Dieses Protokoll beschreibt zwei Lipidsupplementierungsstrategien mit einer Kombination aus longitudinaler und transkriptioneller Analyse im Modellorganismus C.elegans. Die Technik beschreibt, wie transkriptionelle Veränderungen mit wenigen Würmern oder seziertem Wurmgewebe untersucht werden können und wie die flüssige Fütterung für eine Insektenpopulation mit Hydrotechniken gekoppelt werden könnte. Personen, die diese Technik durchführen, müssen die Gewebedissektion aufgrund des kurzen Zeitfensters für die Durchführung des Experiments üben, um eine angemessene Transkriptionsanalyse zu erreichen.
Sammeln Sie zunächst OP50-Bakterien, indem Sie die über Nacht gewachsene Kultur bei 4.000 G für 10 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren. Verwerfen Sie den Überstand. Suspendieren Sie das Bakterienpellet in 20 Milliliter Bakterienverdünnung, diätetischer Einschränkung oder BDR-Base durch Wirbeln und wiederholen Sie die Zentrifugation erneut für 10 Minuten.
Nach dem Verwerfen des Überstands das Bakterienpellet im BDR-Medium erneut suspendieren, um einen 20 X BDR-Bakterienbestand herzustellen. Verdünnen Sie die Bakterienbrühe vor Gebrauch mit einem BDR-Medium auf 5X. Verwenden Sie Ethanol oder Dimethylsulfoxid als Lösungsmittel, bereiten Sie eine Lipid-Stammlösung in einer neuen autoklavierten Glasdurchstechflasche vor und füllen Sie die Glasdurchstechflasche mit Argon oder Stickstoff, um eine Oxidation zu verhindern.
Übertragen Sie die Lipidstammlösung in die BDR-Bakterienlösung, um die gewünschte Endkonzentration unter Fütterungsbedingungen zu erreichen. Mischen Sie es gründlich, indem Sie 20 Sekunden lang wirbeln. Bereiten Sie das Fahrzeug kontrolliert vor, indem Sie die gleichen Mengen gefilterten Ethanols oder Dimethylsulfoxids mit BDR-Bakterien mischen.
Führen Sie eine Lipidergänzung und Flüssigkeitskultur durch, indem Sie die gewünschte Menge an Lipid oder Vehikelkontrolle auf jede Vertiefung einer 12-Well-Platte mit drei bis vier Replikaten für jede Fütterungsbedingung übertragen. Mischen Sie die synchronisierte Caenorrhabditis elegans-Wurmsuspension mit 5X BDR-Bakterien in einem Eins-zu-Eins-Verhältnis, um eine Endkonzentration von 1.500 Würmern pro Milliliter und 2,5X für Bakterien zu erreichen. Dann werden zwei Milliliter der Wurmbakterienmischung in jede Vertiefung der 12-Well-Platte überführt.
Wenn Sie fertig sind, wickeln Sie die 12-Well-Platte mit Folie ein und schütteln Sie die Platte in einem 20-Grad-Celsius-Inkubator bei 100 U/min für die gewünschte Inkubationslänge. Für die Lipidergänzung auf Platten säen Sie einen Milliliter der lipidkonditionierten Bakterien auf die Mitte eines 10 Zentimeter großen Nematoden-Wachstumsmediums oder einer NGM-Agarplatte. Stellen Sie sicher, dass die endgültige Arbeitslösung mehrmals zwischen der Aussaat der beiden Platten gewirbelt wird, wenn Sie mit einer hohen Anzahl von Platten arbeiten.
Trocknen Sie die Platte im Dunkeln in einer Biosicherheitshaube. 3000 Würmer aus der synchronisierten Wurmkultur auf die 10 Zentimeter große Platte übertragen. Trocknen Sie die Platte in einer Biosicherheitshaube, bis Würmer, die auf den lipidergänzten Platten schwimmen, anfangen zu kriechen.
