Unsere Methoden schaffen ein zuverlässiges hypoxisches hepatozelluläres Karzinommodell für die nichtinvasive Bildgebung von Tumorhypoxie, um die HCC-Biologie in vivo zu untersuchen, die die Krebsentwicklung beim Menschen besser rekapitulieren kann. Unser zuverlässiges HCC-Modell dient zusammen mit einer hochproduzierbaren Bildgebungsmethode als wichtige Plattform für die translationale Erforschung der Pathophysiologie des humanen HCC. Die Echtzeitüberwachung der Tumorhypoxie bietet Einblicke in molekulare Veränderungen, die zur Aggressivität des Tumors führen, und ermöglicht die Bestimmung von Hypoxiebereichen und die Vorhersage des Ansprechens auf die Behandlung.
Obwohl die intraabdominale Chirurgie technisch anspruchsvoll sein kann, wird eine angemessene Planung und Tierpflege die allgemeine Erfolgsrate der Operation und das Wohlbefinden von Kleintieren verbessern. Sterilisieren Sie zunächst die dorsale Region einer anästhesierten 6 bis 8 Wochen alten Maus entweder auf der linken oder rechten Seite der unteren Flanke mit 70% Ethanol. Heben Sie dann mit einer Pinzette die Haut an und führen Sie die Injektionsnadel vorsichtig darunter ein.
Um ein versehentliches Auslaufen der injizierten Zellsuspension während des Nadelentzugs zu vermeiden, schieben Sie die Nadel 4 bis 5 Millimeter von der Einstichstelle entlang der subkutanen Ebene vor. Entladen Sie nach dem Loslassen der Pinzette vorsichtig den Inhalt der Spritze, ohne die gegenüberliegende Seite zu durchdringen. Machen Sie nach dem Einschläfern der subkutanen tumortragenden Maus mit einer Skalpellklinge einen Einschnitt in die Haut der Tumorstelle.
Entfernen Sie dann den Tumorblock und übertragen Sie ihn sofort in das Nährmedium. Als nächstes schneiden Sie den Tumorblock mit einer scharfen chirurgischen Schere in kleine 1-Kubikmillimeter-Würfel und vermeiden Sie den Kernbereich des Tumorblocks. Bewahren Sie alle Würfel in Nährmedien auf.
Verlängern Sie für die orthotope Leberimplantation die Gliedmaßen einer anästhesierten Maus und sichern Sie sie mit Klebeband, um den ventralen Bauch und den Thorax maximal freizulegen. Sterilisieren Sie dann die gesamte Bauchhaut mit 10% Povidon-Jod-Lösung, gefolgt von 70% Ethanol. Führen Sie als Nächstes eine Laparotomie durch, indem Sie zuerst mit einer scharfen Schere einen Mittellinienschnitt von 10 Millimetern machen, um Zugang zum Peritoneum zu erhalten.
Klemmen und ziehen Sie dann den Xiphoid-Prozess mit einer Pinzette in Richtung Kopf und öffnen Sie das Operationsfeld mit subkostalen Retraktoren. Ziehen Sie mit einem feuchten Mulltupfer den Median und die linken Leberlappen nach oben zurück. Bewegen Sie dann den Darm außerhalb des Bauches auf die linke Seite der Maus und bedecken Sie ihn mit einem feuchten Mulltupfer.
Als nächstes führen Sie unter einer Lupenlampe für eine optimale Visualisierung eine Leberarterienligatur an der Arteria hepatica communis durch, die vom Pankreaskopf bis zu ihrer Wurzel im Leberstiel ausgeht. Legen Sie den linken Lappen frei, indem Sie den Mittellappen und den Rücken des linken Lappens mit einem feuchten Mulltupfer zurückziehen. Machen Sie dann mit einer sterilen Skalpellklinge einen etwa 2 Millimeter langen und tiefen Einschnitt in den linken Lappen und führen Sie sofort ein Tumorfragment mit einer sterilen Pinzette in den Leberschnitt ein.
