. Verbinden Sie beide Spritzen über Luer-Steckverbinder mit zwei der drei Anschlüsse eines Vier-Wege-Absperrhahns. Schließen Sie den Absperrhahn an die Hintergrundlösung und pumpen Sie die Tracerlösung in den Absperrhahn, bis sie aus dem offenen Anschluss tropft.
Stoppen Sie die Pumpe und stellen Sie die Spritze nicht weiter ein. Stellen Sie sicher, dass die bewegliche Stange der Spritzenpumpen gegen die Spritzenkolben gedrückt wird, so dass der Durchfluss sofort beginnt, wenn die Pumpe gestartet wird. Schließen Sie den Absperrhahn mit der Tracerlösung und pumpen Sie die Hintergrundlösung in den Absperrhahn, bis alle verbleibenden Tracerlösungen aus dem offenen Port gespült wurden.
Stoppen Sie die Pumpe und stellen Sie die Spritze nicht weiter ein. Richten Sie die für die FTE-Analyse gewünschte Strömungssystemkomponente ein. Setzen Sie das Ende in einen Pipettenspitzenspender ein und pumpen Sie die Hintergrundlösung durch das Bauteil, bis es vollständig gefüllt ist.
Stellen Sie die Pumpe für die Tracerlösung auf den gewünschten Durchfluss ein. Schließen Sie den Absperrhahn zur Hintergrundlösung und starten Sie den Fluss der Tracerlösung. Starten Sie gleichzeitig den Fraktionssammler.
Setzen Sie den Fluss der Tracerlösung für kurze Zeit fort, um sich einem Impulseintrag des Tracers anzunähern. Eine Pulsdauer von 10 Minuten wird für RTDs mit einer Durchflussrate von einem Milliliter pro Stunde empfohlen. Stoppen Sie die Tracerlösungspumpe am Ende der Impulsperiode der Tracerlösung.
Schließen Sie den Absperrhahn schnell mit der Tracerlösung und starten Sie den Fluss der Hintergrundlösung mit der gleichen Durchflussrate. Lassen Sie die Hintergrundlösung fließen und Bruchteile sammeln, bis der gesamte Tracer das System und die gesammelten Fraktionen passiert hat. Unter sterilen Bedingungen die Stopfen mit Nadeln in die Well-Plate-Kulturen einführen, wobei die Nadeln hochgezogen werden.
Nachdem der Stopfen an Ort und Stelle ist, senken Sie die Nadeln für die Perfusion auf die gewünschte Höhe ab, da die Höhe der Auslassnadel den stabilen Flüssigkeitsstand bestimmt. Verschließen Sie die Nadeln mit männlichen Luer-Kappen und halten Sie die gesamte Wellplate in einem Inkubator-Set bei 37 Grad Celsius bis zum Gebrauch. Bereiten Sie die beiden Medien für die Perfusion vor und kennzeichnen Sie das Medium, das zuerst abgegeben wird, als eines und das andere Medium als zwei.
Damit jede Kultur durchblutet werden soll, füllen Sie eine Spritze mit mittlerer einer, um die gesamte Dauer ihrer Entsaftung plus genug Volumen zu halten, um das Perfusionssystem zunächst zu füllen. Füllen Sie eine zweite Spritze mit mittleren zwei, um die gesamte Dauer ihrer Entleerung zu dauern. Schließen Sie beide Spritzen an zwei der drei Anschlüsse eines Vier-Wege-Absperrhahns an.
Eine Länge des Schlauches, um die Spritzen mit den Absperrhähnen zu verbinden, kann erforderlich sein. Bereiten Sie die Absperrhähne vor, indem Sie den Absperrhahn für Medium eins schließen und Medium Two in den Absperrhahn dosieren, bis er gerade beginnt, den offenen Port herauszutropfen. Schließen Sie dann den Absperrhahn für Medium zwei und geben Sie Medium eins in den Absperrhahn ab, bis alle verbleibenden mittleren zwei aus dem offenen Port gespült wurden.
Befestigen Sie den vorgeschalteten Schlauch mit einem Buchsen-zu-Widerhaken-Luer-Anschluss am offenen Absperrhahn. Stecken Sie einen Stecker-zu-Widerhaken-Luer-Stecker am anderen Ende des Rohrs. Geben Sie das Medium eins aus der Spritze ab, bis das vorgeschaltete Rohr mit Medium gefüllt ist, und fahren Sie mit der Vorbereitung der nachgeschalteten Schläuche fort, wie zuvor gezeigt.
