Strukturelle Informationen darüber, wie Basen-Exzisions-Reparaturenzyme DNA-Läsionen im Zusammenhang mit Chromatin entfernen, waren rar. Dies stellt eine erhebliche Lücke in unserem Verständnis der Mechanismen dar, die an der Ätiologie menschlicher Krankheiten beteiligt sind. Der Hauptvorteil unseres Protokolls besteht darin, dass wir die Probenvorbereitung mit Standard-Laborgeräten optimiert haben.
Dies wird es anderen Biochemikern auf diesem Gebiet ermöglichen, ihre biochemische Arbeit durch technisch machbare Kryo-EM-Studien zu ergänzen. Unser Protokoll kann auch verwendet werden, um zu untersuchen, wie andere Faktoren, einschließlich Pionier-Transkriptionsfaktoren, das Nukleosom beeinflussen. Dies ist ein Bereich, in dem auch die strukturellen Informationen begrenzt sind.
Die Optimierung der Probenvorbereitung vor dem Übergang zu den Gefrierbedingungen war der Schlüssel, um unser Projekt voranzubringen, und dies geschieht am besten mit biochemischen Standardassays unter Substratdesign-, Bindungs- und Vernetzungsbedingungen. Inkubieren Sie zunächst das NCP und den interessierenden DNA-Reparaturfaktor 15 Minuten lang auf Eis mit einem optimalen Puffer für den spezifischen Komplex. Fügen Sie dann Glutaraldehyd zu einer Endkonzentration von 0,005% hinzuNachdem es gut gemischt wurde, inkubieren Sie es 13 Minuten lang bei Raumtemperatur.
Abschrecken mit einem molaren Tris-CL bis zu einer Endkonzentration von 20 millimolar Tris-CL mit pH 7,5. Konzentrieren Sie sich dann auf etwa 50 Mikroliter und tauschen Sie den Puffer mit einer Entsalzungskolonne gegen Gefrierpuffer aus. Als nächstes bestimmen Sie die Absorptionen bei einer optischen Dichte von 280 und 260 Nanometern und konzentrieren Sie sich bei Bedarf weiter, um 1,3 bis 3 Milligramm pro Milliliter basierend auf einer optischen Dichte von 280 Nanometern zu erreichen.
Nachdem Sie den Dialyseknopf vorbereitet haben, legen Sie den Knopf mit der Probe mit der Membran nach unten auf ein Polyethylenglykolbett. Um die Reinigung durch Größenausschlusschromatographie durchzuführen, waschen und äquilibrieren Sie eine Größenausschlusssäule mit 60 Millilitern destilliertem Wasser, gefolgt von 80 Millilitern Gefrierpuffer über Nacht mit einer Geschwindigkeit von 0,4 Millilitern pro Minute. Analysieren Sie dann sofort die Peakfraktionen und konzentrieren Sie die Fraktionen, die das Infusionsprotein MBP-PolBeta-APE1 des Histons enthalten.
Elizabeth Viverette, eine Post-Baccalaureate-Auszubildende aus dem Kryo-EM-Kern hier in NIH, demonstriert die folgenden Verfahren. Nachdem Sie den Gefrierschrank eingeschaltet und den Luftbefeuchter mit 50 Millilitern destilliertem Wasser gefüllt haben, stellen Sie die Kammertemperatur auf 22 Grad Celsius und die Luftfeuchtigkeit auf 98% einDann stellen Sie den Ethanbecher und den Flüssigstickstoffbecher in die entsprechenden Raumhalter. Decken Sie anschließend den Ethanbecher mit dem Ethandeckelspender ab und gießen Sie vorsichtig flüssigen Stickstoff darüber, während Sie den Stickstoffbecher gleichzeitig mit flüssigem Stickstoff füllen.
Wenn sich der Flüssigstickstoffgehalt stabilisiert hat und 100% erreicht und die Temperatur minus 180 Grad Celsius erreicht, öffnen Sie vorsichtig das Ethanventil und füllen Sie den Ethanbecher, bis er eine Blase auf dem durchsichtigen Deckel bildet. Entfernen Sie dann den Ethanspender. Legen Sie zwei Filterpapiere auf das Löschgerät und sichern Sie sie mit einem Metallring.
Gehen Sie zum Setup und stellen Sie die Blotting-Parameter wie im Manuskript beschrieben ein, wählen Sie dann A-Plunge und klicken Sie auf OK. Klicken Sie auf dem Hauptbildschirm auf Pinzette laden und laden Sie sie mit einem Gitter mit der Carbon-Applikationsseite nach links. Kalibrieren Sie die Pinzette und stellen Sie die Z-Achse ein, um einen festen Fleck zu gewährleisten. Klicken Sie auf Untere Kammer und tragen Sie drei Mikroliter des Komplexes auf.