Vergraben Sie den Tumor sicher in der Leber, bevor Sie eine Achternaht mit einer 6-0-Nylonnaht über der Inzisionsstelle anlegen, um eine ordnungsgemäße Tumorimplantation und Hämostase sicherzustellen. Schließen Sie dann den Bauchschnitt mit unterbrochenen 5-0-Nähten. Geben Sie ein Aliquot von 18-FMISO in ein Röhrchen und verdünnen Sie es mit steriler Kochsalzlösung, um eine Gesamtaktivitätskonzentration von 18 bis 20 Megabecquerel in 100 Mikrolitern zu gewährleisten.
Als nächstes ziehen Sie die Lösung mit einer 1-Milliliter-Spritze und notieren Sie die Radioaktivität und die Zeit, die auf dem Dosiskalibrator angezeigt werden. Nachdem Sie das Körpergewicht der Probandenmaus aufgezeichnet haben, injizieren Sie den vorbereiteten Radiotracer vorsichtig durch die Schwanzvene. Um die Karieskorrektur zu berücksichtigen, notieren Sie die Injektionszeit und die Restaktivität in der Spritze.
Um mit der PET-Erfassung zu beginnen, suchen Sie die Mausposition im Scanner, indem Sie eine Scout-Ansicht ausführen. Stellen Sie die Position des Mausbetts so ein, dass sich der gesamte Mauskörper mit der Rumpfregion in der Mitte des Sichtfelds des MR befindet. Wählen Sie als Nächstes im Fenster der Studienliste die Option PET-Akquisition aus. Um die vorgegebenen Mausbettpositionen aus der Scout-Ansicht zu verwenden, wählen Sie Scanbereich bei vorheriger Erfassung.
Klicken Sie dann auf Vorbereiten, um das Mausbett automatisch von MR nach PET zu verschieben, gefolgt von Gehe zu, um die Erfassung zu starten. Wählen Sie das entsprechende Radionukleotid im Radiopharma-Editor aus und geben Sie die Details der Injektionsdosis und -zeit ein. Geben Sie außerdem im Menü "Betreffinformationen" das Gewicht der Maus ein.
Sobald der PET-Scan abgeschlossen ist, wählen Sie Vorbereiten, um die Maus von PET in MR zu bewegen, und klicken Sie auf Gehe zu, um die MR-Erfassung durchzuführen. Sobald alle Scans abgeschlossen sind, verschieben Sie das Bildbett wieder in die Standardposition, indem Sie Tabelle ausstellen auswählen. Die in dieser Studie verwendete PET-Bildgebung zeigte einen Anstieg der Tumoraufnahme von 18-FMISO bei Mäusen mit Leberarterienligatur, jedoch nicht bei Kontrollmäusen.
Die Tumoraufnahme des glykolytischen Markers 18F-FDG war jedoch bei Mäusen mit und ohne Leberarterienligatur ähnlich. Die Quantifizierung mit diesem standardisierten Aufnahmewert-basierten Ansatz ergab eine 2,3-fach höhere 18-FMISO-Aufnahme von Tumoren bei Mäusen mit Leberarterienligatur als bei Kontrollmäusen. In ähnlicher Weise war die 18-FMISO-Aufnahme in den Lebern von Mäusen mit Leberarterienligatur höher als in den Lebern von Kontrollmäusen.
Die Ligatur der Leberarterien führte auch zu einer verstärkten Tumorhypoxie, was durch eine höhere Hypoxie-induzierbare Faktor-1-alpha-Expression in Tumorsekreten von Mäusen mit Leberarterienligatur als bei Kontrollmäusen belegt wurde. Nach der 18-FMISO-PET-Bildgebung kann unsere Sequenzierung durchgeführt werden, um die Rolle von metabolischen Genen zu identifizieren, die unter Hypoxie induziert werden, was zu neuen Behandlungsstrategien führt. Diese Technik kann verwendet werden, um die Tumorhypoxie genau zu überwachen, wodurch eine schnelle Bewertung der Behandlungswirksamkeit und auch die Entwicklung einer neuen therapeutischen Strategie ermöglicht wird, die auf den Hypoxie-Signalweg bei HCC abzielt.
