Wenn wir das Altern und die Meereseleganen untersuchen, verfolgen wir in der Regel eine Population von Tieren im Laufe der Zeit. Dies gibt uns einen Einblick in das, was dieser Prozess, den Sie untersuchen, in der Population zu jedem Zeitpunkt bewirkt, aber es sagt Ihnen nicht, wie sich der Prozess bei einzelnen Tieren im Laufe der Zeit verändert. Diese Einzeltierkulturumgebungen ermöglichen es uns, dynamische Veränderungen in molekularen Prozessen und physiologischen Prozessen in einzelnen Tieren im Laufe der Zeit für Hunderte von Tieren parallel zu verfolgen.
Wir stellen fest, dass es zwei wichtige Dinge gibt, die sich wirklich auf die Qualität dieser Multi-Well-Kultursysteme auswirken können. Einer ist entweder die Über- oder Untertrocknung der Brunnen und der zweite ist die Kontamination. Und wir versuchen, während des gesamten Protokolls spezifische Schritte zu beachten, bei denen Sie versuchen können, diese Probleme zu entschärfen.
Das Protokoll wird heute von Emily Gardea demonstriert. Sie ist Technikerin in meinem Labor und hat viel Arbeit geleistet, um dieses Protokoll zu optimieren. Nachdem Sie alle Reagenzien vorbereitet haben, mischen Sie 60 Gramm PDMS-Basis und sechs Gramm Härter pro Form in einem großen Einwegboot mit einem Einwegspatel.
Legen Sie das PDMS-Gemisch für 30 Minuten bei minus 0,08 Mega Pascal in eine Vakuumkammer, um Blasen zu entfernen. Gießen und füllen Sie die PDMS-Mischung in jede 3D-gedruckte Form. Stellen Sie die gefüllte Form und die überschüssige PDMS-Mischung für 25 Minuten bei minus 0,08 Mega Pascal in die Vakuumkammer.
Nehmen Sie die gefüllte Form aus der Vakuumkammer und lassen Sie alle verbleibenden Blasen mit einem Einwegspatel platzen. Beginnen Sie mit einer Kante und senken Sie langsam eine flache Acrylplatte auf die mit PDMS gefüllte Form. Wenn es zu einer Blasenbildung kommt, gehen Sie wie im Manuskript beschrieben vor.
Legen Sie ein Gewicht von 2,5 Pfund auf das Acryl und stellen Sie die beschwerten Formen in den Ofen. Lassen Sie sie bei 55 Grad Celsius über Nacht aushärten. Am Ende der Inkubation die Gewichte und die Formen aus dem Ofen nehmen.
Als nächstes arbeiten Sie mit einer Rasierklinge zwischen dem Acryl und dem ausgehärteten PDMS Um das Siegel zu brechen, lösen Sie mit einem Rasierer oder einem Metallspatel vorsichtig die Seiten des ausgehärteten PDMS und nehmen Sie sie aus der Form. Wickeln Sie das PDMS-Gerät in Alufolie ein. Versiegeln Sie es mit Autoklavenband und sterilisieren Sie es durch Autoklavieren in einem Trockenzyklus für mindestens 15 Minuten bei 121 Grad Celsius und einem Überdruck von 15 Pfund pro Quadratzoll.
Um das Multiwell-Gerät vorzubereiten, heizen Sie einen trockenen Perlenbad-Inkubator auf 90 Grad Celsius vor. Packen Sie ein autoklaviertes Multiwell-Gerät aus und schneiden Sie eine kleine Kerbe in die obere rechte Ecke des Geräts. Legen Sie bis zu drei unverpackte Geräte mit den Vertiefungen nach oben in den Plasmareiniger und lassen Sie den Plasmareiniger laufen.
Sterilisieren Sie eine einzelne Styroporschale pro Gerät, indem Sie die Innenseite der Schale mit 70%igem Ethanol besprühen und mit einem Arbeitstuch trocken wischen. Nehmen Sie jedes Gerät mit einer behandschuhten Hand aus dem Plasmareiniger und legen Sie es in eine gereinigte Schale. Stellen Sie dann ein 25-Milliliter-Einweg-Pipettenbecken in den auf 90 Grad Celsius vorgeheizten Perlenbad-Inkubator.
Nehmen Sie pro zu befüllendem Gerät ein Röhrchen mit erstarrter LMNGM-Vormischung und geben Sie es in ein 200-Milliliter-Glasbecherglas. Entfernen Sie die Kappe und den Parafilm und stellen Sie sie in die Mikrowelle, bis das Medium zum Gießen ausreichend geschmolzen ist. Gießen Sie die geschmolzene LMNGM-Vormischung in ein weiteres steriles 200-Milliliter-Becherglas.