Stecken Sie einen Stecker-zu-Widerhaken-Luer-Steckverbinder in ein Ende des nachgeschalteten Schlauchs und verschließen Sie ihn mit einer weiblichen Luer-Kappe. Bringen Sie vorsichtig alle vorbereiteten Schläuche, Spritzen und die Wellplatte zum Inkubator, der für die Perfusion verwendet wird. Stellen Sie die Spritzenpumpe und den Fraktionssammler an den gewünschten Stellen in der Nähe des Inkubators auf.
Stellen Sie die Spritzenpumpe auf oder in der Nähe des Inkubators auf und platzieren Sie den Fraktionssammler neben dem Inkubator in der Nähe des Anschlusses. Laden Sie die Spritzen in die Pumpe. Bündeln Sie die verkappten Enden aller vor- und nachgeschalteten Rohre und schieben Sie sie von der Außenseite des Inkubators nach innen durch den Anschluss.
Setzen Sie die offenen Enden der nachgeschalteten Rohre in die Dosierpipettenspitzen des Mehrkopfspenders des Fraktionssammlers ein. Ziehen Sie im Inkubator so viel Durchhang wie möglich der vorgeschalteten Rohre in den Inkubator, um die Länge der Schläuche zu maximieren, durch die das strömende Medium Wärme und Kohlendioxid aufnehmen kann. Lösen Sie für jeden verstopften Brunnen schnell die Nadeln und die vor- und nachgeschalteten Rohre für diesen Brunnen und befestigen Sie sie dann zusammen mit ihren Luer-Steckverbindern.
Sobald alle Teile angeschlossen sind, lassen Sie die Spritzenpumpe kurz mit einer relativ hohen Geschwindigkeit laufen, um sicherzustellen, dass alle Ströme ordnungsgemäß fließen. An diesem Punkt, wenn es gewünscht ist, das Experiment mit den nachgeschalteten Rohren voller Medium zu beginnen, fahren Sie mit der Pumpe fort, bis alle gefüllt sind, andernfalls stoppen Sie die Pumpe. Stellen Sie den Durchfluss der Spritzenpumpe für Medium eins und die Häufigkeit der Fraktionssammlung ein und starten Sie beide Maschinen gleichzeitig, um das Experiment zu beginnen.
Wenn die mittlere Quelle gewechselt werden muss, stoppen Sie schnell die Spritzenpumpe für eine mittlere Quelle. Drehen Sie den geschlossenen Absperrhahn auf mittel eins und starten Sie die Spritzenpumpe für mittlere zwei. Falls gewünscht, schalten Sie die Quelle später ähnlich wieder auf mittlere um.
Sammeln Sie Brüche für die gewünschte Testdauer. Die Tracerkonzentrationen in den Fraktionen aus zwei RTD-Experimenten wurden gemessen und aus dem MATLAB-Skript der Daten in die RTD eingegeben, um die beiden RTDs zu erzeugen. Einzelne Rohre und mehrere Rohrstücke in Reihe passen gut zu einem einzigen axialen Dispersionsmodell, und das Hinzufügen einer perfundierten 48-Well-Platte in der Linie verursachte eine vernachlässigbare Abweichung, so dass sowohl der Ein-Meter-Rohr-RTD als auch der RTD des gesamten Systems durch axiale Dispersionsfunktionen passen konnten.
Ein Beispiel für eine schlechte Modellanpassung wurde anhand des axialen Dispersionsmodells demonstriert, das an die RTD-Daten des Ein-Meter-Rohrs angepasst war, und wurde zusammen mit den Daten dargestellt. Die anfänglichen Parametervermutungen wurden geändert, um eine gute Modellanpassung zu erhalten, bei der Tau ungefähr gleich dem Volumen des Perfusionssystems dividiert durch seinen Volumenstrom war. Ein 90-Minuten-Impuls von TNF-alpha wurde als Eingangssignal an das System definiert und mit dem Ein-Meter-Rohr RTD verwickelt, um das TNF-alpha-Signal am Einlass der Bohrlochplatte zu bestimmen.
Das Eingangssignal wurde auch mit dem RTD des gesamten Systems konvolviert, um das TNF-alpha-Signal am Ausgang des Systems in den gesammelten Fraktionen zu bestimmen. HEK 293-Zellen wurden entwickelt, um GLuc zu sezernieren, das von einem Promotor angetrieben wird, der das NF-kappaB-Antwortelement enthält. Das Experiment zeigte eine signifikante Expressionssteigerung und eine langsame Abnahme der GLuc-Expression, die durch NF-kappaB nach TNF-alpha-Exposition angetrieben wurde.
Variationen des Systems werden in Begleitpapieren beschrieben, einschließlich eines einfacheren Aufbaus für Experimente, die keine Signaleingaben erfordern, und die Exposition von Zellen gegenüber pharma-hu-verbindenden gelösten Stoffprofilen.