Klicken Sie dann auf Blot A-Plunge, wodurch das Gitter von vorne gedreht und eingefroren wird. Lagern Sie das Gitter nach dem Umfüllen in der Gitterbox in der Flüssigstickstoffkammer. Wenn alle vier Gitter eingefroren und in die Gitterbox gelegt wurden, drehen Sie den Deckel in die neutrale Position, in der alle Gitter vom Deckel bedeckt sind, und ziehen Sie die Schraube fest.
Bevor Sie die Proben in das Mikroskop laden, legen Sie die verglasten Gitter auf einen Ring und befestigen Sie ihn mit einem C-Clip unter flüssigem Stickstoff in einem feuchtigkeitskontrollierten Raum, um eine Eiskontamination zu vermeiden. Legen Sie beim Einlegen des Mikroskops die Gitter in eine Kassette mit 12 Steckplätzen ein. Mischen Sie die Kassette in eine Nanocab-Kapsel und laden Sie sie in den Autoloader.
Übertragen Sie dann das Gitter von der Kassette auf den Mikroskoptisch. Stellen Sie den Tisch auf euzentrische Höhe ein, indem Sie den Tisch um 10 Grad wackeln und gleichzeitig die Z-Höhe verschieben, bis eine minimale planare Verschiebung in den Bildern beobachtet wird. Sobald die euzentrische Höhe erreicht ist, beginnen Sie mit der Bildgebung, indem Sie ein 3-mal-3-Montagebild des Gitters aufnehmen, in dem jede Montage mit 62-facher Vergrößerung aufgenommen wird, um den Atlas zu erhalten.
Nachdem Sie drei Quadrate unterschiedlicher Größe ausgewählt und die euzentrische Höhe genommen haben, können Sie das Bild mit 210-facher Vergrößerung aufnehmen. Sobald ein Quadrat abgebildet ist, wählen Sie jeweils ein Loch von der Kante, in der Mitte und dazwischen innerhalb der Quadrate. Stellen Sie dann jedes Loch mit 2.600-facher Vergrößerung dar.
Nehmen Sie das Bild mit hoher Vergrößerung aus der Mitte des Lochs mit 36.000-facher Vergrößerung und einer Belichtungszeit von 7,1 Sekunden, 60 Bildern, einer Größe von 1,18 Pixel und einer Defokussierung von drei Mikrometern auf. Sehen Sie sich repräsentative Bilder des Screenings an. Um das Verhältnis von NCP zu MBP-PolBeta-APE1 zur Bildung eines stabilen Komplexes zu bestimmen, wurden elektrophoretische Mobilitätsverschiebungsassays durchgeführt, die eine einfach verschobene Bande des NCP mit einem fünffachen molaren Überschuss von MBP-PolBeta-APE1 zeigten.
In kleineren Volumina zeigte die Assemblierung des Komplexes von NCP-PolBeta-APE1, dass die Probe übermäßig vernetzt war und zu Aggregaten ohne erkennbare Einzelkomplexe führte. Die zehnfache Verdünnung der NCPs führte jedoch zu einer signifikant reduzierten Aggregation und einer verbesserten Partikelstabilität. Die präparativen Gel- und Größenausschlussmethoden können kombiniert werden, wenn das präparative Gel die Qualität der NCPs verbessert, wenn sie eine signifikante Menge an hochmolekularen Aggregaten enthalten, gefolgt von der Reinigung des Komplexes durch Größenausschluss.
Die Ergebnisse zeigen, dass beide Methoden unabhängig voneinander zur Erzeugung stabiler Komplexe eingesetzt werden können. Darüber hinaus zeigen die von beiden Gittern gesammelten Daten nahezu identische zweidimensionale Klassen und dreidimensionale Karten mit einer Auflösung von etwa 3,2 Angström. Zuerst sollte ein optimales Verhältnis von NCP zu DNA-Reparaturfaktor bestimmt werden, dann sollte die Vernetzung des Komplexes mit Glutaraldehyd mindestens 10-mal verdünnter durchgeführt werden als die zum Einfrieren erforderliche Konzentration.
Nach Erhalt einer Kryo-EM-3D-Karte des Komplexes ist eine weitere strukturelle Verfeinerung erforderlich, um zu bestimmen, wie der DNA-Reparaturfaktor gefunden wird, und um zu identifizieren, welche Regionen für diese Wechselwirkungen wichtig sind.