Nach dem Trocknen inkubieren Sie die lipidkonditionierte Platte in einem 20-Grad-Celsius-Inkubator für die gewünschte Zeit und schützen Sie die Platte bei Verwendung mehrfach ungesättigter Lipide vor Licht. Bereiten Sie 20 Mikroliter endgültige Lyselösung für jede Probe vor, indem Sie 0,2 Mikroliter DNase I mit 19,8 Mikrolitern Lyselösung in einem PCR-Röhrchen mischen und es gut mischen, indem Sie fünfmal auf und ab pipettieren. Um die RNA aus der kleinen Anzahl ganzer Würmer zu extrahieren, entfernen Sie die Bakterien, indem Sie 15 bis 20 Würmer vom Bakterienrasen auf eine frisch ungesäte NGM-Platte übertragen.
15 bis 20 Würmer von der ungesäten NGM-Platte in das PCR-Röhrchen mit 20 Mikrolitern der frisch zubereiteten endgültigen Lyselösung mit der minimalen Anzahl von Bakterien überführen und die Lysereaktion fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Sobald die Inkubation beendet ist, halten Sie die Probe in einem schönen kalten Wasserbad und sondieren Sie die Würmer viermal, jeweils fünf Sekunden mit 30% Amplitude und Puls für 15 Sekunden zwischen jedem Zeitpunkt der Beschallung. Das Röhrchen bei Raumtemperatur fünf Minuten lang inkubieren, bevor zwei Mikroliter Stopplösung in die Lysereaktion gegeben und durch vorsichtiges Klopfen gemischt werden.
Die Reaktion zwei Minuten bei Raumtemperatur inkubieren und dann das Röhrchen auf Eis legen. Um RNA aus dem Wurmgewebe zu extrahieren, pflücken Sie etwa 20 Würmer aus dem Bakterienrasen und legen Sie sie in eine frische, ungesäte NGM-Platte, um die Bakterien aus den Würmern zu entfernen. 20 Würmer mit möglichst wenigen Bakterien in ein Uhrenglas mit 500 Mikrolitern M9-Lösung mit vier mikromolaren Levamisolen überführen.
Wenn die Würmer immobilisiert sind, sezieren Sie die Keimbahn oder den Darm mit einer 25-Gauge-Nadel, die an der Ein-Milliliter-Spritze befestigt werden kann. Übertragen Sie das präparierte Gewebe mit einer autoklavierten Glaspipette in das PCR-Röhrchen und legen Sie das Röhrchen zwei Minuten lang auf Eis ab, damit das Material am Boden abgelagert werden kann. Entfernen Sie den Überstand aus dem PCR-Röhrchen, bevor Sie 20 Mikroliter endgültige Lyselösung hinzufügen, und mischen Sie ihn gut durch Anklopfen.
Nach fünfminütiger Inkubation der Lysereaktion fügen Sie zwei Mikroliter Stopplösung hinzu und klopfen mehrmals auf das Röhrchen. Inkubieren Sie das Röhrchen für zwei Minuten, bevor Sie mit der umgekehrten Transkription fortfahren. In der Validierungsstudie zeigte RNA, die aus einer großen Population und einigen Würmern extrahiert wurde, eine ähnliche Induktion der Neuropeptid-verarbeitenden Gene egl-3 und egl-21.
Es deutet darauf hin, dass die RNA-Extraktion aus einigen wenigen Würmern eine gültige Alternative zu Standard-CDNA-Synthesetechniken aus großen Populationen sein kann. Im sezierten Darm der Lipl-4-Transgenwürmer, ergänzt mit Dihomo-Gamma-Linolensäure oder DGLA, wurden die neuronalen Neuropeptid-verarbeitenden Gene nicht induziert. DGLA-Supplementierung in verschiedenen Konzentrationen rettete die Verlängerung der Lebensdauer in den Würmern nach Fett-3-Knockdown.
Würmer mit Lipidsupplementierung können auch für RNA-Sequenzierung, Proteomik, Metabolomik und Verhaltensstudien verarbeitet werden, um zusätzliche Phänotypen unter diesen spezifischen Bedingungen zu identifizieren. Diese Methodik kann auf die Alternsforschung, die Lipidbiologie und jedes andere Forschungsgebiet angewendet werden, das darauf abzielt, eine Beziehung zwischen einem bestimmten Phänotyp und einem Ernährungsfaktor oder Metaboliten herzustellen.