In diesem Becherglas können mehrere Reagenzgläser kombiniert werden, wenn mehr als ein Gerät gleichzeitig befüllt wird. Erhitzen Sie die LMNGM-Vormischung weitere 20 Sekunden in der Mikrowelle. Wenn die Vormischung zu kochen beginnt, stoppen Sie die Mikrowelle und lassen Sie sie sich absetzen.
Die geschmolzene LMNGM-Vormischung aus der Mikrowelle nehmen und auf 60 Grad Celsius abkühlen lassen. Die restlichen LMNGM-Zutaten in die Vormischung geben und das geschmolzene LMNGM in das 25-Milliliter-Becken im Perlenbad gießen. Füllen Sie die Gerätevertiefungen mit einer 200-Mikroliter-Mehrkanal-Repeater-Pipette.
Stellen Sie den Repeater so ein, dass er Aliquots von 14 Mikrolitern dosiert, und montieren Sie fünf Pipettenspitzen. Befüllen Sie die Spitzen mit geschmolzenem LMNGM und geben Sie die ersten 14 Mikroliter zurück in das LMNGM-haltige Becken. Geben Sie schnell, aber vorsichtig 14 Mikroliter in die inneren Vertiefungen des Geräts und geben Sie das verbleibende LMNGM zurück in das Becken, da das endgültige Aliquot in der Regel weniger als 14 Mikroliter beträgt.
Stellen Sie als Nächstes den Repeater so ein, dass er Aliquots von 15 Mikrolitern abgibt und den äußersten Ring der Vertiefungen füllt. Geben Sie mit einer 200-Mikroliter-Pipette 200 Mikroliter Kupfersulfatlösung in den Gerätegraben in jeder Ecke. Vermeiden Sie eine Überfüllung des Grabens und stellen Sie sicher, dass das Kupfersulfat die Oberfläche der Vertiefungen nicht berührt.
Wenn das Kupfersulfat nicht leicht durch den gesamten Graben fließt, verwenden Sie einen kurzen Platindrahtpickel, um die Spannung zu brechen und das Kupfersulfat durch den Graben zu ziehen. Nachdem das Kupfersulfat durch den gesamten Graben geflossen ist, entfernen Sie so viel Kupfersulfat wie möglich mit einer 200-Mikroliter-Pipette oder einer Aspiration mit Vakuum. Geben Sie die Wasserkristalle mit einer Quetschflasche in die Zwischenräume zwischen dem Gerät und den Wänden des Tabletts.
Schließen Sie den Schalendeckel und wickeln Sie alle vier Seiten mit einem Stück Parafilm ein. Fügen Sie zwei zusätzliche Parafilm-Stücke hinzu, um die Platte vollständig zu versiegeln. Lokalisieren Sie jede Vertiefung mit einer Repetierpipette mit fünf Mikrolitern konzentrierter Bakterien.
Vermeiden Sie den direkten Kontakt mit der LMNGM-Oberfläche. Trocknen Sie die Geräte mit einer speziell angefertigten Trockenbox, die mit Computergehäuselüftern und HEPA-Filtern kostengünstig aufgebaut werden kann. Inspizieren Sie die Vertiefungen unter einem Sezierbereich, um sicherzustellen, dass alle Vertiefungen erfolgreich getrocknet sind.
Mit einem Platin-Plektrum die Tiere von den vorbereiteten Wurmplatten überführen und einen Wurm pro Vertiefung hinzufügen. Geben Sie einen Tropfen der vorbereiteten Waschmittellösung auf die Innenseite des Schalendeckels und reiben Sie sie mit einem Arbeitstuch ein, bis die Waschmittellösung getrocknet ist. Wickeln Sie das Tablett mit drei Stücken Parafilm ein, wie im Manuskript beschrieben.
Die Verlängerung der Lebensdauer von daf-2(RNAi) wird durch die daf-16 Nullmutation blockiert. Die Gesundheitsspanne verringerte sich auch in Gegenwart von daf-2(RNAi)Der rollierende Drei-Tage-Mittelwert der Aktivität über die Lebensspanne wird durch daf-16-Mutante und daf-2(RNAi) reduziert.Die Variation der Lebens- und Gesundheitsspanne zwischen einzelnen Tieren wird entweder in absoluten Zahlen oder als Bruchteil der gesamten Lebensspanne gezeigt. Die kumulative Aktivität über die Lebensspanne einzelner Tiere korreliert besser mit der Lebensspanne als die Aktivität einzelner Tiere an einem bestimmten Tag über die gesamte Lebensspanne.
Es ist wichtig, die Vertiefungen zu füllen und die Würmer so schnell wie möglich hinzuzufügen. Sonst können die Brunnen austrocknen und die Würmer überleben nicht. Dieses System ist kompatibel mit automatisierter Bildgebung, mit der Hochdurchsatzdaten wie Lebensdauer, Aktivität und Körpergröße oder -form erfasst werden können.
